巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶及其制法與該固定化酶合成1，3-丙二醇的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶及其制法和利用固定化酶合成1，3-丙二醇的方法及專(zhuān)用設(shè)備。所述固定化酶包括多酶和固定該多酶的巰基改性二氧化鈦納米纖維載體。所述固定化酶的制法包括用靜電紡絲制備二氧化鈦納米纖維；在該纖維中加巰烴基硅烷偶聯(lián)劑溶液；再加戊二醛溶液和多酶即可。利用所述固定化酶合成1，3-丙二醇的方法是將固定化酶與惰性填料混合，通入底物反應(yīng)液并控制反應(yīng)液的pH、流速和反應(yīng)溫度，充分反應(yīng)即可。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該固定化酶載體孔隙率高、比表面積大、巰基與酶親合力強(qiáng)，提高酶的負(fù)載量、催化活性與穩(wěn)定性；在合成1，3-丙二醇中酶使用效率高，反應(yīng)充分，同時(shí)該專(zhuān)用設(shè)備設(shè)計(jì)合理且易于制造。
【專(zhuān)利說(shuō)明】巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶及其制法與該固定化酶合成1，3-丙二醇的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種納米纖維固定化酶及其制備方法和該固定化酶的應(yīng)用，尤其涉及巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶及其制備方法和利用該固定化酶合成1，3_丙二醇的方法及專(zhuān)用設(shè)備。
【背景技術(shù)】 [0002]隨著酶固定化技術(shù)的不斷深入，固定用載體也隨之推陳出新，不再局限于用傳統(tǒng)的無(wú)機(jī)材料(高嶺土、硅藻土、氧化鋁、硅膠等)或者多糖類(lèi)材料(殼聚糖類(lèi)、纖維素類(lèi)、葡聚糖類(lèi))為載體，而趨向于選擇提高固定化酶性能的新型功能性材料為載體，比如納米材料、磁性材料、離子液體、環(huán)境pH敏感載體等。
[0003]納米材料的種類(lèi)很多，有納米粒子、納米介孔材料、納米纖維和納米管。其中電紡纖維由于具有較大的比表面積和較小的底物擴(kuò)散阻力等優(yōu)勢(shì)，快速發(fā)展成為固定化酶的優(yōu)異載體材料。電紡納米纖維尺寸一般在80nm到1.50 μ m之間，與尺度較小的納米顆粒固定化酶所催化的液相催化過(guò)程相比，納米纖維固定化酶解決了液相反應(yīng)過(guò)程擴(kuò)散阻力較大、難于回收等不足，再加上納米纖維的高比表面積帶來(lái)的高酶負(fù)載，突出了它在固定化酶載體材料應(yīng)用中的潛能。同時(shí)，靜電紡絲技術(shù)作為簡(jiǎn)便可控合成二氧化鈦納米纖維的一種新型手段，通過(guò)調(diào)節(jié)靜電紡絲技術(shù)參數(shù)和紡絲溶液組成成分，容易實(shí)現(xiàn)對(duì)納米纖維的直徑、組成、形貌等進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，獲得長(zhǎng)徑比大、比表面積高、高孔隙率、分等級(jí)的納米結(jié)構(gòu)，如C、ZnO> SiQ^ Fe203、TiO2> WO3> Al2O3等靜二氧化鈦納米纖維，該納米纖維可以更好地應(yīng)用到酶分子固定和納米酶反應(yīng)器制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的第一目的是提供一種負(fù)載量大、穩(wěn)定性高的巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶；
[0005]本發(fā)明的第二目的是提供上述巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶的制備方法;
[0006]本發(fā)明的第三目的是利用上述巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶合成1，3-丙二醇的方法；
[0007]本發(fā)明的第四目的是提供上述巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶合成1，3_丙二醇中的專(zhuān)用設(shè)備。
[0008]技術(shù)方案:本發(fā)明所述的巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶，包括多酶和用于固定該多酶的巰基改性二氧化鈦納米纖維載體；所述巰基改性二氧化鈦納米纖維載體是將二氧化鈦納米纖維分散于乙醇中，在超聲條件下加入巰烴基硅烷偶聯(lián)劑溶液，攪拌，洗滌，所獲得巰基改性的二氧化鈦納米纖維。
[0009]其中，所述多酶為基因工程大腸桿菌多酶、克雷伯桿菌的多酶或者木瓜蛋白酶與胰蛋白酶的混合溶液。
[0010]本發(fā)明所述的巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶的制備方法，包括如下步驟:
[0011](I)用靜電紡絲制備二氧化鈦納米纖維；
[0012](2)將二氧化鈦納米纖維分散于乙醇中，在超聲條件下加入巰烴基硅烷偶聯(lián)劑溶液，攪拌，洗滌，獲得巰基改性的二氧化鈦納米纖維；
[0013](3)向巰基改性的二氧化鈦納米纖維中依次加入戊二醛溶液和多酶溶液，振蕩，抽濾，得到巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶。
[0014]其中，步驟(2)中，加入的巰烴基硅烷偶聯(lián)劑溶液濃度為10~30g/L，二氧化鈦納米纖維與巰烴基硅烷偶聯(lián)劑重量比為0.5~3.0:1，室溫?cái)嚢钑r(shí)間為20~30小時(shí)。 [0015]步驟(3)中，加入的戊二醛濃度為2~10g/L，多酶溶液濃度為10~50mg/mL，巰基改性二氧化鈦納米纖維與多酶和戊二醛重量比為2~10:1:0.2~1.0，振蕩時(shí)間為2~5小時(shí)，且得到的巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶于2~5°C貯存在密封袋中。
[0016]步驟(1)中，用靜電紡絲制備二氧化鈦納米纖維具體為在10_18kV的靜電壓下，將電紡溶液以0.2~0.6ml.h-1流速紡絲，燒結(jié)、去除高分子模板，即得二氧化鈦納米纖維；其中，所述燒結(jié)溫度為500~650°C，燒結(jié)時(shí)間為3~6小時(shí)，所述電紡溶液由用量比為10~12mL:3~5mL:3~5mL:500~550mg的乙二醇、鈦酸異丙酯、草酸和聚乙酸乙烯酯組成。
[0017]本發(fā)明所述的利用巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶合成1，3_丙二醇中的方法，向巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶中通入底物反應(yīng)液并控制反應(yīng)液的pH、流速和反應(yīng)溫度，充分反應(yīng)即可得到1，3-丙二醇。
[0018]其中，可以先將巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶與惰性填料混合，再向其中通底物反應(yīng)液；所述惰性填料為活性炭、石英砂、空心玻璃珠、硅膠?；蜓趸X瓷球；控制所述底物反應(yīng)液pH為8~9，流速為0.2~0.6mL.mirT1，反應(yīng)溫度為25°C~42°C。
[0019]反應(yīng)機(jī)理=TiO2 二氧化鈦納米纖維作為載體，其孔隙率高、比表面積大、可以減少酶分子在纖維上的擴(kuò)散阻力；在纖維表面組裝巰基，獲得裸露在纖維表面的功能團(tuán)，由于巰基帶電，通過(guò)靜電作用和共價(jià)作用，巰基與酶分子親合力好，吸附大量酶分子并將其牢牢固定在纖維上。正是由于納米纖維的高比表面積帶來(lái)的高酶負(fù)載量和巰基改性增強(qiáng)的高穩(wěn)定性相結(jié)合的固定化體系，將底物甘油轉(zhuǎn)化生成1，3_丙二醇。
[0020]本發(fā)明所述的巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶合成1，3_丙二醇中的專(zhuān)用設(shè)備，包括納米多酶反應(yīng)器，該反應(yīng)器包括上下端開(kāi)口的殼體，殼體兩端口內(nèi)側(cè)各設(shè)過(guò)濾網(wǎng)，殼體內(nèi)壁上設(shè)有保溫層；其中，所述納米多酶反應(yīng)器是用作巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶催化底物反應(yīng)液生成1，3_丙二醇的反應(yīng)器。
[0021]其中，該專(zhuān)用設(shè)備還包括底物反應(yīng)裝置和檢測(cè)裝置，其中，底物反應(yīng)裝置通過(guò)進(jìn)液管與反應(yīng)器下端連通，并在進(jìn)液管上安裝微量化學(xué)泵和閥門(mén)；反應(yīng)器上下端與檢測(cè)裝置進(jìn)出口相互連通，形成循環(huán)管路，從檢測(cè)裝置下端出口的管路上延伸一道支路，該支路與管路的交叉處安裝三通閥，并在支路上設(shè)產(chǎn)物收集裝置，同時(shí)，該三通閥與檢測(cè)裝置之間安裝流量控制閥。
[0022]工作原理:預(yù)先在納米多酶反應(yīng)器中裝入巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶和惰性填料，開(kāi)啟微量化學(xué)泵，底物反應(yīng)液從反應(yīng)器下端進(jìn)入，充分反應(yīng)后產(chǎn)物從反應(yīng)器上端出料，進(jìn)入檢測(cè)裝置，調(diào)整流量控制閥和三通閥，檢測(cè)合格的產(chǎn)物沿支路進(jìn)入產(chǎn)物收集裝置，不合格的產(chǎn)物重新進(jìn)入反應(yīng)器反應(yīng)。
[0023]有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)為:1、本發(fā)明提供的巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶，以TiO2納米纖維作為載體，通過(guò)在其表面組裝巰基獲得裸露在TiO2納米纖維表面的巰基功能團(tuán)；采用巰基改性的TiO2電紡納米纖維作為固定化酶的載體，其一能夠利用納米纖維高孔隙率、大比表面積的特性，其二巰基通過(guò)靜電作用、共價(jià)作用與酶分子結(jié)合，與酶親合力高、使酶分子固定，因此能夠有效改善固定化酶?jìng)髻|(zhì)阻力大、酶分子易脫落等缺點(diǎn)，顯著提高固定化酶的負(fù)載量、催化活性與穩(wěn)定性。2、在納米多酶反應(yīng)器中巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶催化合成1，3-丙二醇，該反應(yīng)器能夠充分發(fā)揮納米纖維孔隙高率的特點(diǎn)，減小底物擴(kuò)散阻力，酶在載體上的負(fù)載量大、附著力強(qiáng)，酶的使用效率提高，成本降低，為催化反應(yīng)提供了有利條件，便于反應(yīng)的充分進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)重要生物基化學(xué)品1，3-丙二醇的高效、連續(xù)生產(chǎn)；同時(shí)，該專(zhuān)用設(shè)備結(jié)構(gòu)緊湊、設(shè)計(jì)合理且易于制造，不僅可以有效控制反應(yīng)條件，檢測(cè)反應(yīng)狀況，還能通過(guò)循環(huán)使反應(yīng)充分進(jìn)行。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為利用本發(fā)明巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶合成1，3_丙二醇中的專(zhuān)用設(shè)備的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]一、本發(fā)明所述的巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶，包括多酶和用于固定該多酶的巰基改性二氧化鈦納米纖維載體；其中，該載體是將二氧化鈦納米纖維分散于乙醇中，在超聲條件下加入巰烴基硅烷偶聯(lián)劑溶液，攪拌，洗滌，所獲得巰基改性的二氧化鈦納米纖維；該多酶為基因工程大腸桿菌多酶、克雷伯桿菌的多酶或者木瓜蛋白酶與胰蛋白酶的混合溶液等屬于本領(lǐng)域常用的蛋白酶。
[0026]二、本發(fā)明所述 巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶的制備方法，包括以下步驟:
[0027]實(shí)施例1
[0028](I)采用靜電紡絲方法制備1102納米纖維:電紡溶液由3mL鈦酸異丙酯、3mL草酸、0.5g聚乙酸乙烯酯(PVAc)、IOmL乙二醇組成，在IOkV的靜電壓下，采用注射泵精確控制電紡溶液以0.2ml.r1流速紡絲，紡絲靜置24小時(shí)，在500°C燒結(jié)3小時(shí)，去除高分子模板，即得TiO2納米纖維；
[0029](2)將IOmgTiO2納米纖維分散于18mL乙醇中，在超聲條件下加入2mL的濃度為10g/L巰烴基硅烷偶聯(lián)劑溶液(以任何溶劑配制得到的該溶液均可以使用)，使得二氧化鈦納米纖維與巰烴基硅烷偶聯(lián)劑重量比為0.5:1，室溫?cái)嚢?0小時(shí)，過(guò)濾、水洗，即得巰基改性的TiO2納米纖維；
[0030](3)向巰基改性的20mg TiO2納米纖維中加入IOmL Tris-HCl緩沖溶液，在超聲條件下，先后加入ImL濃度為2g/L的戊二醛水溶液和ImL濃度為10mg/mL的多酶水溶液，搖床振蕩2小時(shí)，減壓抽濾，真空干燥，即得巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶。
[0031]所述多酶溶液為等量的木瓜蛋白酶與胰蛋白酶共溶于Tris-HCl緩沖液。
[0032]經(jīng)檢測(cè)，酶負(fù)載率為58%，負(fù)載量290mg.g'[0033]酶蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法測(cè)定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。分光光度計(jì)檢測(cè)負(fù)載前后溶液中的蛋白含量Ctl, Ct，計(jì)算出固定在載體巰基改性TiO2納米纖維上的酶蛋白量，得到酶蛋白的負(fù)載率和負(fù)載量mg.g—1。
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶，其特征在于:包括多酶和用于固定該多酶的巰基改性二氧化鈦納米纖維載體；所述巰基改性二氧化鈦納米纖維載體是將二氧化鈦納米纖維分散于乙醇中，在超聲條件下加入巰烴基硅烷偶聯(lián)劑溶液，攪拌，洗滌，所獲得巰基改性的二氧化鈦納米纖維。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶，其特征在于:所述多酶為基因工程大腸桿菌多酶、克雷伯桿菌多酶或者木瓜蛋白酶與胰蛋白酶的混合溶液。
3.一種制備權(quán)利要求1所述巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)用靜電紡絲制備二氧化鈦納米纖維； (2)將二氧化鈦納米纖維分散于乙醇中，在超聲條件下加入巰烴基硅烷偶聯(lián)劑溶液，攪拌，洗滌，獲得巰基改性的二氧化鈦納米纖維； (3)向巰基改性的二氧化鈦納米纖維中依次加入戊二醛溶液和多酶溶液，振蕩，抽濾，得到巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶的方法，其特征在于:步驟(2)中，加入的巰烴基硅烷偶聯(lián)劑溶液濃度為10~30g/L，二氧化鈦納米纖維與巰烴基硅烷偶聯(lián)劑重量比為0.5~3.0:1，室溫?cái)嚢钑r(shí)間為20~30小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶的方法，其特征在于:步驟(3)中，加入的戊二醛溶液濃度為2~10g/L，多酶溶液濃度為10~50mg/mL，巰基改性二氧化鈦納米纖維與多酶和戊二醛重量比為2~10:1:0.2~1.0，振蕩時(shí)間為2~5小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶的方法，其特征在于:步驟(1)的具體制備方法為在10-18kV的靜電壓下，將電紡溶液以0.2~0.6ml.IT1流速紡絲，燒結(jié)、去除高分子模板，即得二氧化鈦納米纖維；其中，所述燒結(jié)溫度為500~650°C，燒結(jié)時(shí)間為3~6小時(shí)，所述電紡溶液由用量比為10~12mL:3~5mL:3~5mL:500~550mg的乙二醇、鈦酸異丙酯、草酸和聚乙酸乙烯酯組成。
7.一種利用權(quán)利要求1所述巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶合成1，3-丙二醇中的方法，其特征在于:向巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶中通入底物反應(yīng)液并控制反應(yīng)液的pH、流速和反應(yīng)溫度，充分反應(yīng)即可得到1，3-丙二醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶合成1，3_丙二醇中的方法，其特征在于:先將巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶與惰性填料混合，再向其中通底物反應(yīng)液；所述惰性填料為活性炭、石英砂、空心玻璃珠、硅膠?；蜓趸X瓷球中；控制所述底物反應(yīng)液pH為8~9，流速為0.2~0.6mL.mirT1，反應(yīng)溫度為25°C~42°C。
9.一種利用巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶合成1，3_丙二醇中的專(zhuān)用設(shè)備，其特征在于:包括納米多酶反應(yīng)器(I )，該反應(yīng)器包括上下端開(kāi)口的殼體(11 )，殼體(11)兩端口內(nèi)側(cè)各設(shè)過(guò)濾網(wǎng)(12)，殼體(11)內(nèi)壁上設(shè)有保溫層(13);其中，所述納米多酶反應(yīng)器(I)是用作巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶催化底物反應(yīng)液生成1，3-丙二醇的反應(yīng)器。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述利用巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶合成1，3_丙二醇中的專(zhuān)用設(shè)備，其特征在于:還包括底物反應(yīng)裝置(2)和檢測(cè)裝置(3)，其中，底物反應(yīng)裝置(2 )通過(guò)進(jìn)液管(6 )與反應(yīng)器下端連通，并在進(jìn)液管上安裝微量化學(xué)泵(4 )和閥門(mén)；反應(yīng)器上下端與檢測(cè)裝置(3)進(jìn)出口相互連通，形成循環(huán)管路，從檢測(cè)裝置(3)下端出口的管路上延伸一道支路，該支路與管路的交叉處安裝三通閥(8)，并在支路上設(shè)產(chǎn)物收集裝置(9)，同時(shí)，該三通閥(8 )與檢測(cè)裝置(3 )之間安裝流量控制閥(5 )。
【文檔編號(hào)】C12M1/40GK103602655SQ201310495368
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】吳敏, 孟俊麗, 丁穩(wěn), 代云茜, 馬全紅, 倪恨美 申請(qǐng)人:東南大學(xué)