堿性果膠酶基因工程菌及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及堿性果膠酶基因工程菌及其構(gòu)建方法，工程菌的保藏編號CCTCC?NO:?M2013393，而堿性果膠酶基因能夠在本發(fā)明的堿性果膠酶基因工程菌中進(jìn)行活性表達(dá)，優(yōu)化后胞內(nèi)酶活為89.5U／mL，胞外酶活為2.5U／mL。
【專利說明】堿性果膠酶基因工程菌及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及堿性果膠酶基因工程菌及其構(gòu)建和分析。
【背景技術(shù)】
[0002]果膠酶(pectinase)是一類分解果膠質(zhì)的酶的總稱，是含有多種組分的復(fù)合酶。果膠酶廣泛分布于高等植物和微生物中，但從植物中提取受到資源、技術(shù)水平的諸多限制而一直未能真正實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，因此微生物來源的果膠酶成為研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外對酸性果膠酶的研究已經(jīng)具有一定基礎(chǔ)，但是對堿性果膠酶尤其是果膠裂解酶(pectate lyase)的研究報(bào)道較少。
[0003]堿性果膠酶是指最適作用pH在堿性范圍內(nèi)的果膠酶，是果膠酶研究領(lǐng)域中的新興內(nèi)容，主要應(yīng)用于紡織工業(yè)中用作對環(huán)境友好的生物催化劑，用柔和的酶生物精練代替?zhèn)鹘y(tǒng)的堿高溫蒸煮技術(shù)，實(shí)現(xiàn)綠色清潔生產(chǎn)，既可減少堿排放污染，又可降低加熱能耗和漂洗用水量，同時提高紡織物的加工和使用性能。因而隨著生物技術(shù)的不斷快速發(fā)展，堿性果膠酶在紡織工業(yè)中的應(yīng)用潛力也越來越受到大家的關(guān)注。
[0004]從1972年Horikoshi，K.發(fā)表第一篇關(guān)于芽孢桿菌生產(chǎn)堿性果膠酶的論文開始，日本等國開始致力于堿性果膠酶的研究。印度Mukesh Kapoor于2001年報(bào)道了 Bacillussp.MG-cp-2堿性聚半乳糖醛酸酶的生產(chǎn)、純化和酶學(xué)性質(zhì)，確定該菌株發(fā)酵活力為47u /mL，培養(yǎng)基優(yōu)化后活力提升為98u / mL，室溫時在pH7.0~12.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，可有效應(yīng)用于芒麻和菽麻纖維脫膠；德國學(xué)者2004年測定了果膠酶菌種Bacillus IicheniformisDSM13的基因組序列。美國、荷蘭、英國、西班牙等國的學(xué)者也分別對堿性果膠酶的菌種資源、發(fā)酵、純化方法、酶學(xué)性質(zhì)、分泌調(diào)控及分子生物學(xué)等內(nèi)容進(jìn)行了報(bào)道，研究對象除了上述芽孢桿菌之外，還包括一些植物病原菌，如菊歐文氏菌、洋蔥伯克霍爾德菌等。
[0005]為了獲得高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)的堿性`果膠酶產(chǎn)品，自1990年以來，國外學(xué)者把研究重點(diǎn)從篩選產(chǎn)堿性果膠酶菌種方面逐步轉(zhuǎn)向產(chǎn)酶基因及基因工程菌的研究上，尤其是隨著1999年丹麥Novo Nordisk (諾和諾德)堿性果膠酶Bioprep (是一種基因改良的芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵制成的酶制劑，其最適pH值為7.5~9.5，適用溫度為55°C左右)和堿性果膠裂解酶ScourzymeL (最佳pH值為7.5~9.5,對溫度的選用則根據(jù)pH值而定,如pH值在8~8.5時，溫度掌握在55°C~60°C )的產(chǎn)品問世，人們將注意力越來越多地轉(zhuǎn)向了酶基因及其克隆技術(shù)的研究。西班牙、法國、荷蘭、日本學(xué)者分別將Bacillus sp.(2000年)、Erwinia chrysanthemi3937> Thermotoga maritima (海棲熱袍菌，2OO3 年)、Bacillussubtilis (2002年)四種菌株的堿性果膠酶基因克隆到大腸桿菌中成功進(jìn)行了表達(dá)。
[0006]國內(nèi)對果膠酶的研究始于20世紀(jì)60年代，1990年初開始對堿性果膠酶進(jìn)行研究，大量文獻(xiàn)對果膠酶菌種的篩選、傳統(tǒng)誘變育種、生產(chǎn)工藝和酶的工業(yè)應(yīng)用等方面做了報(bào)道，但關(guān)于堿性果膠酶的發(fā)酵、酶制劑制備和分子生物學(xué)遺傳育種方面的研究內(nèi)容較少。菌種主要是芽孢桿菌，如吉氏芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌N0.46、XZ2、B13、LH-16、WSHB04-02以及小芽孢桿菌WSH03-09、RK9等，此外還有嗜鹽嗜堿菌Alkalibacteriumsp.F26等。2006年我國學(xué)者K東曉等將Clostridium stercorarium(耐熱梭狀芽孢桿菌)的耐熱果膠裂解酶基因pel9A克隆到表達(dá)載體ρΕΤ28α然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)；同年，諸葛斌等利用溫控載體構(gòu)建了堿性果膠酶工程菌。越來越多的研究單位在基因工程菌應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的總體趨勢下進(jìn)行了堿性果膠酶分子生物學(xué)操作的有效嘗試，大多分子生物學(xué)操作或以大腸桿菌表達(dá)體系為主要內(nèi)容，或以枯草芽孢桿菌表達(dá)體系為研究對象，但大多載體和宿主的選擇在以生產(chǎn)為目的時均顯示了某種不足，例如溫控載體和穿梭質(zhì)粒的使用會因表達(dá)中需要溫度、誘導(dǎo)劑等條件而增加生產(chǎn)成本。
[0007]我國堿性果膠酶研究總體起步較晚，在國外酶制劑公司80%的工業(yè)用酶都是由基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)獲得，發(fā)酵酶活較高、酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的酶制劑工業(yè)生產(chǎn)背景下，必須進(jìn)行基因工程菌構(gòu)建體系和方法的研究以拓寬民族工業(yè)酶制劑的競爭和發(fā)展空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌來源的堿性果膠酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法，并對其基因進(jìn)行分析。
[0009]本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0010]一種堿性果膠酶基因工程菌，是將出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌堿性果膠酶基因連接在表達(dá)載體pET22b (+)上，并采用電擊方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到的工程菌株。
[0011]而且，所述枯草芽孢桿菌為B.subtilisl68，其堿性果膠酶基因的大小為1263bp。
[0012]一種堿性果膠酶基因工程菌的構(gòu)建方法，構(gòu)建方法包括如下步驟:
[0013](I).以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特異的PCR引物，擴(kuò)增堿性果膠酶基因；
·[0014](2).將目的基因酶切后與載體連接，命名重組質(zhì)粒為pET-pelG2 ；
[0015](3).重組質(zhì)粒pET-pelG2在DH5 α中克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主，構(gòu)建堿性果膠酶基因工程菌BL21 / PET-PelG2，最終獲得大腸桿菌堿性果膠酶基因工程菌。
[0016]而且，所述步驟[I]中用于PCR其中上游引物5’端AAGCTT為HindIII酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基CCC ;下游引物5’端CTCGAG為XhoI酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基CCG。
[0017]而且，所述步驟[2]中pET22b(+)分子量5493bp，pET_pelG2大小為6747bp，載體上轉(zhuǎn)錄起始密碼子與目的基因上轉(zhuǎn)錄起始密碼子之間相距51bp。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0019]1、本發(fā)明探索了堿性果膠酶基因在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)條件，構(gòu)建了枯草芽孢桿菌來源的堿性果膠酶基因的工程菌株，建立了工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝，分析了枯草芽孢桿菌堿性果膠酶基因的表達(dá)特性和分子生物學(xué)可操作性，可以指導(dǎo)堿性果膠酶基因構(gòu)建芽孢桿菌基因工程菌的操作。
[0020]2、分析了枯草芽孢桿菌中堿性果膠酶基因及其蛋白組成，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，有利于該菌株來源的堿性果膠酶的發(fā)酵、純化等系列生物學(xué)操作。
[0021]3、野生菌株的果膠酶是復(fù)合酶系，通過選用成熟的大腸桿菌表達(dá)體系，可以針對其中一種堿性果膠酶基因進(jìn)行快速克隆和表達(dá)，從而能夠在非純化條件下測定單一堿性果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)，有利于對堿性果膠酶基因資源的篩選和利用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明基因工程菌中pET-pelG2的酶切驗(yàn)證電泳圖，其中:1.pET_pelG22.Marker ；
[0023]圖2是本發(fā)明基因工程菌BL21 / pET-pelG2對照未誘導(dǎo)菌株的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，其中:1.Marker2.PELG2(誘導(dǎo))3.PELG2(誘導(dǎo)優(yōu)化)4.CK(未誘導(dǎo))；
[0024]圖3是本發(fā)明基因工程菌BL21 / pET-pelG2對照攜帶空質(zhì)粒菌株BL21 /pET22b (+)的堿性果膠酶的酶活平板顯影圖(剛果紅染色)，其中:a.BL21 / pET22b (+)對照b.BL21 / pET-pelG2微生物信息
[0025]本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式以及【具體實(shí)施方式】中所使用的堿性果膠酶基因工程菌BL21 / PET-PelG2已經(jīng)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，分類命名:大腸桿菌BL21 (pET-pelG2)
Escherichia coli BL21 (pET_pelG2)，保藏編號 CCTCC N0.M2013393，保藏地址為:中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2013年9月6日。
[0026]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027]一、堿性果膠酶基因工程菌的構(gòu)建
[0028]從枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(保藏單位:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號:CICC10027)中分離出堿性果膠酶基因，設(shè)計(jì)引物(引物由上海invitrogen生物有限公司合成)，以pET22b (+)為載體，以大腸桿菌DH5 α為克隆宿主，BL21為表達(dá)宿主。
[0029]1、PCR擴(kuò)增目的基因
[0030]根據(jù)枯草芽孢桿菌堿 性果膠酶的基因序列兼顧考慮pET22b(+)載體多克隆位點(diǎn)的基因序列設(shè)計(jì)引物GE2。
[0031 ] GE2UP:5' -CCCAAGCTTATGAAAAAAGTGATGTTAGC-3'
[0032]GE2DOffN:5/ -CCGCTCGAGTTAATTTAATTTACCCGCAC-3
[0033]GE2引物擴(kuò)增的枯草芽孢堿性果膠酶基因命名為PelG2
[0034]其中上游引物5’端AAGCTT為HindIII酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基CCC ;下游引物5’端CTCGAG為XhoI酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基CCG。
[0035]以枯草芽孢桿菌的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在0.5mL Eppendorf管中按以下順序分別加入各試劑:
[0036]擴(kuò)增體系(50μ L):ddH2037 μ L, 10Xbuffer5.0 μ L，dNTPs (2.5mmol / L) 5.0 μ L，上游引物 GE UPdOymol / L) 0.75 μ L，下游引物 GE D0WN(10ymol / L) 0.75pL，DNA 模板1.0 μ L, Pyrobest 高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L ;
[0037]pelG2 擴(kuò)增程序:95°C 5min, I 個循環(huán)；94°C 45s，49°C 45s，72°C 90s, 30 個循環(huán)；72°C lOmin, I 個循環(huán)。
[0038]2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化
[0039](I).將PCR擴(kuò)增得到的目的基因PelG2分別用HindIII和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒(該試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)純化。
[0040](2).將pET22b (+)質(zhì)粒(該質(zhì)粒購自TAKARA公司)經(jīng)HindIII和XhoI雙酶切、純化后與第(I)步的純化產(chǎn)物通過連接試劑盒(該試劑盒購自TAKARA公司)在16°C的條件下連接12h,得到重組質(zhì)粒pET-pelG2。
[0041]pET22b (+)大小為5493bp，pET_pelG2分子量為6747bp，載體上轉(zhuǎn)錄起始密碼子與目的基因上轉(zhuǎn)錄起始密碼子之間相距51bp。
[0042]雙酶切體系:10XHbuffer2 μ L, DNA / pET22b (+) 8 μ 1，HindIIIl.2 μ L，XhoIl.2μ L，ddH207.6 μ L。37°C酶切過夜，目的基因酶切產(chǎn)物直接回收，質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳后切膠回收。
[0043]連接體系:50111衍01115 4 1^，載體0嫩14 1^，目的基因4 4 1^，161:作用12h。
[0044](3).將10μL的，pET-pelG2電轉(zhuǎn)化40μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含氨芐青霉素(50 μ g / mL)的LA平板上，從抗性平板上挑選抗性菌落進(jìn)行HindIII和XhoI雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。陽性克隆子提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，雙重平板法篩選得到一株工程菌株BL21 / pET_pelG2，該菌株已經(jīng)保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號是CCTCC NO:M20133939。 [0045]3、堿性果膠酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)
[0046]將驗(yàn)證正確工程菌株BL21 / pET-pelG2，與對照菌BL21 / pET22b (+)分別接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集細(xì)胞制備電泳檢測樣品，并測定樣品酶活性。
[0047]二、發(fā)酵培養(yǎng)及樣品制備
[0048]在LA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，挑取活化的BL21 / pET_pelG2接種到LB培養(yǎng)基中，裝液量50mL / 250mL三角瓶，37°C，200r / min發(fā)酵培養(yǎng)4h細(xì)胞濃度OD6tltl達(dá)到1.2時加入lmmol / L IPTG，30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)5h后收集細(xì)胞制備電泳檢測樣品，并測定樣品酶活性。
[0049]電泳樣品制備:取3mL培養(yǎng)液12000r/min離心收集菌體，重懸于250 μ L ρΗ9.0的Gly-NaOH-CaCI2緩沖液中，-80。。和37°C反復(fù)凍融3次，12000r / min離心IOmin取上清。用3倍體積丙酮室溫沉淀蛋白lh，離心收集蛋白溶于30 μ L電泳上樣緩沖液，用于蛋白電泳檢測，以非IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌工程菌做對照。
[0050]酶活測定樣品制備:取2mL培養(yǎng)液12000r / min離心收集菌體，重懸于100 μ LpH9.0的Gly-NaOH-CaCl2緩沖液中，加入溶菌酶(50mg / mL) 10 μ L，離心保留上清液，測定堿性果膠酶活。
[0051]三、堿性果膠酶活力的測定
[0052]酶活力單位定義:lmL酶液在45°C，pH為9.0條件下，每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生I μ mo I的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。
[0053]測定方法酶液制備:果膠酶菌種經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液。用緩沖液稀釋不同倍數(shù)，和原液平行測定；酶活測定方法:反應(yīng)體系中包括粗酶稀釋液20 μ L，0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH(0.2moI / L)緩沖液(pH9.0，含有0.44mmol /L的CaCl2) 2mL,反應(yīng)條件為45°C溫育15min，用3mL0.03mol / L的磷酸終止反應(yīng)，在235nm處測定其吸光度值。酶空白:將2mL上述緩沖體系配制的底物保溫2min后，依次加入3mL0.03mol / L的磷酸和20 μ L與實(shí)驗(yàn)樣相同稀釋倍數(shù)的滅活的酶液，混勻。其他操作與
實(shí)驗(yàn)樣相同。
[0054]
【權(quán)利要求】
1.堿性果膠酶基因工程菌，其特征在于所述工程菌的保藏編號CCTCCN0.M2013393，保藏地址為:中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2013年9月6日；或者是與CCTCC N0.M2013393的堿性果膠酶基因工程菌具有95%以上親緣性的堿性果膠酶基因工程菌。
2.一種如權(quán)利要求1所述的堿性果膠酶基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:構(gòu)建方法包括如下步驟: (1).以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特異的PCR引物，擴(kuò)增堿性果膠酶基因； (2).將目的基因酶切后與載體連接，命名重組質(zhì)粒為pET-pelG2； (3).重組質(zhì)粒PET-PelG2轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆宿主DH5α，構(gòu)建堿性果膠酶基因工程菌DH5a / pET-pelG2，提取陽性質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主，最終篩選獲得大腸桿菌堿性果膠酶基因工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利2要求所述的 堿性果膠酶基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟[I]中用于PCR上游引物5’端AAGCTT為HindIII酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基CCC ;下游引物5’端CTCGAG為XhoI酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基CCG。
4.根據(jù)權(quán)利3要求所述的堿性果膠酶大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟[2]中pET22b (+)分子量為5493bp，DH5 a / pET_pelG2大小為6747bp，載體上轉(zhuǎn)錄起始密碼子與目的基因上轉(zhuǎn)錄起始密碼子之間相距51bp。
5.權(quán)利要求1所述的堿性果膠酶基因工程菌在制備堿性果膠酶中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/21GK103589675SQ201310496223
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】肖靜, 王瑞明, 李丕武 申請人:齊魯工業(yè)大學(xué)