提取酸化重金屬尾礦中基因組總dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取酸化重金屬尾礦中基因組總DNA的方法，在酸化重金屬尾礦中加入TE1緩沖液，渦旋振蕩并離心處理后，加入TE2提取緩沖液和溶菌酶進行水浴處理；在液氮中冷卻后在沸水浴中放置處理多次；加入SDS和蛋白酶K消化后進行離心處理；取離心后的上清液依次進行加入預(yù)冷的8mol/L?KAc進行冰浴后進行離心處理、加入酚氯仿異戊醇進行離心處理、加入氯仿異戊醇進行離心處理、加入3mol/L?NaAc和預(yù)冷異丙醇。進行離心處理后，棄去離心后的上清液，用乙醇洗滌沉淀后自然晾干，加入TE溶解沉淀。操作簡單，能夠有效地避免酸化重金屬尾礦的重金屬、高鹽分、低pH等的影響，提取的DNA條帶清晰、完整性好、純度高、雜質(zhì)含量少。
【專利說明】提取酸化重金屬尾礦中基因組總DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酸化重金屬尾礦的處理方法，尤其涉及一種提取酸化重金屬尾礦中基因組總DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因組總DNA提取是PCR技術(shù)、限制性內(nèi)切、分子雜交等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，酸化重金屬尾礦有其相對于土壤更特殊的環(huán)境，主要表現(xiàn)為高鹽分、重金屬種類多及含量高、高硫酸鹽含量和低pH。在此條件下，酸化重金屬尾礦中基因組總DNA總量相比較土壤要少，溶菌酶和其他酶的活性受到抑制。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，普通的土壤基因組總DNA方法步驟如下:
[0004](I)取1.0g 土樣，倒入滅菌的50mL離心管中，加入IOmLTENPP緩沖液[TENPP緩沖液組成:20mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸)，50mmol/L Tris (三羥甲基氨基甲烷)，1%PVPP (交聯(lián)聚乙烯吡咯燒酮)，100mmol/L NaCl (氯化鈉),ρΗΙΟ.0]用振蕩儀振蕩數(shù)分鐘,使土樣懸浮并充分混勻。
[0005](2) 10000r/min離心5min,棄上清,重復(fù)洗漆3-5次,至上清液基本無色。
[0006](3)加入5mL PBS緩沖液[緩沖液組成:2.7mmol/L KC1(氯化鉀)，IOOmmoI/L NaCl，2mmol/L KH2PO4 (磷酸二氫鉀)，10mmol/L Na2HPO4 (磷酸氫二鈉)，ρΗ7.4]漂洗，10000r/min離心5min,棄上清。
[0007](4)加入 13.5mL DNA 提取緩沖液[100mmol/L Tris, IOOmmoI/L EDTA, IOOmmoI/LNa3PO4 (磷酸鈉)，1.5mol/L NaCl，1%CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，ρΗ8.0]，混勻后液氮反復(fù)凍融3次，加入100 μ L蛋白酶K (25mg/mL)和200 μ L溶菌酶(50mg/mL，ρΗ8.0)，37°C水浴30min,期間顛倒混勻3次。
[0008](5)加入2mL20%SDS (十二烷基苯磺酸鈉)，65°C水浴2h，期間顛倒混勻5-6次，8000r/min室溫15min,取上清至新管。
[0009](6)用等體積氯仿異戊醇(氯仿:異戊醇體積比為24:1)抽提，吸出水層，加入0.6倍體積的異丙醇，4°C沉淀Ih或更長。
[0010](7)11000r/min4°C離心 20min,沉淀 DNA,去上清,用 70% 乙醇漂洗，11000r/min4°C離心5min，并重復(fù)漂洗I次，置于超凈工作臺吹干。
[0011](8)干燥后，用100 μ L ddH20 (重蒸水)[含RNase (核糖核酸酶)20mg/mL]溶解，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管,37°C放置30min。
[0012]取3 μ L用于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，表明上述現(xiàn)有技術(shù)中的土壤DNA提取方法不能有效地提取酸化重金屬尾礦中的DNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的是提供一種提取酸化重金屬尾礦中基因組總DNA的方法，該方法操作簡單，能夠有效地避免酸化重金屬尾礦的重金屬、高鹽分、低PH等的影響，提取的DNA條帶清晰、完整性好、純度高、雜質(zhì)含量少，可用于PCR檢測，PCR特異性產(chǎn)物明顯，可滿足分子生物學(xué)實驗的需要。
[0014]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0015]本發(fā)明的提取酸化重金屬尾礦中基因組總DNA的方法，包括步驟:
[0016]A、在酸化重金屬尾礦中加入TEl緩沖液，渦旋振蕩并離心處理I至3次，棄上清液；
[0017]B、加入TE2提取緩沖液和溶菌酶，放入37°C恒溫水浴鍋中水浴處理；
[0018]C、在液氮中冷卻后，在沸水浴中放置處理，如此重復(fù)多次；
[0019]D、加入SDS和蛋白酶K，放入65°C恒溫水浴鍋中消化，降至常溫后進行離心處理；
[0020]E、取步驟D中離心后的上清液加入預(yù)冷的8mol/L KAc (醋酸鉀)進行冰浴后,進行離心處理；
[0021]F、取步驟E離心后的上清液加入酚氯仿異戊醇，進行離心處理；
[0022]G、取步驟F離心后的上清液加入氯仿異戊醇，進行離心處理；
[0023]H、取步驟G離心后的上清液加入3mol/L NaAc (醋酸鈉)和預(yù)冷異丙醇，室溫沉淀2h ；
[0024]1、進行離心處理后，棄去離心后的上清液，用乙醇洗滌沉淀3次，自然晾干，加入TE溶解沉淀。
[0025]由上述本發(fā)明提供的技術(shù)`方案可以看出，本發(fā)明實施例提供的提取酸化重金屬尾礦中基因組總DNA的方法，在酸化重金屬尾礦中加入TEl緩沖液，渦旋振蕩并離心處理I至3次，棄上清液；加入TE2提取緩沖液和溶菌酶，放入37°C恒溫水浴鍋中水浴處理；在液氮中冷卻后，在沸水浴中放置處理，如此重復(fù)多次；加入SDS和蛋白酶K，放入65°C恒溫水浴鍋中消化，降至常溫后進行離心處理；取步驟D中離心后的上清液加入預(yù)冷的8mol/LKAc進行冰浴后，進行離心處理；取步驟E離心后的上清液加入酚氯仿異戊醇，進行離心處理；取步驟F離心后的上清液加入氯仿異戊醇，進行離心處理；取步驟G離心后的上清液加入3mol/LNaAc和預(yù)冷異丙醇，室溫沉淀2h ;進行離心處理后，棄去離心后的上清液，用乙醇洗滌沉淀3次，自然晾干,加入TE溶解沉淀。操作簡單,能夠有效地避免酸化重金屬尾礦的重金屬、高鹽分、低PH等的影響，提取的DNA條帶清晰、完整性好、純度高、雜質(zhì)含量少，可用于PCR檢測，PCR特異性產(chǎn)物明顯，可滿足分子生物學(xué)實驗的需要。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為現(xiàn)有技術(shù)中使用普通土壤提取方法提取酸化重金屬尾礦基因組總DNA的
0.8%瓊脂糖凝膠電泳示意圖；
[0027]圖2為本發(fā)明實施例一中酸化重金屬尾礦基因組總DNA的0.8%瓊脂糖凝膠電泳示意圖；
[0028]圖3為本發(fā)明實施例三中酸化重金屬尾礦基因組總DNA的16S rRNA擴增PCR產(chǎn)物電泳示意圖。
【具體實施方式】
[0029]下面將對本發(fā)明實施例作進一步地詳細(xì)描述。[0030]本發(fā)明的提取酸化重金屬尾礦中基因組總DNA的方法，其較佳的【具體實施方式】包括步驟:
[0031]A、在酸化重金屬尾礦中加入TEl緩沖液，渦旋振蕩并離心處理I至3次，棄上清液；
[0032]B、加入TE2提取緩沖液和溶菌酶，放入37°C恒溫水浴鍋中水浴處理；
[0033]C、在液氮中冷卻后，在沸水浴中放置處理，如此重復(fù)多次；
[0034]D、加入SDS (十二烷基苯磺酸鈉)和蛋白酶K，放入65°C恒溫水浴鍋中消化，降至常溫后進行離心處理；
[0035]E、取步驟D中離心后的上清液加入預(yù)冷的8mol/L KAc進行冰浴后，進行離心處理；[0036]F、取步驟E離心后的上清液加入酚氯仿異戊醇，進行離心處理；
[0037]G、取步驟F離心后的上清液加入氯仿異戊醇，進行離心處理；
[0038]H、取步驟G離心后的上清液加入3mol/L NaAc和預(yù)冷異丙醇，室溫沉淀2h ；
[0039]1、進行離心處理后，棄去離心后的上清液，用乙醇洗滌沉淀3次，自然晾干，加入TE (TE 為 Tris-EDTA 緩沖液，市場購買，組成成分:10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA,PH=8.0)溶解沉淀。
[0040]具體包括步驟:
[0041]A、取0.5g酸化重金屬尾礦，置于1.5mL離心管中，加入ImL TEl緩沖液，渦旋振蕩5min, 6000r/min離心5min,棄上清液,再加入ImlTEl緩沖液,潤旋振蕩5min, 6000r/min離心5min,棄上清液；
[0042]B、加入600 μ L ΤΕ2提取緩沖液和10 μ L濃度為100mg/mL的溶菌酶，放入恒溫水浴鍋中37°C水浴Ih,每IOmin顛倒混勻一次；
[0043]C、在液氮中冷卻5min，迅速在沸水浴中放置5min，如此重復(fù)3次；
[0044]D、加入120 μ L20%SDS和10 μ L100mg/mL蛋白酶K，放入恒溫水浴鍋中65°C消化Ih,期間每IOmin顛倒混勻一次，降至常溫后,8000r/min離心IOmin ；
[0045]E、取步驟D中離心后的上清液加入0.2倍體積的預(yù)冷的8mol/L KAc，冰浴20min，10000r/min4°C離心 IOmin ；
[0046]F、取步驟E離心后的上清液加入等體積的酚氯仿異戊醇(酚:氯仿:異戊醇體積比為 25:24:1), 12000r/min 離心 IOmin ；
[0047]G、取步驟F離心后的上清液加入等體積的氯仿異戊醇(氯仿:異戊醇體積比為24:1), 12000r/min 離心 IOmin ；
[0048]H、取步驟G離心后的上清液加入0.1倍體積的3mol/L NaAc和0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，室溫沉淀2h ；
[0049]1、14000r/min4°C離心lOmin，棄去離心后的上清液，用500 μ L濃度為70%的乙醇
洗滌沉淀3次，自然晾干，加入50 μ LTE溶解沉淀。
[0050]所述TEl 緩沖液配方:0.lmol/L 磷酸緩沖液，3mol/L EDTA,0.lmol/L Tris-HCl,pH=8.0:
[0051]所述TE2提取緩沖液配方:0.lmol/L磷酸緩沖液，3mol/L EDTA, 0.lmol/LTris-HCl,1.5mol/L NaCl,1%CTAB,pH=8.0 ；[0052]酸化重金屬尾礦中的基因組總DNA的提取與普通土壤的提取的差別在于，酸化重金屬尾礦的重金屬種類多、含量高，高鹽分，呈酸性，酸化重金屬尾礦中的基因組總DNA含量比普通土壤低。酸化重金屬尾礦中的重金屬以及酸性環(huán)境會抑制溶菌酶的活性，要獲得高濃度的基因組總DNA，首先需要去除重金屬、調(diào)節(jié)電導(dǎo)率和pH，避免其對溶菌酶活性的影響。EDTA能有效地螯合重金屬，在提取尾礦重金屬之前使用具有高濃度EDTA的緩沖液可以去除尾礦中大量的重金屬。使用本發(fā)明的緩沖液可以有效穩(wěn)定樣品的PH和電導(dǎo)率。同時為保證基因組總DNA的純度，蛋白酶K、SDS和酚氯仿異戊醇(酚:氯仿:異戊醇體積比為25:24: I)可以去除大量的蛋白質(zhì)，CTAB、KAc也可以有效地去除多糖類物質(zhì)。本發(fā)明操作簡單，獲得的DNA條帶清晰，完整性好，純度高，雜質(zhì)含量少。
[0053]具體實施例:
[0054]實施例一，提取酸化重金屬尾礦基因組總DNA，包括步驟:
[0055](I)取0.5g左右酸化重金屬尾礦，置于1.5mL離心管中，加入ImL TEl緩沖液，渦旋振蕩5min,6000r/min離心5min,棄上清液,再加入ImlTEl緩沖液,潤旋振蕩5min,6000r/min離心5min,棄上清。
[0056](2)加入600 μ L ΤΕ2提取緩沖液和10 μ L溶菌酶(100mg/mL)放入恒溫水浴鍋中37°C水浴Ih,每IOmin顛倒混勻一次。
[0057](3)在液氮中冷卻5min,迅速在沸水浴中放入5min,如此重復(fù)3次。
[0058](4)加入120 μ L20%SDS和10 μ L100mg/mL蛋白酶K，放入恒溫水浴鍋中65°C消化Ih,期間每IOmin顛倒混勻一次。降至常溫,8000r/min離心lOmin。
[0059](5)取上述離心后的上清液加入0.2倍體積的預(yù)冷的8mol/L KAc,冰浴20min，10000r/min4°C離心 lOmin。
[0060](6)取上述離心后的上清液加入等體積的酚氯仿異戊醇(酚:氯仿:異戊醇體積比為 25: 24:1), 12000r/min 離心 lOmin。
[0061](7)取上述離心后的上清液加入等體積的氯仿異戊醇(氯仿:異戊醇體積比為24:I), 12000r/min 離心 IOmin0
[0062](8)取上述離心后的上清液加入0.1倍體積的3mol/L NaAc和0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，室溫沉淀2h。
[0063](9)14000r/min4°C離心lOmin，棄去上述離心后的上清液，用500 μ L70%乙醇洗滌沉淀3次，自然晾干，加入50 μ LTE溶解沉淀。
[0064]取3 μ L用于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，表明用本發(fā)明方法得到的DNA亮度高，比較豐富，比較清晰，樣品間的重復(fù)性較好。
[0065]與現(xiàn)有技術(shù)中傳統(tǒng)的土壤DNA提取方法相比，本方法提取的DNA有更好的穩(wěn)定性，提取出來的DNA濃度較高。
[0066]實施例二，測定樣品中基因組總DNA的濃度和純度:
[0067]利用紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，分別測提取的DNA溶液在260nm、280nm時的吸光值，本發(fā)明方法提取DNA的吸光值如表1所示，傳統(tǒng)的土壤DNA提取方法獲得的DNA的吸光值如表2所示，計算得到DNA樣品的濃度和純度。
[0068]表1本發(fā)明方法提取的酸化重金屬尾礦基因組總DNA的純度和濃度
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種提取酸化重金屬尾礦中基因組總DNA的方法，其特征在于，包括步驟: A、在酸化重金屬尾礦中加入TEl緩沖液，渦旋振蕩并離心處理I至3次，棄上清液； B、加入TE2提取緩沖液和溶菌酶，放入37°C恒溫水浴鍋中水浴處理； C、在液氮中冷卻后，在沸水浴中放置處理，如此重復(fù)多次； D、加入SDS和蛋白酶K，放入65°C恒溫水浴鍋中消化，降至常溫后進行離心處理； E、取步驟D中離心后的上清液加入預(yù)冷的8mol/LKAc進行冰浴后，進行離心處理； F、取步驟E離心后的上清液加入酚氯仿異戊醇，進行離心處理； G、取步驟F離心后的上清液加入氯仿異戊醇，進行離心處理； H、取步驟G離心后的上清液加入3mol/LNaAc和預(yù)冷異丙醇，室溫沉淀2h ； I、進行離心處理后，棄去離心后的上清液，用乙醇洗滌沉淀3次，自然晾干，加入TE溶解沉淀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取酸化重金屬尾礦中基因組總DNA的方法，其特征在于，具體包括步驟: A、取0.5g酸化重金屬尾礦，置于1.5mL離心管中，加入ImL TEl緩沖液，渦旋振蕩5min, 6000r/min離心5min,棄上清液,再加入ImL TEl緩沖液,潤旋振蕩5min, 6000r/min離心5min,棄上清液； B、加入600μ L ΤΕ2提取緩沖液和10 μ L濃度為100mg/ml的溶菌酶，放入恒溫水浴鍋中37°C水浴Ih,每IOmin顛倒混勻一次； C、在液氮中冷卻5min，迅速在沸水浴中放置5min，如此重復(fù)3次； D、加入120μ L20%SDS和10 μ L100mg/mL蛋白酶K，放入恒溫水浴鍋中65°C消化lh，期間每IOmin顛倒混勻一次，降至常溫后,8000r/min離心IOmin ； E、取步驟D中離心后的上清液加入0.2倍體積的預(yù)冷的8mol/L KAc,冰浴20min，10000r/min4°C離心 IOmin ； F、取步驟E離心后的上清液加入等體積的酚:氯仿:異戊醇體積比為25: 24:1的酚氯仿異戊醇，12000r/min離心IOmin ； G、取步驟F離心后的上清液加入等體積的氯仿:異戊醇體積比為24: I的氯仿異戊醇，12000r/min 離心 IOmin ； H、取步驟G離心后的上清液加入0.1倍體積的3mol/L NaAc和0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，室溫沉淀a ； 1、14000r/min4°C離心lOmin，棄去離心后的上清液，用500μ L濃度為70%的乙醇洗滌沉淀3次，自然晾干，加入50 μ LTE溶解沉淀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取酸化重金屬尾礦中基因組總DNA的方法，其特征在于: 所述 TEl 緩沖液配方:0.lmol/L 磷酸緩沖液，3mol/L EDTA，0.lmol/L Tris-HCl,pH=8.0: 所述TE2提取緩沖液配方:0.lmol/L磷酸緩沖液，3mol/L EDTA,0.lmol/L Tris-HCl,1.5mol/L NaCl,1%CTAB, pH=8.0。
【文檔編號】C12N15/10GK103509787SQ201310496889
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】孫慶業(yè), 李楊, 楊揚 申請人:安徽大學(xué)