一種堿性過氧化氫酶高產(chǎn)菌及該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一種堿性過氧化氫酶高產(chǎn)菌及該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)工藝，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開了堿性過氧化氫酶高產(chǎn)菌，經(jīng)鑒定其屬于節(jié)桿菌Arthrobactersp.，保藏編號為CGMCCNO.8181。本發(fā)明還公開了所述的堿性過氧化氫酶高產(chǎn)菌生產(chǎn)堿性過氧化氫酶的方法，本發(fā)明提出了一種堿性過氧化氫酶的高產(chǎn)菌，用該菌株經(jīng)搖瓶液體深層發(fā)酵可制備堿性過氧化氫酶，酶活達(dá)到49706U/mL，可用于棉紡織品的染整處理過程，能改善產(chǎn)品品質(zhì)，有效地改進(jìn)現(xiàn)有棉紡織品染整處理工藝，使得生產(chǎn)過程更加綠色環(huán)保。
【專利說明】一種堿性過氧化氫酶高產(chǎn)菌及該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)工藝【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]一種堿性過氧化氫酶高產(chǎn)菌及用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)堿性過氧化氫酶，特別是一株高產(chǎn)堿性過氧化氫酶的菌株，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。【背景技術(shù)】[0002]在眾多行業(yè)中，紡織業(yè)是我國的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)和支柱產(chǎn)業(yè)。在紡織行業(yè)上，近些年來對于過氧化氫酶能夠在紡織的過程中發(fā)揮作用的研究報道也是屢見不鮮，并且將過氧化氫酶作為一種在紗線過程中經(jīng)濟(jì)的除去剩余過氧化氫的物質(zhì)，同樣也在織物的漂白這一工序中發(fā)揮作用，與之相比，傳統(tǒng)的水清洗方式是有較大的弊端的:例如過氧化氫作為漂白劑使用之后清除不是很容易而且殘余的還原劑對于纖維也將有一些不良的影響，而改用過氧化氫酶清洗之后，不僅節(jié)約用水還能提高工作效率。過氧化氫酶生物凈洗工藝的優(yōu)勢具體表現(xiàn)為:1)顯著降低水耗，能耗和廢水量；2)高效催化，減少生產(chǎn)時間，提高生產(chǎn)能力，增加產(chǎn)值；3)酶劑用量少，降低生產(chǎn)成本；4)織物的質(zhì)量更好，強(qiáng)度更高，柔軟度更好；5)提升染色的準(zhǔn)確性和安全性；6)操作更加安全和簡便；7)產(chǎn)物是氧氣和水，有利于環(huán)保。[0003]在織物漂白工藝中運用過氧化氫酶實現(xiàn)漂白雖具有良好的經(jīng)濟(jì)和環(huán)保效益，但是就目前來看，實現(xiàn)這一工藝的主要問題是高溫和強(qiáng)堿性條件下過氧化氫酶的穩(wěn)定性問題， 包括過氧化氫酶保存穩(wěn)定性問題和反應(yīng)穩(wěn)定性問題，但是大多產(chǎn)品仍沒有達(dá)到紡織工業(yè)強(qiáng)堿性(pH>10)的要求，同時在國內(nèi)外的文獻(xiàn)中節(jié)桿菌產(chǎn)過氧化氫酶酶活很低，遠(yuǎn)沒有達(dá)到工業(yè)化的要求。過氧化氫酶來源豐富，幾乎存在于所有好養(yǎng)生物中，隨著細(xì)菌細(xì)胞壁破碎技術(shù)的成熟，過氧化氫酶應(yīng)用將更為廣泛。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種堿性過氧化氫酶高產(chǎn)菌及用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)堿性過氧化氫酶，所制備的堿性過氧化氫酶用于棉紡織品的染整處理過程。[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:從造紙廠土壤中分離得到一株菌LHM7719，經(jīng)鑒定其屬于節(jié)桿菌sp.,并于2013年9月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC N0.8181。[0006]堿性過氧化氫酶高`產(chǎn)菌生產(chǎn)堿性過氧化氫酶的方法，按照下述步驟進(jìn)行:采用CGMCC NO:8181為出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵制得堿性過氧化氫酶， 種子培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基:以g/L計，葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉浸膏5，氯化鈉5，pH7.2 ;培養(yǎng)條件:培養(yǎng)時間為12~16小時，溫度為29~32°C，搖床轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘。[0007]發(fā)酵培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基:以g/L計，木薯淀粉15~20，豆柏粉50~70，磷酸二氫鉀0.5，初始pH為7.0;發(fā)酵條件:發(fā)酵時間為35~45小時，接種量為1%~8% (v/v)，裝液量為40ml/250 ml,培養(yǎng)溫度為30~40°C，搖床轉(zhuǎn)速為200~250轉(zhuǎn)/分鐘。[0008]取15ml發(fā)酵液，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，然后加入15ml磷酸緩沖液混勻后， 超聲波破碎取，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清液得到堿性過氧化氫酶。[0009]中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏編號CGMCC NO:8181發(fā)酵所得過氧化氫酶的應(yīng)用:所制備的堿性過氧化氫酶酶活達(dá)到49706U /mL，可用于棉紡織品的染整處理過程。[0010]本發(fā)明的有益效果:提出了一種堿性過氧化氫酶的高產(chǎn)菌，用該菌株經(jīng)搖瓶液體深層發(fā)酵可制備堿性過氧化氫酶，酶活達(dá)到49706U /mL，可用于棉紡織品的染整處理過程， 能改善產(chǎn)品品質(zhì)，有效地改進(jìn)傳統(tǒng)棉紡織品染整處理工藝，使得生產(chǎn)過程綠色環(huán)保?！揪唧w實施方式】[0011]一個標(biāo)準(zhǔn)酶活單位(Iu)定義為:在37°C下，I min內(nèi)分解I umol H2O2 (消光系數(shù)為39.4L/mol/cm)所需的酶量。H2O2的分解速率用紫外可見光分光光度計S53在240 nm, 30°C條件下進(jìn)行測定。反應(yīng)總體積為3 mL,含0.1ml酶液和2.9ml含有120 mmol/L H2O2和 50 mmol/L的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀緩沖液(pH 7.0)。[0012]本發(fā)明所采用菌株，已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為 CGMCC NO:8181o[0013]中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏編號CGMCC NO:8181的篩選方法是從造紙廠土壤中篩選并經(jīng)平板培養(yǎng)，滴加產(chǎn)氣泡情況再篩選，并比較過氧化氫酶活性大小而得到。造紙廠土壤經(jīng)過兩次LB培養(yǎng)基增值培養(yǎng)，涂平板，培養(yǎng)后滴加0.2ml3%過氧化氫于大小均勻的菌落上，選擇產(chǎn)氣泡迅速且持續(xù)時間久的菌落進(jìn)行試管發(fā)酵培養(yǎng)，通過比較堿性過氧化氫酶分解H2O2能力的大小，最終確定菌株為LHM7719。經(jīng)鑒定其屬于節(jié)桿菌 Arthrobacter sp.,并于2013年9月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所， 郵編100101)，保藏編號為CGMCC N0.8181。[0014]LHM7719菌株部分生理生化特性鑒定如表1所示，細(xì)胞為桿狀，革蘭氏染色為陽性，并做該菌株16S rDNA鑒定。16SrDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫中通過比對與Arthrobacter sp.TM4_3 (DQ279376)最為接近,所以確定該菌株為節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)微生物。最終判定菌株LHM7719應(yīng)屬于節(jié)桿菌屬的一種(Arthrobacter sp.),命名為Arthrobacter sp.LHM7719。[0015]實施例1從斜面上刮取兩環(huán)菌種，置于裝有30ml`種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)。 條件為:PH 7.2，培養(yǎng)時間為16小時，溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘。再以2%的接種量接入裝有40ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。條件為:pH為7.0，發(fā)酵時間為45小時，溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘，即可得到酶活49706U /mL的發(fā)酵液。[0016]實施例2從斜面上刮取兩環(huán)菌種，置于裝有30ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)。 條件為:PH 7.2，培養(yǎng)時間為16小時，溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘。再以2%的接種量接入裝有40ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。條件為:pH為7.0，發(fā)酵時間為36小時，溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘，即可得到酶活41000U /mL的發(fā)酵液。[0017]表1菌株LHM7719部分生理生化特性
【權(quán)利要求】
1.堿性過氧化氫酶高產(chǎn)菌，經(jīng)鑒定其屬于節(jié)桿菌Arthrobactersp.,保藏編號為CGMCC N0.8181。
2.權(quán)利要求1所述的堿性過氧化氫酶高產(chǎn)菌生產(chǎn)堿性過氧化氫酶的方法，按照下述步驟進(jìn)行:采用CGMCC NO:8181為出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵制得堿性過氧化氫酶， 種子培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基:以g/L計，葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉浸膏5，氯化鈉5，pH 7.2 ;培養(yǎng)條件:培養(yǎng)時間為12~16小時，溫度為29~32°C，搖床轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘； 發(fā)酵培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基:以g/L計，木薯淀粉15~20，豆柏粉50~70，磷酸二氫鉀0.5，初始pH為7.0 ;發(fā)酵條件:發(fā)酵時間為35~45小時，接種量為1%~8%(v/v)，裝液量為40ml/250 ml,培養(yǎng)溫度30~40°C，搖床轉(zhuǎn)速為200~250轉(zhuǎn)/分鐘；取15ml發(fā)酵液，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，然后加入15ml磷酸緩沖液混勻后，超聲波破碎取，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清液得到堿性過氧 化氫酶。
【文檔編號】C12R1/06GK103555620SQ201310505522
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】劉煥民, 周穎, 王建, 張峰 申請人:常州大學(xué)