一種大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶p1的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用桔青霉菌株進(jìn)行大規(guī)模液體發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶的工藝，包括以下步驟：(1)菌種的斜面培養(yǎng)；(2)搖床種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)；(3)500L發(fā)酵罐種子擴(kuò)大培養(yǎng)；(4)大規(guī)模發(fā)酵罐大生產(chǎn)。利用本發(fā)酵工藝，在10噸發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)間僅50-70h，發(fā)酵液中核酸酶的活力高達(dá)1180U/ml。該工業(yè)具有較低的成本，酶活較麥芽根提取酶原液的活力(300U/ml)有大幅度的提高。
【專利說明】一種大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶P1的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵酶制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)核酸Pl的方法。
技術(shù)背景
[0002]5'-核苷酸在食品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域上有著廣泛的用途。在食品領(lǐng)域中， -核苷酸是動(dòng)植物性食物味道的基本成分，尤其是其中的鳥苷一磷酸(5' -Guanosine
Monophosphate,簡稱 GMP)和肌苷一憐酸(5' -1nosine Monophosphate,簡稱 IMP),它們在大于或等于其域值時(shí)呈現(xiàn)一種自身獨(dú)特的美味，被大量用來作為調(diào)味物質(zhì)。5'-核苷酸用在嬰兒食品中作為添加劑可以明顯提高嬰兒的免疫能力，促進(jìn)腸道的成熟，促進(jìn)脂蛋白和多不飽和脂肪酸的合成，減少嬰兒感冒和腹瀉等疾病的發(fā)生，有利于嬰兒的正常生長和發(fā)育；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中，5’ -核苷酸可用做植物營養(yǎng)添加劑，使用后可以明顯提高水稻、大豆等農(nóng)作物的產(chǎn)量，最高增產(chǎn)可達(dá)40%。用于動(dòng)物的飼養(yǎng)可以提高動(dòng)物的增重率及飼料使用率，料耗明顯降低；在醫(yī)藥領(lǐng)域中，5’ -核苷酸可以合成許多抗病毒、抗腫瘤藥物，其相應(yīng)的衍生物在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)等方面疾病有很重要的作用；在精細(xì)化工領(lǐng)域中，核酸類物質(zhì)作為化妝品的成分之一，有護(hù)膚、防皺等功效；在生物化學(xué)領(lǐng)域，新的核酸類物質(zhì)，如新型的寡聚核苷酸的出現(xiàn)，可以作為靶細(xì)胞的探針用于研究基因的功能、相關(guān)的遺傳座位和基因組文庫 作圖等方面，甚至用于相應(yīng)抗癌制劑的作用機(jī)理研究，為分子生物學(xué)研究提供了新的方法和手段。
[0003]核酸酶Pl (5'-磷酸二酯酶，nuclease Pl)能夠水解核酸中的3'，5'-磷酸二酯鍵得到4種5'-核苷酸，我國的5'-核苷酸原料短缺以及作為調(diào)味品的酵母調(diào)抽提物產(chǎn)能的擴(kuò)大，為此需要大量用于這些生產(chǎn)的核酸酶P1。從目前的研究和工業(yè)化現(xiàn)狀來看，核酸酶Pl主要是由桔青霉(Penicillium citrinum)液體發(fā)酵生產(chǎn)和麥芽根提取獲得,但是麥芽根中可能含有一些有毒物質(zhì)，同時(shí)提取的酶活水平較低，原酶液酶活僅為300U/ml，而且受麥芽根品質(zhì)影響較大，所以，麥芽根提取法在工業(yè)化生產(chǎn)中逐漸被擯棄。桔青霉液體發(fā)酵生產(chǎn)的核酸酶Pl可以廣泛應(yīng)用于食品等行業(yè)中，對人體無毒害作用，因而桔青霉生產(chǎn)核酸酶Pl更適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。然而國內(nèi)企業(yè)未實(shí)現(xiàn)核酸酶Pl的發(fā)酵生產(chǎn)，為此本發(fā)明提供一種大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)該酶的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶Pl的方法，并要求該方法具有較高的酶活力和較低的成本。
[0005]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0006]種子培養(yǎng)基配方為:工業(yè)葡萄糖30~50g/L，工業(yè)牛骨蛋白胨2~5g/L，工業(yè)酵母膏 2 ~5g/L、K2HPO40.5 ~1.0g/L, KH2PO4.3Η200.5 ~1.0g/L, MgSO4.7Η200.5 ~1.0g/L,CaCl20.5 ~1.0g/L,泡敵 0.5 ~1.0g/L,其余為水，pH 值 5.5 ~7.0。[0007]發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方為:工業(yè)葡萄糖3~5g/L，工業(yè)蔗糖40~70g/L，工業(yè)牛骨蛋白胨5~8g/L，工業(yè)玉米漿粉5~8g/L，麩皮5~8g/L，K2HPO40.5~1.0g/L,KH2PO4.3Η200.5 ~1.0g/L, MgSO4.7Η200.5 ~1.0g/L, CaCl20.5 ~1.0g/L,泡敵 0.5 ~Ig/L，其余為水，pH值5.5~7.0。
[0008]具體的發(fā)酵工藝為:
[0009](I)斜面的制備:將橘青霉菌種接入裝有PDA固體培養(yǎng)基的茄形瓶中，置于25~28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~7d。
[0010](2)搖瓶種子的制備:將茄形瓶中的橘青霉菌種刮入裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，放入25~28°C恒溫?fù)u床，以100~150rpm/min培養(yǎng)I~3d ;
[0011](3)500L種子罐的再擴(kuò)大培養(yǎng):將裝有300L種子培養(yǎng)基的攪拌式發(fā)酵罐滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到5.5~7.0,將適量二級(jí)搖瓶種子接入種子罐中，保持培養(yǎng)溫度為25~28 °C，攪拌速度為100~150rpm/min，通氣量為1:0.8~1.5V/V.min，罐壓0.03~0.06MPa，經(jīng)30~40h培養(yǎng)；(4) 10噸發(fā)酵罐生產(chǎn):將7噸發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)PH值到5.5~7.0，將種子罐的種子移入發(fā)酵罐中，保持培養(yǎng)溫度為25~28°C，攪拌速度為 50 ~150rpm/min，通氣量為 1:0.5 ~1: 1.5V/V.min,罐壓 0.03 ~0.06MPa,經(jīng)50~70h培養(yǎng)。
[0012](7)酶液的制備和測定酶活:取發(fā)酵液20ml加到50ml的離心管，在離心機(jī)中3000r/min,離心5min后,上清液即為酶液,并根據(jù)如下方法測定酶活。
[0013]核酸酶Pl測定方法:(在試管中加入1.9ml底物溶液(3%酵母核糖核酸，煮沸20min,調(diào)節(jié)pH到5.0，用pH為5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液定容)，置于68°C水浴保溫IOmin后，加入酶液0.1ml，繼續(xù)保溫15min后，置冰水中冷卻，迅速加入2.0ml核酸沉淀劑(0.25%鑰酸銨-2.5%高氯酸),繼續(xù)冷卻IOmin,于3500r/min離心15min,取0.2ml上清液加雙蒸水稀釋定容至50ml，于260nm處測定吸光度。空白對照:1.9ml底物，在68°C保溫25min，加入核酸沉淀劑2.0ml,再加酶液0.1ml,余下步驟同樣品測定。
[0014]計(jì)算公式如下:酶活(u/mL發(fā)酵液)=(ΑΧ4Χ50)/(0.1Χ0.2Χ15)，ΚΦ:Α指在260nm處的吸光值；4指反應(yīng)容易總體積為4ml ；50指定容于50ml容量瓶中；0.1指酶液體積為0.1mi ；0.2指吸取0.2ml酶解液；15指反應(yīng)總時(shí)間為15min。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本工藝培養(yǎng)基配方均為工業(yè)常用，總體價(jià)格較便宜，另外發(fā)酵時(shí)間較短且發(fā)酵規(guī)模較大，酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于用麥芽根提取的酶活力。綜合來看，該工藝具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛力。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)例1:
[0017]本實(shí)例以自有保存的橘青霉菌種為出發(fā)菌株進(jìn)行發(fā)酵，具體包括以下步驟:(I)將橘青霉菌種接入裝有PDA固體培養(yǎng)基茄形瓶中，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d ； (2)將2個(gè)橘青霉茄形瓶菌種全部刮入裝有8L —級(jí)種子培養(yǎng)基中，并分裝在4個(gè)5L的三角瓶中，放入28°C恒溫?fù)u床，在轉(zhuǎn)速150rpm/min下培養(yǎng)2d (3)將裝有300L種子培養(yǎng)基在500L攪拌式發(fā)酵罐滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)PH值到6.5，將8L種子接入種子發(fā)酵罐中，保持培養(yǎng)溫度為280C，攪拌速度為100rpm/min，通氣量為1:0.8V/V.min,罐壓0.4MPa，經(jīng)35h培養(yǎng)移種；(4)將I噸發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)PH值到6.5，將種子罐的種子移入發(fā)酵培養(yǎng)罐中，保持培養(yǎng)溫度為28'攪拌速度為100rpm/min，通氣量為1: 0.8V/V.min，罐壓0.04MPa，經(jīng)60h培養(yǎng)后結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵液離子測定酶活為1180U/ml。
[0018]實(shí)例I所用到的搖瓶種子培養(yǎng)基和發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基為:工業(yè)葡萄糖50g/L，工業(yè)牛骨蛋白胨 2g/L，酵母膏 2g/L、K2HPO40.5g/L，KH2PO4.3H200.5g/L，MgSO4.7H200.5g/L，CaCl20.5g/L，泡敵 0.5g/L，其余為水，pH 值 6.5。
[0019]實(shí)例I所用到的10噸罐發(fā)酵培養(yǎng)基為:工業(yè)葡萄糖3g/L，工業(yè)蔗糖60g/L，工業(yè)牛骨蛋白胨 8g/L，工業(yè)玉米漿粉 5g/L，麩皮 5g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO4.3H200.5g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，CaCl20.5g/L，泡敵 0.5g/L，其余為水，pH 值 6.5。
[0020]值得注意的是:雖然本發(fā)明僅舉一個(gè)具體實(shí)例，但明顯本發(fā)明不限于以上實(shí)例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以很容易對之作一些修改或改進(jìn)。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做`的任何修改或改進(jìn)，均應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶的方法，其特征包括以下步驟: (1)斜面的制備:將橘青霉菌種接入裝有PDA固體培養(yǎng)基的茄形瓶中，置于25~28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~7d ; (2)搖瓶種子的制備:刮取斜面菌種接種于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，放入25~28°C恒溫?fù)u床，以100~150rpm/min培養(yǎng)I~3d ; (3)500L種子罐的擴(kuò)大培養(yǎng):將裝有300L種子培養(yǎng)基的攪拌式發(fā)酵罐滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到5.5~7.0，將適量搖瓶種子接入種子罐中，保持培養(yǎng)溫度為25~28°C，攪拌速度為 50 ~150rpm/min，通氣量為 1:0.8 ~1:1.5V/V.min，罐壓 0.03 ~0.06MPa，經(jīng) 30 ~40h培養(yǎng)移種；(4) 10噸發(fā)酵罐生產(chǎn):將7噸發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到5.5~7.0，將種子罐的種子移入發(fā)酵罐中，保持培養(yǎng)溫度為25~28°C，攪拌速度為50~150rpm/min，通氣量為 1:0.5 ~1: 1.5V/V.min，罐壓 0.03 ~0.06MPa，經(jīng) 50 ~70h 培養(yǎng)結(jié)束放罐。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的發(fā)酵方法，其特征所述的種子培養(yǎng)基配方為:工業(yè)葡萄糖30~50g/L，工業(yè)牛骨蛋白胨2~5g/L，工業(yè)酵母膏2~5g/L、K2HPO40.5~L Og/L,KH2PO4.3Η200.5 ~1.0g/L, MgSO4.7Η200.5 ~1.0g/L, CaCl20.5 ~1.0g/L,泡敵 0.5 ~1.0g/L，其余為水，pH值5.5~7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為:工業(yè)葡萄糖3~5g/L，工業(yè)蔗糖40~70g/L，工業(yè)牛骨蛋白胨5~8g/L，工業(yè)玉米漿粉5~8g/L，麩皮 5 ~8g/L, K2HPO40.5 ~1.0g/L, KH2PO4.3Η200.5 ~1.0g/L, MgSO4.7Η200.5 ~1.0g/L,CaCl20.5 ~1.(^/1，泡敵0.5~lg/L，其余為水，pH 值 5.5 ~7.0。
【文檔編號(hào)】C12N9/22GK103820418SQ201310507157
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】曾化偉, 喬潔, 饒勝其, 李煜林 申請人:曾化偉