一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質(zhì)粒、構(gòu)建方法、重組工程菌及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質(zhì)粒、構(gòu)建方法、重組工程菌及應(yīng)用，所述重組質(zhì)粒是在質(zhì)粒pET28a的基礎(chǔ)上插入煙草葉綠體rrn16基因強(qiáng)啟動(dòng)子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結(jié)合位點(diǎn)保守序列、煙草葉綠體rps16基因的3’端非編碼區(qū)、產(chǎn)氣腸桿菌聚磷激酶基因ppk和假單胞菌K-62菌株去掉merA、merG后的mer操縱子構(gòu)建而成。本發(fā)明通過merT-merP將廢水中的有機(jī)汞和無機(jī)汞轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，通過merB1和merB2將有機(jī)汞降解為二價(jià)汞，通過ppk將二價(jià)汞螯合在細(xì)胞內(nèi)，降低汞對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的毒性，將廢水中的汞積累在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，通過收集重組工程菌菌體清除廢水中的汞污染。
【專利說明】—種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質(zhì)粒、構(gòu)建方法、重組工程菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質(zhì)粒，同時(shí)還涉及該重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法、包含該重組質(zhì)粒的重組工程菌及該重組工程菌的應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]土壤是人類賴以生存的主要自然資源之一，也是人類生態(tài)環(huán)境的重要組成部分。隨著工業(yè)、城市污染的加劇和農(nóng)用化學(xué)物質(zhì)種類、數(shù)量的增加，土壤重金屬污染日益嚴(yán)重。汞是其中一種主要的重金屬污染物。農(nóng)用土壤重金屬污染主要來自于污水灌溉。據(jù)我國農(nóng)業(yè)部進(jìn)行的全國污灌區(qū)調(diào)查，在約140萬公頃的污水灌區(qū)中，遭受重金屬污染的土地面積占污水灌區(qū)面積的64.8%，其中輕度污染的占46.7%，中度污染的占9.7%，嚴(yán)重污染的占
8.4%。因此，在廢水排出工廠前進(jìn)行去汞處理，對(duì)于保障人類身體健康非常重要。
[0003]廢水中的汞主要有三種形態(tài):金屬汞、無機(jī)汞和有機(jī)汞,其中有機(jī)汞的毒性最大。運(yùn)用生物方法對(duì)被汞污染的廢水進(jìn)行處理能夠?qū)?duì)周圍環(huán)境的影響降低到最小程度。在目前已知的對(duì)萊具有耐受性的生物中，假單胞菌(Pseudomonas) K_62菌株對(duì)萊的耐受性最強(qiáng)，其對(duì)汞的耐受性比大腸桿菌高1000倍左右。該菌具有對(duì)汞極強(qiáng)的耐受能力主要起因于該菌細(xì)胞內(nèi)的兩個(gè)質(zhì)粒:pmr26和pmr28。pmr26含有兩個(gè)抗萊操縱子mer,這兩個(gè)操縱子之間相隔Ikb左右，其中一個(gè)操縱子使該菌對(duì)無機(jī)汞和有機(jī)汞都具有抗性，而另一個(gè)操縱子對(duì)有機(jī)萊則非常敏感。將這兩個(gè)操縱子分別插入到質(zhì)粒pBluescript II,并命名為pmral7和pmrbOl。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)操縱子pmral7含有6個(gè)開放閱讀框,其中5個(gè)分別被鑒定為merR、merT、merP、merA、merBl。操縱子pmrbOl含有三個(gè)開放閱讀框，分別被鑒定為merR、merB2、merDo MerR是一個(gè)調(diào)芐基因,對(duì)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行正向調(diào)控或負(fù)向調(diào)控；merD與轉(zhuǎn)錄共調(diào)控的功能相關(guān)；merT、merP、merA、merB分別編碼二價(jià)萊離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、二價(jià)萊離子外周胞質(zhì)結(jié)合蛋白、汞離子還原酶和有機(jī)汞裂解酶。在多數(shù)情況下，merB緊挨著位于merA的下游。PseudomonasK-62對(duì)有機(jī)萊的抗性主要源于merBl和merB2編碼的裂解酶。MerBl負(fù)責(zé)將甲基汞轉(zhuǎn)化為二價(jià)汞，merB2負(fù)責(zé)將苯基汞轉(zhuǎn)化為二價(jià)汞，merA負(fù)責(zé)將二價(jià)汞還原為零價(jià)汞。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白merT和merP負(fù)責(zé)將有機(jī)汞和無機(jī)汞運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，并將零價(jià)汞從外周胞質(zhì)中清除出去。MerG位于merA和merB I之間,其預(yù)測(cè)的氨基酸序列含有一個(gè)引導(dǎo)序列,該引導(dǎo)序列包含一個(gè)親水區(qū)域和一個(gè)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)；該信號(hào)序列與已知的外胞周質(zhì)蛋白的引導(dǎo)序列同源。MerG位于外胞周質(zhì)上；將merG刪除以后，細(xì)菌對(duì)二價(jià)汞的抗性并沒有發(fā)生改變，但是對(duì)苯基汞的抗性變?nèi)趿?；刪除掉merG對(duì)于merA和merB編碼的酶的活性也沒有影響。表明merG只參與了對(duì)苯基汞的抗性，其機(jī)理可能是降低了細(xì)胞對(duì)苯基汞的通透性。
[0004] 綜上所述，Pseudomonas K_62對(duì)汞具有極強(qiáng)抗性的機(jī)理是它能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的有機(jī)
汞轉(zhuǎn)化為二價(jià)汞，然后將二價(jià)汞轉(zhuǎn)化為零價(jià)汞，如下:
[0005]
【權(quán)利要求】
1.一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒是在質(zhì)粒pET28a的基礎(chǔ)上插入煙草葉綠體rrnl6基因強(qiáng)啟動(dòng)子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結(jié)合位點(diǎn)保守序列、煙草葉綠體rpsl6基因的3’端非編碼區(qū)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)聚憐激酶基因ppk和假單胞菌(Pseudomonas) K-62菌株去掉merA、merG后的mer操縱子構(gòu)建而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質(zhì)粒，其特征在于，包含有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
3.一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (O根據(jù)假單胞菌K-62菌株質(zhì)粒pmr26和pmr28，合成人工操縱子merT-merP-merBl-merB2,將其與質(zhì)粒pET28a進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果與預(yù)期相符的質(zhì)粒，命名為Pl ； (2)以產(chǎn)氣腸桿菌DNA為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增ppk基因；將ppk基因和質(zhì)粒pi酶切后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果與預(yù)期相符的質(zhì)粒，命名為p2 ； (3)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增含有煙草葉綠體rrnl6基因強(qiáng)啟動(dòng)子和大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’ UTR序列中的核糖體結(jié)合位點(diǎn)保守序列； (4)將含有煙草葉綠體rrnl6基因強(qiáng)啟動(dòng)子和大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結(jié)合位點(diǎn)保守序列和質(zhì)粒pET28a酶切后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果與預(yù)期相符的質(zhì)粒，命名為p3 ； (5)以質(zhì)粒p2為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增人工操縱子merT-merP-merBl-merB2-ppk;將merT-merP-merBl-merB2-ppk和質(zhì)粒p3酶切后進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果與預(yù)期相符的質(zhì)粒，命名為P4 ； (6)以煙草葉綠體DNA為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增rpsl63’端非編碼區(qū)基因序列；將rpsl63’端非編碼區(qū)基因與質(zhì)粒p4酶切后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果與預(yù)期相符的質(zhì)粒即為用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質(zhì)粒。
4.一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組工程菌，其特征在于，所述重組質(zhì)粒是在質(zhì)粒pET28a的基礎(chǔ)上插入煙草葉綠體rrnl6基因強(qiáng)啟動(dòng)子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結(jié)合位點(diǎn)保守序列、煙草葉綠體rpsl6基因的3’端非編碼區(qū)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)聚憐激酶基因ppk和假單胞菌(Pseudomonas) K-62菌株去掉merA、merG后的mer操縱子構(gòu)建而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組工程菌，其特征在于，所述重組工程菌的宿主為大腸桿菌BL21。
6.一種如權(quán)利要求4所述的重組工程菌在清除工業(yè)廢水汞污染方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103525849SQ201310507408
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】舒海燕, 常勝合 申請(qǐng)人:舒海燕, 常勝合