一種嗜熱的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，該枯草芽孢桿菌分離于芝麻香型白酒發(fā)酵的高溫大曲中，具有耐受較高溫度以及產(chǎn)生較高的蛋白酶水解活力等特點(diǎn)。利用本制備方法，通過斜面種子制備，一級搖瓶培養(yǎng)以及二級擴(kuò)大再培養(yǎng)后制備的菌劑非常適合芝麻香型白酒的高溫發(fā)酵過程，在芝麻香型白酒高溫制曲和釀造中具有很高潛在的使用價值。
【專利說明】一種嗜熱的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法及其特性，具體涉及到該枯草芽孢桿菌菌劑的高溫耐受性和產(chǎn)蛋白酶活力。
【背景技術(shù)】
[0002]枯草芽孢桿菌是芝麻香型白酒高溫制曲和釀造中的重要功能微生物。分離于芝麻香型白酒發(fā)酵的高溫大曲的枯草芽孢桿菌CGMCC 8087 (= CICC 15073)能夠耐受較高的溫度(55°C生長良好，而一般的枯草芽孢桿菌55°C不能生長)，能夠產(chǎn)生較高的水解活力中性蛋白酶。在高溫制曲等發(fā)酵過程中，該菌產(chǎn)生的嗜熱蛋白酶能夠降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離的氨基酸，為白酒釀造等發(fā)酵過程提供重要的前體物質(zhì)。因此，通過逐級培養(yǎng)制備的枯草芽孢桿菌菌劑非常適合芝麻香型白酒的高溫發(fā)酵過程，在芝麻香型白酒高溫制曲和釀造中具有很高潛在的使用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于:提供了一種嗜熱的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，該菌劑能夠耐受較高溫度，并且較高的蛋白酶水解活力的能力。通過斜面種子活化，一級種子液培養(yǎng)，二級擴(kuò)大再培養(yǎng)以及真空冷凍干燥制備得到了該枯草芽孢桿菌菌劑，非常適合芝麻香型白酒的高溫發(fā)酵過程，在芝麻香型白酒高溫制曲和釀造中具有很高潛在的使用價值。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是該枯草芽孢桿菌菌劑的制備。
[0005]I)枯草芽抱桿菌枯草亞種subtil is subsp.菌株:2013 年 8月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，編號為CGMCC 8087 (= CICC 15073)(產(chǎn)耐熱蛋白酶)，其16S rDNA序列的Genebank登錄號為KF742413 ;該菌菌落為乳白色，圓形，表面粗糙，邊緣整齊，不透明，較粘稠，易挑取。菌落大小為(0.3-0.4)cmX (0.3-0.4)cm,菌落生長迅速。顯微鏡下觀察，菌體呈長桿狀，單個居多，有少數(shù)兩連桿、三連桿、鏈狀現(xiàn)象。該菌的生長溫度范圍為25-55°C(一般的枯草芽孢桿菌55°C不能生長)。
[0006]2)斜面種子的制備:將枯草芽孢桿菌CGMCC 8087 (= CICC 15073)接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在50°C下培養(yǎng)24小時，制備得到嗜熱的枯草芽孢桿菌的斜面種子；所用的培養(yǎng)基成分:蛋白胨10.0克，牛肉粉3.0克，氯化鈉5.0克，葡萄糖1.0克，瓊脂粉20克，蒸餾水1000毫升，pH 7.0 ;
3)—級種子液的制備:取一環(huán)試管斜面種子轉(zhuǎn)接到到液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在220轉(zhuǎn)/分鐘，50°C條件下培 養(yǎng)24小時進(jìn)行一級種子液的制備,得一級培養(yǎng)液；其中，所用的培養(yǎng)基成分:蛋白胨10.0克，牛肉粉3.0克，氯化鈉5.0克，葡萄糖1.0克，蒸餾水1000毫升，pH 7.0 ；
4)二級培養(yǎng)液的制備:將一級種子菌懸液按2%接種量接入到麩皮培養(yǎng)基中(含水量為50%)，在220轉(zhuǎn)/分鐘，45-55°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)24小時進(jìn)行二級培養(yǎng)液的制備。[0007]5)菌劑的制備:收集二級培養(yǎng)得到的枯草芽孢桿菌菌株，通過真空冷凍干燥(12%脫脂牛奶作為保護(hù)劑)制備得到芽孢桿菌菌劑。
[0008]
【具體實施方式】
[0009]實施例1:依以下步驟制備枯草芽孢桿菌CGMCC 8087 (= CICC 15073)菌劑
1)斜面種子的制備:將枯草芽孢桿菌CGMCC8087 (= CICC 15073)接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在50°C下培養(yǎng)24小時，制備得到嗜熱的枯草芽孢桿菌的斜面種子；所用的培養(yǎng)基成分:蛋白胨10.0克，牛肉粉3.0克，氯化鈉5.0克，葡萄糖1.0克，瓊脂粉20克，蒸餾水1000毫升，pH 7.0 ；
2)—級種子液的制備:取一環(huán)試管斜面種子轉(zhuǎn)接到到液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在220轉(zhuǎn)/分鐘,50 °C條件下培養(yǎng)24小時進(jìn)行一級種子液的制備,得一級培養(yǎng)液；其中，所用的培養(yǎng)基成分:蛋白胨10.0克，牛肉粉3.0克，氯化鈉5.0克，葡萄糖1.0克，蒸餾水1000毫升，pH 7.0 ；
3)二級培養(yǎng)液的制備:將一級種子菌懸液按2%接種量接入到麩皮培養(yǎng)基中(含水量為50%)，在220轉(zhuǎn)/分鐘，45°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)24小時進(jìn)行二級培養(yǎng)液的制備。
[0010]4)菌劑的制備:收集二級培養(yǎng)得到的枯草芽孢桿菌菌株，通過真空冷凍干燥(12%脫脂牛奶作為保護(hù)劑)制備得到芽孢桿菌菌劑。
[0011]實施例2:依以下步驟制 備枯草芽孢桿菌CGMCC 8087 (= CICC 15073)菌劑
1)斜面種子的制備:將枯草芽孢桿菌CGMCC8087 (= CICC 15073)接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在50°C下培養(yǎng)24小時，制備得到嗜熱的枯草芽孢桿菌的斜面種子；所用的培養(yǎng)基成分:蛋白胨10.0克，牛肉粉3.0克，氯化鈉5.0克，葡萄糖1.0克，瓊脂粉20克，蒸餾水1000毫升，pH 7.0 ；
2)—級種子液的制備:取一環(huán)試管斜面種子轉(zhuǎn)接到到液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在220轉(zhuǎn)/分鐘，50°C條件下培養(yǎng)24小時進(jìn)行一級種子液的制備,得一級培養(yǎng)液；其中，所用的培養(yǎng)基成分:蛋白胨10.0克，牛肉粉3.0克，氯化鈉5.0克，葡萄糖1.0克，蒸餾水1000毫升，pH 7.0 ；
3)二級培養(yǎng)液的制備:將一級種子菌懸液按2%接種量接入到麩皮培養(yǎng)基中(含水量為50%)，在220轉(zhuǎn)/分鐘，50°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)24小時進(jìn)行二級培養(yǎng)液的制備。
[0012]4)菌劑的制備:收集二級培養(yǎng)得到的枯草芽孢桿菌菌株，通過真空冷凍干燥(12%脫脂牛奶作為保護(hù)劑)制備得到芽孢桿菌菌劑。
[0013]實施例3:依以下步驟制備枯草芽孢桿菌CGMCC 8087 (= CICC 15073)菌劑
1)斜面種子的制備:將枯草芽孢桿菌CGMCC8087 (= CICC 15073)接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在50°C下培養(yǎng)24小時，制備得到嗜熱的枯草芽孢桿菌的斜面種子；所用的培養(yǎng)基成分:蛋白胨10.0克，牛肉粉3.0克，氯化鈉5.0克，葡萄糖1.0克，瓊脂粉20克，蒸餾水1000毫升，pH 7.0 ；
2)—級種子液的制備:取一環(huán)試管斜面種子轉(zhuǎn)接到到液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在220轉(zhuǎn)/分鐘,50 °C條件下培養(yǎng)24小時進(jìn)行一級種子液的制備,得一級培養(yǎng)液；其中，所用的培養(yǎng)基成分:蛋白胨10.0克，牛肉粉3.0克，氯化鈉5.0克，葡萄糖1.0克，蒸餾水1000毫升，pH 7.0 ；
3) 二級培養(yǎng)液的制備:將一級種子菌懸液按2%接種量接入到麩皮培養(yǎng)基中(含水量為50%)，在220轉(zhuǎn)/分鐘，55°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)24小時進(jìn)行二級培養(yǎng)液的制備。
[0014]4)菌劑的制備:收集二級培養(yǎng)得到的枯草芽孢桿菌菌株，通過真空冷凍干燥(12%脫脂牛奶作為保護(hù)劑)制備得到芽孢桿菌菌劑。
[0015]實施例1-3中經(jīng)不同溫度二級培養(yǎng)后，與實驗室枯草芽孢桿菌相比，測定培養(yǎng)的活菌菌落數(shù)如表1所示。
[0016]表1不同溫度培養(yǎng)條件下活菌菌落數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種嗜熱的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于:以嗜熱的枯草芽孢桿菌CGMCC 8087 (= CICC 15073)作為強(qiáng)化菌株。
2.如權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)枯草芽孢桿菌菌株:枯草芽孢桿菌CGMCC8087 (= CICC 15073)分離于芝麻香型白酒發(fā)酵的高溫大曲，保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，編號為CGMCC 8087 (= CICC15073)； 2)斜面種子的制備:將枯草芽孢桿菌CGMCC8087 (= CICC 15073)接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在50°C下培養(yǎng)24小時，制備得到嗜熱的枯草芽孢桿菌的斜面種子；所用的培養(yǎng)基成分:蛋白胨10.0克，牛肉粉3.0克，氯化鈉5.0克，葡萄糖1.0克，瓊脂粉20克，蒸餾水1000毫升，pH 7.0 ； 3)—級種子液的制備:取一環(huán)試管斜面種子轉(zhuǎn)接到到液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在220轉(zhuǎn)/分鐘，50°C條件下培養(yǎng)24小時進(jìn)行一級種子液的制備,得一級培養(yǎng)液；其中，所用的培養(yǎng)基成分:蛋白胨10.0克，牛肉粉3.0克，氯化鈉5.0克，葡萄糖1.0克，蒸餾水1000毫升，pH 7.0 ； 4)二級培養(yǎng)液的制備:將一級種子菌懸液按2%接種量接入到麩皮培養(yǎng)基中(含水量為50%)，在220轉(zhuǎn)/分鐘，45-55°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)24小時進(jìn)行二級培養(yǎng)液的制備； 5)菌劑的制備:收集二級培養(yǎng)得到的枯草芽孢桿菌菌株，通過真空冷凍干燥(12%脫脂牛奶作為保護(hù)劑)制備得到芽`孢桿菌菌劑。
【文檔編號】C12N1/20GK103865833SQ201310507511
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】程池, 趙紀(jì)文, 姚粟, 信春暉, 李輝, 劉勇, 張明娟 申請人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院, 山東扳倒井股份有限公司