一種棉花主要病原真菌its-rflp快速鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法，主要包括以下步驟：1)棉花主要病原真菌菌絲基因組DNA提取，包括大麗輪枝菌、黑白輪枝菌、立枯絲核菌、串珠鐮刀菌、粉紅單端孢和尖孢鐮刀菌；2)核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)PCR擴(kuò)增，使用真菌ITS通用引物ITS4和ITS5進(jìn)行快速擴(kuò)增；3)限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，及帶譜鑒別，任意使用識(shí)別位點(diǎn)為四堿基的內(nèi)切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A對上述棉花主要病原真菌的ITS產(chǎn)物進(jìn)行單酶切，比對ITS-RFLP帶譜對比表和標(biāo)準(zhǔn)電子圖譜，從而快速鑒定出病原菌的類別。本發(fā)明較傳統(tǒng)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力形態(tài)學(xué)生理學(xué)鑒定，以及高成本的ITS克隆測序鑒定病原菌方法而言，具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)且可以同時(shí)鑒定多種病原真菌的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物病理學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]棉花是世界性重要的經(jīng)濟(jì)作物和紡織工業(yè)原料，也是關(guān)系國計(jì)民生的重要物資。長期以來，棉花病蟲害的普遍發(fā)生始終是制約棉花高產(chǎn)的瓶頸問題，其中最為嚴(yán)重的當(dāng)屬黃萎病和枯萎病，其次為鈴病和苗病，多為真菌病害。為了更加科學(xué)制定合理的防控措施，對病害種類的確認(rèn)是最為必要的前提，因此快速準(zhǔn)確鑒定病原菌就顯得尤為重要。[0003]棉花病原真菌傳統(tǒng)的鑒定是以形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和生態(tài)學(xué)等特征為根據(jù)的，但是由于很多真菌生物學(xué)性狀極其相似，因此，要求科研工作者具有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)，傳統(tǒng)的鑒定還較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer, ITS)擴(kuò)增、克隆測序,大大提高了病原真菌鑒定的準(zhǔn)確性，但仍存在實(shí)驗(yàn)周期較長，成本較高的問題。完成ITS克隆、測序、比對一系列程序需要大約一周，且一個(gè)樣品的鑒定費(fèi)用大約是40元。
[0004]雖然采用ITS-RFLP方法鑒定病原真菌已經(jīng)有文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道，由于棉花病原真菌基因上的相似性，存在嚴(yán)重的相互干擾，因此如何針對棉花病原真菌的特點(diǎn)，選擇合適的引物以及內(nèi)切酶來提高鑒定的準(zhǔn)確性仍然是本領(lǐng)域的技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法，快速而又準(zhǔn)確的鑒定棉花病原真菌的種類，為病害的有效防控提供依據(jù)。
[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法，選擇棉花主要病害的病原真菌，包括棉花黃萎病、枯萎病、立枯病、紅腐病和紅粉病所對應(yīng)的病原菌大麗輪枝菌、黑白輪枝菌、尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、串珠鐮刀菌和粉紅單端孢，并測定以上病原真菌的ITS序列；利用Webcutter在線分析選擇酶切帶譜類型各異的限制性內(nèi)切酶Hha1、HaeII1、Taq1、Sau3A，結(jié)合pDRAW32軟件，對酶切產(chǎn)物分布情況進(jìn)行分析，并繪制出2-4%的瓊脂糖凝膠電子酶切圖譜，作為比對使用的標(biāo)準(zhǔn)圖譜；
[0007]隨后提取待測棉花樣品的病原真菌的基因組DNA，采用如下引物對所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0008]ITS4:5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，:
[0009]ITS5:5’ -GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’:
[0010]擴(kuò)增產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶Hha1、HaeII1、Taq1、Sau3A分別酶切，并采用與前述瓊脂糖凝膠相同濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將酶切結(jié)果和電子標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對，鑒定病原真菌種類。[0011 ] 其特征在于包括下述步驟:
[0012]表1棉花主要病害和病原真菌列表
棉花病害病原菌名稱(中文)病原菌學(xué)名(拉丁文)縮寫
棉花黃萎病大剛輪 枝菌VerticUlium dahliaeVd
棉花黃萎病黑白輪枝菌VerticilIium albo-atrumVa
棉花立枯病立枯絲核菌Rhizoctonia solaniRs
棉花紅腐病串珠鐮刀菌Fusarium proliferatumFp
棉花紅粉病粉紅單端抱Trichothecium roseumTr
棉^才古豸胃_尖孢鐮刀菌_Fusarium oxysporumFo
[0013]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的鑒定步驟包括如下步驟:
[0014]DDNA的提取:將分離純化的棉花病原真菌接種至PDA培養(yǎng)基，28°C恒溫靜置培養(yǎng)，收集菌絲，收集棉花病原真菌的菌絲，采用CTAB-NaCl方法抽提，用ddH20溶解基因組DNA
[0015]2)PCR擴(kuò)增:以上述病原真菌的基因組DNA為模板，采用引物對ITS4 5’ -TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC-3，和 ITS5 5，-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。20 μ I 的 PCR 反應(yīng)體系:包括 10 X PCR buffer (Mg2+) 2 μ I，濃度為 IOmM 的 dNTP 溶液 1.6 μ I，濃度為IOuM引物ITS4 / ITS5各lμl，基因組DNAlμl，濃度為5U / μ I的Taq酶0.2 μ 1，以及13.2μ I的ddH20。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性2min，之后，94°C變性30s，50。。退火30s，72°C延伸40s，共25個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，得到ITS的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物大小范圍為 500-750bp。
[0016]3)酶切反應(yīng):任意使用限制性內(nèi)切酶Hha1、HaeII1、Taq1、Sau3A對ITS的PCR產(chǎn)物酶切。10 μ I的酶切體系:1TS模板6μ 1，10Χ內(nèi)切酶bufferly 1，內(nèi)切酶0.5 μ l、ddH20
2.5 μ I。反應(yīng)條件為:PCR儀中37°C保溫lh，加入2μ I的6Xloading buffer終止反應(yīng)，3%瓊脂糖凝膠電泳恒壓75V，2小時(shí)，在紫外燈下觀察拍照，獲得ITS-RFLP帶譜；
[0017]4)帶譜鑒別:將上述獲得的ITS-RFLP帶譜和標(biāo)準(zhǔn)電子酶切圖譜比對，首先比對HhaI和Sau3A對應(yīng)的大小和電子圖譜(如表2和圖3)，以粉紅單端孢(Tr)為例，用HhaI酶切后，如果出現(xiàn)四條泳帶，且最大為295bp,最小為23bp,則說明是Tr,與此同時(shí)結(jié)合Sau3A的酶切結(jié)果，顯示出有兩條泳帶，分別是396bp和190bp，就進(jìn)一步確認(rèn)待鑒定菌株為粉紅單端孢。本發(fā)明提供了 6種棉花病原真菌的4種常用內(nèi)切酶的帶譜對比表和電子圖譜，以便實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定的目的。
[0018]表2棉花病原菌ITS-RFLP帶譜對比表(bp)
[0019]
病原菌 ITS 大小 HhaI HaeTTITaqlSau3A ~Vd 546 113+198+235 55+59+57+375 25+59+72+182+208 6+52+164+324~ Va 512 243+269 28+29+150+305 3+59+72+158+220 51+142+144+175 Rs 708 345+363 708 708 5+28+156+241+244 Fp 532 94+174+264 77+83十91+281 94+174+264 52+53+110+143+174 Tr 586 23+74+194+295 45+48+64+85+344 142+404 190+396 _Fo_517_262+250_11+80+81+345 53+59+83+142+180 51+53十 110+303
[0020]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在以下三個(gè)方面:
[0021]1、操作流程簡單，可操作性強(qiáng)，不要求鑒定者擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)，鑒定周期短，可以快速鑒定棉花病原真菌。
[0022]1)基因組DNA提取速度快。本發(fā)明采用的是CTAB-NaCl方法抽提DNA，由于下游實(shí)驗(yàn)ITS-PCR反應(yīng)的靈敏度高，因此對模板DNA純度要求低，對裂解液中的蛋白和多糖雜質(zhì)只需要用有機(jī)溶劑抽提一次，然后用冰冷無水乙醇沉淀，無需對沉淀洗滌，干燥后直接加入ddH20,1個(gè)半小時(shí)即可完成DNA抽提。
[0023]2) ITS引物選擇科學(xué)。本發(fā)明所選擇的ITS4源于真菌核糖體的28S保守區(qū)段，ITS5則位于18S，擴(kuò)增產(chǎn)物包括兩個(gè)完整的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)，在種屬各異的可變區(qū)段上，不同限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)均不相同，使得ITS-RFLP的結(jié)果更為可信。
[0024]3) PCR擴(kuò)增ITS效率高。本發(fā)明中ITS擴(kuò)增的反應(yīng)程序簡單，由于ITS序列較短，都在720bp以下，如步驟3)中所示延伸時(shí)間40s即可，共計(jì)25個(gè)循環(huán)，可以在I小時(shí)之內(nèi)完成病原真菌的ITS擴(kuò)增。
[0025]4) ITS-RFLP方法新穎且快速。棉花病原真菌的ITS擴(kuò)增產(chǎn)物無需純化回收，用本發(fā)明所列出的四個(gè)限制性內(nèi)切酶中的任意組合直接酶切ITS，將酶切帶譜和標(biāo)準(zhǔn)帶譜對比表和電子酶切圖譜進(jìn)行比對，就可鑒定出病原真菌的種類。
[0026]綜上所述，棉花病原真菌種類的鑒定工作，可以在5-6小時(shí)完成，和傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和ITS克隆測序相比大大縮短了鑒定周期，更加快捷方便。
[0027]2、棉花病原真菌的鑒定準(zhǔn)確，假陽性率低。本發(fā)明從9種四堿基限制性內(nèi)切酶中，篩選得到了 4個(gè)對6種棉花主要病原菌酶切圖譜各異的內(nèi)切酶Hha1、HaelI1、Taq1、Sau3A，并制作了標(biāo)準(zhǔn)ITS-RFLP的帶譜對比表和電子酶切圖譜，大小精確，圖譜清晰。鑒定者可以根據(jù)自己的實(shí)際情況任意選擇以上四種限制性內(nèi)切酶或者其組合，比對標(biāo)準(zhǔn)圖譜，可以準(zhǔn)確鑒定棉花病原菌的類別。
[0028]3、成本低廉。本發(fā)明不使用任何商業(yè)試劑盒和委托測序服務(wù)，涉及到都是常規(guī)的分子試劑，一個(gè)樣品的鑒定花費(fèi)5元左右，支出費(fèi)用遠(yuǎn)低于40元/樣品的克隆測序鑒定病原菌的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1顯不6種棉花病原真囷基因組DNA提取電泳圖
[0030]圖2顯示6種棉花病原真菌ITS擴(kuò)增電泳圖
[0031]圖3顯示四種限制性內(nèi)切酶的ITS-RFLP的標(biāo)準(zhǔn)電子圖譜
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1棉花病原真菌基因組DNA的提取
[0033]1)從PDA固體培養(yǎng)基上刮取50_100mg的新鮮菌絲，放于1.5ml離心管中，加入 200μ1 預(yù)熱的 DNA 提取緩沖液[配方:50mmol / L Hris-HCl (pH=7.5),50mmol / LEDTA (pH=8.0),1.4mol / L Nacl、20g/L CTAB]，用微型研磨棒磨碎，然后再加入 450 μ I 的提取緩沖液，65?水浴30min,每IOmin反轉(zhuǎn)一次；
[0034]2)加入等體積的1:1飽和酚和氯仿，上下顛倒充分混勻，室溫下12000g離心15min ；
[0035]3)小心移取上清液于新的1.5ml離心管中，加入等體積的冰冷無水乙醇沉淀，室溫放置lOmin, 12000g離心IOmin收集沉淀,棄上清,37°C烘箱烘干；[0036]4)加入30 μ I的ddH20溶解基因組DNA，置于_20°C冰箱備用。
[0037]5)電泳檢測，取2μ I的基因組DNA連同1μ I的6Xloading buffer點(diǎn)樣至0.8%的瓊脂糖凝膠上，200V恒壓電泳15min，見圖1。
[0038]實(shí)施例2棉花病原真菌ITS擴(kuò)增
[0039]I)擴(kuò)增反應(yīng)體系:以上述病原真菌的基因組DNA為模板，采用引物對ITS4 5’_TCCTCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ 和 ITS5 5’ -GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’ 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。20 μ I的PCR反應(yīng)體系:包括10 X PCR buffer (Mg2+) 2 μ I，濃度為IOmM的dNTP溶液
1.6 μ 1，濃度為IOuM引物ITS4 / ITS5各I μ 1，基因組DNAl μ 1，濃度為5U / μ I的Taq酶 0.2 μ 1，以及 13.2μ I 的 ddH20。
[0040]2)擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性2min，之后，94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸40s，共25個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，得到內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的PCR產(chǎn)物。
[0041]3)電泳檢測，取5μ I的ITS的PCR產(chǎn)物，混合1μ I的6Χ loading buffer點(diǎn)樣至
0.8%的瓊脂糖凝膠上，200V恒壓電泳lOmin，大小范圍為500_750bp，見圖2。
[0042]實(shí)施例3限制性內(nèi)切酶的選擇
[0043]篩選合適的四堿基限制性內(nèi)切酶的。根據(jù)6種棉花病原真菌的ITS序列測定結(jié)果，逐個(gè)分析 9 種四喊基限制性內(nèi)切酶(Acc I1、Afal、Alul、HaeIII> HhaI> Sau3A、MspI> TaqI和XspI)在不同ITS上的識(shí)別位點(diǎn)，計(jì)算產(chǎn)物長度，充分考慮多態(tài)性和真菌種類特異性等特點(diǎn)，最終選擇了 4種常見的內(nèi)切酶Hha1、HaeII1、Taq1、Sau3A。
[0044]實(shí)施例4棉花病原真菌ITS-RFLP帶譜對比表和電子圖譜的制作
[0045]I) ITS-RFLP帶譜對比表制作。以6種棉花病原真菌的ITS序列為主要依據(jù)，利用Webcutter在線分析選擇酶切帶譜類型各異的限制性內(nèi)切酶Hha1、HaeII 1、Taq1、Sau3A,根據(jù)酶切產(chǎn)物片段大小制作ITS-RFLP帶譜對比表(表2)。
[0046]2) ITS-RFLP電子圖譜的制作。結(jié)合pDRAW32軟件，對四種限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物分布情況進(jìn)行分析，并繪制出3%的瓊脂糖電子酶切圖譜，作為比對使用的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，見圖3。
[0047]采用本發(fā)明的方法鑒定58個(gè)樣品，經(jīng)過ITS克隆測序的方法驗(yàn)證結(jié)果，結(jié)果顯示本發(fā)明的方法準(zhǔn)確性在94%以上，而平均檢測時(shí)間僅為5.5個(gè)小時(shí)，成本為5元/樣品，可見本發(fā)明的方法具有準(zhǔn)確性高，成本低的優(yōu)勢，適合大規(guī)模使用。
[0048]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鑒定方法，選擇棉花主要病害的病原真菌，包括棉花黃萎病、枯萎病、立枯病、紅腐病和紅粉病所對應(yīng)的病原菌大麗輪枝菌、黑白輪枝菌、尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、串珠鐮刀菌和粉紅單端孢，并測定以上病原真菌的ITS序列；利用Webcutter在線分析選擇酶切帶譜類型各異的限制性內(nèi)切酶Hha1、HaeII1、Taq1、Sau3A，結(jié)合pDRAW32軟件，對酶切產(chǎn)物分布情況進(jìn)行分析，并繪制出2-4%的瓊脂糖凝膠電子酶切圖譜，作為比對使用的標(biāo)準(zhǔn)圖譜； 隨后提取待測棉花樣品的病原真菌的基因組DNA，采用如下引物對所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
ITS4:5’ -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’:
ITS5:5， -GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3，: 擴(kuò)增產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶Hhal、HaeIII, TaqI, Sau3A分別酶切，并采用與前述瓊脂糖凝膠相同濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將酶切結(jié)果和電子標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對，鑒定病原真菌種類。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定方法，其特征在于所述的鑒定方法包括如下步驟: DDNA的提取:將分離純化的棉花病原真菌接種至PDA培養(yǎng)基，28°C恒溫靜置培養(yǎng)，收 集菌絲，收集棉花病原真菌的菌絲，采用CTAB-NaCl方法抽提，用ddH20溶解基因組DNA ； 2)PCR擴(kuò)增:以上述病原真菌的基因組DNA為模板，采用引物對ITS45’_TCC TCC GCTTAT TGA TAT GC-3’和 ITS5 5，-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；20μ I的PCR反應(yīng)體系:包括10 X PCR buffer (Mg2+) 2 μ I，濃度為IOmM的dNTP溶液1.6 μ I，濃度為 IOuM 引物 ITS4 / ITS5 各 I μ 1，基因組 DNAl μ 1，濃度為 5U / μ I 的 Taq 酶 0.2 μ 1，以及13.2μ I的ddH20 ;擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性2min，之后，94°C變性30s，50。。退火30s，72。。延伸40s，共25個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，得到ITS的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物大小為500-750bp ； 3)酶切反應(yīng):任意使用限制性內(nèi)切酶Hhal、HaeIII,TaqI, Sau3A對ITS的PCR產(chǎn)物酶切；10μ I的酶切體系:ITS模板6μ 1，10Χ內(nèi)切酶bufferly 1，內(nèi)切酶0.5μ 1、ddH202.5 μ I ;反應(yīng)條件為:PCR儀中37°C保溫lh，加入2 μ I的6Χ loading buffer終止反應(yīng)，3%瓊脂糖凝膠電泳恒壓75V，2小時(shí)，在紫外燈下觀察拍照，獲得ITS-RFLP帶譜； 4)帶譜鑒別:將上述獲得的ITS-RFLP帶譜和標(biāo)準(zhǔn)電子酶切圖譜比對，首先比對HhaI和Sau3A對應(yīng)的大小和電子圖譜。
【文檔編號】C12R1/77GK103695533SQ201310507875
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】李志芳, 朱荷琴, 馮自力, 趙麗紅, 師勇強(qiáng) 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所