四糖mag拮抗劑的合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種化學(xué)酶法合成雙唾液酸化的四糖拮抗劑的合成方法。本發(fā)明還提供了兩種用于合成制備四糖MAG拮抗劑的中間體，分別為通式Ⅳ、Ⅴ所示的化合物。本發(fā)明將化學(xué)合成法的靈活性和酶合成法的區(qū)域選擇性和高效性結(jié)合到一起，解決了目前化學(xué)合成雙唾液酸化四糖拮抗劑的所面臨的底物反應(yīng)活性低、合成步驟繁多、收率低，以及酶法中唾液酸轉(zhuǎn)移酶獲得困難和只對糖肽的識別等不足，具有底物反應(yīng)活性高、收率高的優(yōu)點。因而，本發(fā)明為在分子水平上研究唾液酸類拮抗劑與髓磷脂相關(guān)糖蛋白之間相互作用具有重要意義。
【專利說明】四糖MAG拮抗劑的合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及與髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)特異性結(jié)合的四糖拮抗劑的化學(xué)酶法合成方法，屬于糖類藥物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]髓憐脂相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein, MAG)分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中與軸突接觸髓鞘上，對發(fā)育中的神經(jīng)元有促進作用，而對成熟神經(jīng)元有抑制作用。MAG是一種唾液酸結(jié)合蛋白，可與唾液酸糖蛋白和唾液酸糖脂(神經(jīng)節(jié)苷脂)結(jié)合，其結(jié)合位點為第I個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域上的精氨酸118(Argll8)。研究發(fā)現(xiàn)，用神經(jīng)氨酸酶去除神經(jīng)元表面的唾液酸可阻斷MAG對神經(jīng)元突起生長的抑制作用，并證明帶有唾液酸的神經(jīng)節(jié)苷酯⑶Ia和GTlb作為神經(jīng)元的受體介導(dǎo)了 MAG的抑制作用(R.H.Quarles, J.Neurochem., 2007, 100, 1431 - 1448 ;N.R.Mehta, T.Nguyen, J.ff.Bullen, Jr., J.ff.Griffin, andR.L.Schnaar, ACS Chem.Neurosc1., 2010, I, 215 - 222)。大量研究表明，與MAG結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)單元為GQlb a的結(jié)構(gòu)中處于最外層的雙唾液酸化四糖，即 Neu5Ac a (2-3)Gal^ (1-3)[Neu5Aca (2-6)]GalNAc(Neu5Ac=N-acetylneuraminic acid;Gal=galactose;GalNAc=N-acetylgalatosamine) (L.J.S.Yang;C.B.Zeller;N.L.Shaper ; M.Kiso ; A.Hasegawa ; R.E.Shapiro ; R.L.Schnaar, Proc.Nat.Acad.Sc1.U.S.A.1996，93，814 - 818)(圖1)。而且，MAG結(jié)構(gòu)中由色氨酸59、酪氨酸60、酪氨酸69、酪氨酸116形成較大的疏水口袋，如果對a 2，3鏈接的唾液酸的C9位進行疏水基團的修飾，則可以明顯提高其與MAG的親和性，然而其內(nèi)部二糖結(jié)構(gòu)則對MAG的親和性影響不大(0.Schwardt; H.Gathje; A.Vedani ; S.Mesch; G.Gao ;M.Spreafico; J.0relli ; S.Kelm, B.Ernst, J.Med.Chem.2009, 52, 989-1004)。
[0003]圖1是神經(jīng)節(jié)苷酯GQlb a的結(jié)構(gòu)和已報道的雙唾液酸化四糖拮抗劑。
[0004]鑒于上述情況，大量合成MAG天然受體拮抗劑及其衍生物對于在分子水平上研究唾液酸糖苷類拮抗劑與MAG受體之間的相互作用，進而發(fā)展以其為先導(dǎo)化合物可促進腦部受損神經(jīng)修復(fù)的新型藥物具有重大意義。目前，已有文獻報道用化學(xué)法對相關(guān)拮抗劑的合成進行研究(Schwizer, D.; Ciiillijc.H.; Kelm, S.; Porro, M.; Schwardt, 0.; Ernst,B.Bioorg.Med.Chem.2006, 14, 4944-4957; 0., Schwardt; H.Gathje; A.Vedani ; S.Mesch; G.Gao; M.Spreafico; J.0relli ; S.Kelm, B.Ernst, J.Med.Chem.2009, 52, 989-1004)，但是化學(xué)法合成需要進行反復(fù)的保護與脫保護操作，并且收率較低、立體選擇性不高。而且，九碳糖唾液酸由于其自身獨特結(jié)構(gòu)，不僅容易形成分子內(nèi)氫鍵，且在Cl位的羧基、C3位的脫氧、C5位的氮雜原子取代均使得唾液酸糖苷鍵的生成成為糖合成領(lǐng)域的難點(J.B.Schwarz, S.D.Kuduk, X.Chen, D.Sames, P.ff.Glunz, andS.J.Danishefsky, J.Am.Chem.Soc.，1999，121，2662-2673)。目前文獻報道的化學(xué)酶法合成四糖拮抗劑采用的為哺乳動物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶來催化的兩個位置不同唾液酸的引入，但是以哺乳動物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶進行四糖的合成面臨以下兩方面的困難:一、哺乳動物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶均為跨膜蛋白，表達難度大，難以獲得一定量的可溶性蛋白；二、該系列酶往往有較強的底物專一性，底物適用性窄，例如目前文獻報道中所采用的哺乳動物來源唾液酸轉(zhuǎn)移酶只對糖肽有較高的反應(yīng)活性(0.Blixt, K.Allin, L.Pereira, A.Datta, andj.C.Paulson, J.Am.Chem.Soc.，2002，124，5739-5746)。在本發(fā)明中所采用的細(xì)菌來源的a 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶PdST對半乳糖或N-乙酰氨基半乳糖胺作為底物都可以識別，不具有嚴(yán)格的底物專一性。因此，需要尋找一種快速、高效合成雙唾液酸化四糖拮抗劑的合成方法是目前亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述現(xiàn)狀，為克服上述現(xiàn)有技術(shù)手段的不足，本發(fā)明發(fā)展了一種高效的化學(xué)酶法合成天然四糖拮抗劑及其類似物的方法，為系統(tǒng)研究四糖拮抗劑在神經(jīng)修復(fù)藥物方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0007]四糖MAG拮抗劑的合成方法，步驟如下:
[0008](I)利用化學(xué)法合成P -構(gòu)型的N-乙酰氨基半乳糖苷GalNAc P 0 R1 (如圖2的通式I所示);其中=R1為氫原子、a -或@ -構(gòu)型絲氨酸殘基、a -或e -構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基、a _或0 _構(gòu)型取代烷基；
[0009](2)利用“一鍋雙酶法”將通式I的化合物和半乳糖立體選擇性偶聯(lián)合成二糖GalP (1-3) GalNAcOR1 (如圖3的通式II所示)，所述“一鍋雙酶法”中先后用到的酶分別為半乳糖激酶(GalK)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP);其中=R1為氫原子、a -或P -構(gòu)型絲氨酸殘基、a -或3 -構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或a -或3-構(gòu)型取代烷基；
[0010](3)利用“一鍋雙酶法” 合成通式III的三糖(如圖4所示)，所述“一鍋雙酶法”唾液酸化中用到的酶指CMP-唾液酸合成酶(NmCSS)和a 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶(PmSTl);其中-R1為氫原子、a-或(6-構(gòu)型絲氨酸殘基、a-或(6-構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基、a-或(6-構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氣基、羥基或置氣；
[0011](4)利用乙?；瓦x擇性脫乙?；姆椒?，合成含唾液酸衍生物的內(nèi)酯三糖(如圖5的通式IV所示);其中=R1為氫原子、a -或P -構(gòu)型絲氨酸殘基、a -或P -構(gòu)型蘇氨酸殘基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或ct -或-構(gòu)型取代烷基；R2為氣原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；
[0012](5)利用酶法合成雙唾液酸化的內(nèi)酯四糖(如圖6的通式V所示)，所述酶法唾液酸化中用到的酶指a 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶；其中A1為氫原子、a -或P -構(gòu)型絲氨酸殘基、a-或(6-構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或a-或(6-構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R4為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R5為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；[0013](6)堿性水溶液中水解上述雙唾液酸化內(nèi)酯四糖，得到雙唾液酸化的四糖(如圖7的通式VI所示)；其中=R1為氫原子、a -或P -構(gòu)型絲氨酸殘基、a -或P -構(gòu)型蘇氨酸殘基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或ct -或-構(gòu)型取代烷基；R2為氣原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R4為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R5為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或置氣；
[0014]本發(fā)明中，我們利用的細(xì)菌來源的a 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶(PmSTl)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP)，實現(xiàn)了步驟(3)中三糖的大量合成；對于這兩種酶的底物適應(yīng)性的考察(含 R1 > R2 和 R3 所列基團)可見相關(guān)報道(H.Yu, H.Yu, R.KarpelandX.Chen.Bioorg.Med.Chem.12, 2004, 6427; K.Lau, H.Yu, V.Thon, Z.Khedri, M.E.Leon, B.K.TranandX.Chen, Org.Biomol.Chem., 2011, 9，2784)。步驟(4)至步驟(6)中的合成方法和化合物均是全新發(fā)明，而且此方法能高效、快速的實現(xiàn)了雙唾液酸四糖拮抗劑的大量積累，解決了目前合成雙唾液酸化四糖拮抗劑步驟繁瑣、效率低、產(chǎn)量低的問題。
[0015]所述步驟(1)中的(6-構(gòu)型的N-乙酰氨基半乳糖苷采用以下方法合成:將半乳糖氨鹽酸鹽與醋酐進行反應(yīng)后，將其全部羥基用乙?；Ｗo；然后在微波條件下進行(6-構(gòu)型糖苷化反應(yīng)，然后依次疊氮化和脫保護后即得可作為下步酶反應(yīng)受體的N-乙酰氨基半乳糖苷(圖8)。
[0016]所述步驟(2)中的二糖Gaie (1-S)GalNAcOR1合成方法是:將化合物1、半乳糖(1.5-3.0 當(dāng)量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP) (1.5-5.0 當(dāng)量)、MgCl2 (5-100mmol)、Tris-HCl緩沖液(10-500mmol，pH5.0-10.0)配制水溶液，將反應(yīng)體系的pH值調(diào)節(jié)至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)和己 糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP)，待反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得二糖化合物II。
[0017]所述當(dāng)量是指物質(zhì)相互作用時的物質(zhì)的量的比值，如:半乳糖(1.5-3.0當(dāng)量)的含義即為:半乳糖與化合物I的物質(zhì)的量的比為1.5-3.0。下同。
[0018]所述步驟(3)中的a 2，3唾液酸化三糖的合成方法:將化合物I1、9_疊氮-N-乙酰神經(jīng)氨酸(1.5-5.0當(dāng)量)、胞苷三磷酸(CTP) (0.5-10.0當(dāng)量)、MgCl2 (5.0-1OOmmol)和Tris-HCl緩沖液(10-500mmol，pH5.0-10.5)配制水溶液，加入CMP-唾液酸合成酶和a 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶，實現(xiàn)“一鍋雙酶法”唾液酸化，反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得化合物III。
[0019]所述反應(yīng)完成采用薄層色譜法(TLC)跟蹤反應(yīng)進程，展開劑為EA:CH3OH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.1 來檢測。
[0020]所述步驟(4)中內(nèi)酯三糖合成方法是:在冰浴的條件下，加入化合物II1、吡啶、醋酐，反應(yīng)5-24小時后旋蒸蒸干，拌入硅膠，柱分離純化，得到全乙?；幕衔颕V。之后將全乙?；闹虚g體溶于甲醇，加入甲醇鈉粉末，使反應(yīng)體系的PH值保持7-9大約5-10小時，然后柱分離純化即得化合物IV。
[0021]所述反應(yīng)完成采用薄層色譜法(TLC)跟蹤反應(yīng)進程，展開劑為EA:CH3OH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.1 來檢測。
[0022]所述步驟(5)中四糖的合成方法是:將化合物IV、CMP-唾液酸衍生物(1.5-5.0當(dāng)量)、MgCl2(5.0-1OOmmol)和 Tris-HCl 緩沖液(10-500mmol, pH5.0-10.5)配制水溶液，加入a 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，實現(xiàn)酶法唾液酸化，反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得化合物V。
[0023]所述步驟(6)中將化合物V溶于氫氧化鈉水溶液(0.1-1mol)中，反應(yīng)2_12小時，純化即可直接獲得化合物VI。
[0024]通式VI中的疊氮基團，可以進一步通過“點擊化學(xué)”反應(yīng)來鏈接疏水性功能基團。
[0025]當(dāng)然，可以制備本發(fā)明化合物堿加成的鹽，這些鹽包括在發(fā)明之中。
[0026]本發(fā)明化合物的堿加成鹽優(yōu)選為藥學(xué)上可以接受的，與適當(dāng)?shù)膲A(例如碳酸氫鈉，碳酸氫鉀，氨水)形成無毒的鹽，除了藥學(xué)上可以接受的鹽以外，其它的鹽也包括在本發(fā)明之中。
[0027]所述步驟(2)中“一鍋雙酶法”中先后用到的酶分別是E.coliK_12galactokinase (GalK)和Bifidobacterium infantis D-galactosyl-旦 1-3-N-acetyl-D-hexosamine phosphorylase (BiGalHexNAcP),反應(yīng)時間為 3-72 小時。
[0028]所述步驟(3)中“一鍋雙酶法”唾液酸化中用到的酶是NeisseriameningitidisCMP-sialic acid synthetase (NmCSS)和 Pasteurella multocidasialyl transferase I (PmSTl)，反應(yīng)時間為 5 分鐘-30 小時。
[0029]所述步驟(2)和步驟(3)中“一鍋雙酶法”合成中反應(yīng)溫度為0_37°C，轉(zhuǎn)速為0-240r/min ;所述酶反應(yīng)的停止方法是向反應(yīng)中加入與反應(yīng)液等體積的4°C無水乙醇并在4°C下孵育0-30分鐘。
[0030]本發(fā)明還提供了兩種用于合成制備四糖MAG拮抗劑的中間體，分別為通式IV、V所示的化合物。
[0031 ] 本發(fā)明提供了一種高效簡捷的化學(xué)酶法合成雙唾液酸化的四糖拮抗劑的合成方法。本發(fā)明將化學(xué)合成法的靈活性和酶合成法的區(qū)域選擇性和高效性結(jié)合到一起，解決了目前化學(xué)合成雙唾液酸化四糖拮抗劑的所面臨的底物反應(yīng)活性低、合成步驟繁多、收率低，以及酶法中唾液酸轉(zhuǎn)移酶獲得困難和只對糖肽的識別等不足，具有底物反應(yīng)活性高、收率高的優(yōu)點。因而，本發(fā)明為在分子水平上研究唾液酸類拮抗劑與髓磷脂相關(guān)糖蛋白之間相互作用具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1:神經(jīng)節(jié)苷酯GQlb a的結(jié)構(gòu)和已報道的雙唾液酸化四糖拮抗劑的結(jié)構(gòu)式。
[0033]圖2:通式I所示化合物。
[0034]圖3:通式II所示化合物。
[0035]圖4:通式III所示化合物。
[0036]圖5:通式IV所示化合物。
[0037]圖6:通式V所示化合物。
[0038]圖7:通式VI所示化合物。
[0039]圖8:化學(xué)法合成P -構(gòu)型的單糖化合物I的反應(yīng)方程式。
[0040]圖9 一鍋雙酶法”合成二糖化合物通式II的反應(yīng)方程式(現(xiàn)有技術(shù))。
[0041]圖:10 一鍋雙酶法”合成二糖化合物2的反應(yīng)方程式。
[0042]圖11 一鍋雙酶法”合成三糖化合物通式III的反應(yīng)方程式(現(xiàn)有技術(shù))。
[0043]圖12 一鍋雙酶法”合成三糖化合物3的反應(yīng)方程式。[0044]圖13:化學(xué)法合成內(nèi)酯三糖4的反應(yīng)方程式。
[0045]圖14:酶法法合成內(nèi)酯四糖5的反應(yīng)方程式。
[0046]圖15:化學(xué)法合成雙唾液酸四糖6的反應(yīng)方程式。
【具體實施方式】
[0047]下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的闡述，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。應(yīng)該說明的是，實施例僅是示范性的，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
[0048]本發(fā)明中所提及的化合物1、2、3、4、5、6分別對應(yīng)于R1為疊氮取代烷基、R2為氮乙酰氨基、R3為疊氮、R4為羥基、R5為氮乙酰氨基的通式1、I1、II1、IV、V、VI的化合物。
[0049]下述實施例中所涉及的反應(yīng)原料、溶劑等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)產(chǎn)品，所涉及的合成方法、工藝，若無特別說明，均為所屬領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段。
[0050]實施例1化學(xué)酶法合成四糖MAG受體拮抗劑
[0051]步驟如下:
[0052]( I)化學(xué)法合成0 -構(gòu)型的單糖化合物I
[0053]化合物I (GalNAc ^ ProN3)的合成
[0054]反應(yīng)方程式如圖 8所示；
[0055]向500mL圓底燒瓶中加入半乳糖氨鹽酸鹽(8.0g, 37.1mmol)、醋酐(38mL)、批啶(160mL)、二甲氨基吡啶(DMAP，0.3g，2.46mmol)，室溫攪拌12小時。薄層色譜檢測(EA:MeOH=IO:1)反應(yīng)完全后,旋蒸濃縮,之后向反應(yīng)液中加入甲苯20mL,旋蒸濃縮，反復(fù)進行3次。所得固體復(fù)溶于300mL甲醇，在4°C條件下靜置12小時重結(jié)晶。過濾，棄除濾液，收集所得固體，干燥，獲得白色固體化合物7(11.7g, 84%)。
[0056]向容積為IOmL的微波專用反應(yīng)管中加入化合物7 (1.00g，2.57mmol)、1,2-二氯乙焼(5mL)、1-氯-3-丙醇(0.34mL, 5.14mmol),、硫酸-硅膠(17mg)，磁子攪拌，微波條件110°C反應(yīng)15分鐘。按照相同的反應(yīng)條件，平行開5組相同的反應(yīng)。之后收集反應(yīng)液，過濾，二氯甲烷沖洗，濾液用飽和碳酸氫鈉溶液萃取兩次，半飽和食鹽水萃取一次，之后分離有機相，再用無水硫酸鈉干燥有機相，過濾，蒸干，獲得白色固體化合物8(5.45g, 92%)。
[0057]向250mL圓底燒瓶中加入化合物8(4.82g，11.4mmol)、N，N-二甲基甲酰胺(70mL)、疊氮鈉(3.7g, 56.9mmol)，110°C攪拌回流12小時。薄層色譜檢測(PE:EtOAc=1:8)反應(yīng)完全后，使用硅藻土過濾，二氯甲烷沖洗，半飽和食鹽水40mL萃取，反復(fù)三次，再用無水硫酸鈉干燥有機相，旋蒸濃縮，獲得棕色糖漿狀化合物9 (4.4g, 90%)。
[0058]向250mL圓底燒瓶中加入化合物9、甲醇(60mL)、甲醇鈉，直至溶液體系pH值到9.5左右，室溫攪拌4小時，薄層色譜檢測(EtOAc:MeOH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.2)反應(yīng)完全后，旋蒸濃縮，快速柱分離純化，得到白色固體化合物I (3.96g, 90.8%)。參數(shù)如下=1HNMR(600MHz，D2O) 8
4.40 (d, J=8.4Hz, 1H)，3.94 (dt, J=I0.8，5.6Hz, 1H)，3.89 (d, J=3.1Hz, 1H)，3.83 (dd, J=19.6，10
?9Hz, 1H), 3.80 - 3.70 (m, 2H)，3.68 (dd, J=I0.8，3.2Hz, 1H), 3.65 - 3.60 (m, 2H), 3.43 - 3.27 (m，2H), 2.04 (s, 3H), 1.80 (m, 2H).[0059](2) “一鍋雙酶法”合成二糖化合物 2 [Gal ^ (1-3)GalNAc ^ ProN3]
[0060]“一鍋雙酶法”的一般操作方法如圖9所示(現(xiàn)有技術(shù)中的方法)；
[0061]本發(fā)明的化合物2 [Gal ^ (1-3) GalNAc ^ ProN3]的合成[0062]反應(yīng)方程式如圖10所示；
[0063]將受體化合物I (200mg)、半乳糖(176mg)、ATP (540mg)、Tris-HCl 緩沖液(lOOmmol, pH7.5)和氯化鎂(20mmol) (Tris和氯化鎂的用量由最終反應(yīng)液的體積來計算確定)溶于 50mL 離心管中，加入 GalK (7.2-8.0mg)和 BiGalHexNAcP (8.5 - 11.0mg)，加雙蒸水至總體積30mL后，將反應(yīng)體系置于搖床中，37°C、140r/min孵育48小時。薄層色譜(EtOAc:MeOHiH2O:EtOH=4:2:1:0.2)檢測反應(yīng)完成后，加入與反應(yīng)體系等體積的無水乙醇40C、140r/min孵育30min以終止反應(yīng)。然后將反應(yīng)體系4°C、12000r/min離心10分鐘，收集上清液，旋蒸濃縮，通過硅膠柱快速柱分離，獲得白色化合物2(1.03g，83%)。參數(shù)如下:1HNMR (600MHz, D2O) 8 4.45 (d, J=8.4Hz, 1H)，4.40 (d, J=7.8Hz, 1H)，4.14 (s, 1H)，3.95 (t, J=9
?3Hz, 2H)，3.86 (s, 1H)，3.82 (d, J=I0.8Hz, 1H), 3.79 - 3.68 (m, 4H)，3.65 (d, J=3.5Hz, 2H)，3
?62 (s, 1H)，3.57 (d, J=I0.0Hz, 1H)，3.48 (t, J=8.4Hz, 1H)，3.34 (s, 2H)，1.99 (s, 3H)，1.80 (s，2H).[0064](3 ) “一鍋雙酶法”合成三糖化合物 3 [9N3Neu5Ac a (2-3) Gal ^ (1-3) GalNAc ^ ProN3]
[0065]“一鍋雙酶法”唾液酸化的一般操作方法如圖11所示(現(xiàn)有技術(shù)中的方法);
[0066]本發(fā)明的化合物3 [9N3Neu5Ac a (2-3) Gal ^ (1-3) GalNAc ^ ProN3]的合成
[0067]反應(yīng)方程式如圖12所示；
[0068]向50mL離心管中加入 由“一鍋雙酶法”合成得到的二糖受體2(47mg，0.1mmoI)、9-疊氮-N-乙酰神經(jīng)氨酸(9N3Neu5Ac，50mg)、胞苷三磷酸(CTP，95mg)、Tris-HCl緩沖液(lOOmmol, pH8.5)和氯化鎂(20mmol) (Tris和氯化鎂的用量由最終反應(yīng)液的體積來計算確定)，加雙蒸水調(diào)節(jié)總體積為8mL,振動攪勻后加入酶NmCSS (l_5mg)和PmSTl (0.2-0.6mg),在 37 °C、140r/min 條件下孵育 Ih。薄層色譜跟蹤(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.1)檢測反應(yīng)完成后，加入與反應(yīng)體系等體積的無水乙醇，4°C、140r/min孵育0.5h中止反應(yīng)。之后將反應(yīng)體系4°C、12000r/min離心10分鐘，收集上清液。旋蒸濃縮，通過快速柱分離，獲得白色化合物 3 (74.5mg, 95%)。參數(shù)如下=1HNMR (600MHz, D2O) 8 4.46 (d, J=8
?4Hz, 2H)，4.13 (s, 1H), 4.01 (d, J=9.6Hz, 1H)，3.94 (m, 3H)，3.86 (s, 1H), 3.85 - 3.42 (m，17H)，3.33 (dd, J=16.1, 9.7Hz, 2H)，2.70 (dd, J=12.0，8.4Hz, 1H)，2.02 (m, 6H)，1.85 -
1.77 (m, 2H)，1.73 (t, J=12.0Hz, 1H) ?
[0069]( 4 )化學(xué)法合成內(nèi)酯三糖4
[0070]化合物3-疊氮丙基-[9-疊氮-5-乙酰氨基-3，5- 二脫氧_D_甘油-a -吡喃九碳酮糖酸-(I ” 一 4’)-內(nèi)酯]-(2 — 3) -0- P -D-吡喃半乳糖基-(I — 3) - P -D-2-乙酰氨基-2-脫氧-P -D-吡喃半乳糖苷4的合成
[0071]反應(yīng)方程式如圖13所示；
[0072]向50mL圓底燒瓶中加入化合物3(168mg)、醋酐(4.5mL)、吡啶(9mL)，冰浴條件下攪拌12h。薄層色譜跟蹤檢測(EA:Me0H=10:1)反應(yīng)完全后，旋蒸濃縮，之后向反應(yīng)液中加入2mL甲苯，旋蒸濃縮，反復(fù)進行3次。之后，通過快速柱分離，獲得白色化合物10 (200mg, 88%)。
[0073]向50mL圓底燒瓶中加入化合物10(107mg)、甲醇(5mL),室溫下攪拌溶解，再加入甲醇鈉，薄層色譜跟蹤(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.1)檢測反應(yīng)完成后，旋蒸濃縮，通過快速柱分離，獲得白色化合物4 (28.3mg, 37%)。參數(shù)如下:1HNMR (600MHz，D2O)8 5.23 (t, J=22.2Hz, 1H)，4.52 (d, J=7.8Hz, 1H)，4.46 (d, J=8.4Hz, 1H)，4.32-4.21 (m, 2H)，4.09 (d, J=2.8Hz, 1H), 4.00 - 3.48 (m, 20H), 3.43 - 3.37 (m, 1H)，3.33 (m, 2H)，2.55 (dd_，J=13.8，8.4Hz, 1H), 2.11-1.94 (m, 7H)，1.84 - 1.73 (m, 3H).[0074]( 5 )酶法法合成內(nèi)酯四糖5
[0075]化合物3-疊氮丙基-[9-疊氮-5-乙酰氨基-3，5_ 二脫氧_D_甘油-a -2-吡喃九碳酮糖酸_(1”一 4’)-內(nèi)酯]_(2 — 3)-0-0-D-吡喃半乳糖基-a — 3)-[(5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-D-甘油-P-D-吡喃九碳酮糖酸)_(2 — 6)]-^-D-2-乙酰氨基_2_脫氧-0 -D-吡喃半乳糖苷5的合成
[0076]反應(yīng)方程式如圖14所示；
[0077]向50mL離心管中加入由內(nèi)酯三糖受體4(20mg，0.026mmol)、胞苷二磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-Neu5Ac, 0.079mmol)、雙蒸水3mL,調(diào)節(jié)溶液pH值至中性，加入酶PdST (0.2Img)，加雙蒸水調(diào)節(jié)總體積為4mL，在37 V、140r/min條件下孵育2h。薄層色譜跟蹤(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.1)檢測反應(yīng)完成后，旋蒸濃縮，通過快速柱分離，獲得白色化合物 5 (24.6mg, 89%)。參數(shù)如下=1HNMR (600MHz, D2O) 8 5.22 (d, J=4.0Hz, IH),4.51 (m, J=8.4Hz, 1H)，4.44 (d, J=8.4Hz, 1H)，4.32 - 4.20 (m, 1H)，4.13 (m, 1H)，4.00 -
3.46 (m, 21H) , 3.4 3 - 3.26 (m, 3H) , 2.68 (dd, J=12.0，4.2Hz, 1H) , 2.55 (dd, J=13.8，5.4Hz, 1H)，1.99 (m, 6H)，1.84 - 1.71 (m, 3H)，1.64 (t, J=12.0Hz, 1H) ?
[0078]5.化學(xué)法合成雙 唾液酸四糖6
[0079]化合物3-疊氮丙基-[(9-疊氮-5-乙酰氨基-3，5_ 二脫氧_D_甘油-a -吡喃九碳酮糖酸)_(2 — 3)]-P-D-吡喃半乳糖基-(I — 3) [(5-乙酰氨基_3，5-二脫氧-D-甘油-a -吡喃九碳酮糖酸)-(2 — 6) ] - P -D-2-乙酰氨基-2-脫氧-P -D-吡喃半乳糖苷6的合成
[0080]反應(yīng)方程式如圖15所示；
[0081]向50mL 圓底燒瓶中加入化合物 5 (24.6mg, 0.023mmol)、ImolNaOH 溶液(ImL),攪拌4小時，薄層色譜(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.1)跟蹤檢測反應(yīng)完成后，加入Imol鹽酸中和反應(yīng)液，之后溶液過0.22 y m的微孔濾膜，通過Bio-gelP2凝膠分子排阻色譜進行組合純化，獲得純品化合物6(24.09mg, 96%)。參數(shù)如下=1HNMR(600MHz, D2O) 8 4.44(d, J=8.2Hz, 2H)，4.14 (d, J=2.8Hz, 1H), 4.06 - 3.98 (m, 1H), 3.98 - 3.42 (m, 26H)，3.37 -3.30 (m, 2H)，2.68 (ddd, J=17.2，12.6，4.6Hz, 2H), 2.07 - 1.92 (m, 7H)，1.85 - 1.72 (-m, 3H), 1.66 (t, J=12.2Hz, 1H) ?
【權(quán)利要求】
1.四糖MAG拮抗劑的合成方法，其特征在于:所述步驟如下: (1)利用化學(xué)法合成構(gòu)型的N-乙酰半乳糖胺，結(jié)構(gòu)如通式I所示，其中=R1為氫原子、a -或P -構(gòu)型絲氨酸殘基、a -或P -構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或Ct -或-構(gòu)型取代烷基； (2)利用“一鍋雙酶法”將通式I和半乳糖立體選擇性偶聯(lián)合成二糖GalP(1-3)GalNAcOR1，結(jié)構(gòu)如通式II所示，所述“一鍋雙酶法”中先后用到的酶分別為半乳糖激酶和己糖磷酸化酶；其中=R1為氫原子、a -或0 -構(gòu)型絲氨酸殘基、a -或P -構(gòu)型蘇氨酸殘基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或Ct -或-構(gòu)型取代烷基； (3)利用“一鍋雙酶法”合成三糖，結(jié)構(gòu)如通式III所示，所述“一鍋雙酶法”唾液酸化中用到的酶指CMP-唾液酸合成酶和a 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶；其中=R1為氫原子、a -或P -構(gòu)型絲氨酸殘基、a -或3 -構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或a -或P -構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮； (4)利用乙酰化和選擇性脫乙酰基的方法，合成含唾液酸衍生物的內(nèi)酯三糖，結(jié)構(gòu)如通式IV所示；其中=R1為氫原子、a -或P -構(gòu)型絲氨酸殘基、a -或P -構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或a-或3-構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮； (5)利用酶法合成內(nèi)酯四糖，所述酶法唾液酸化中用到的酶指a2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，結(jié)構(gòu)如通式V所示；其中=R1為氫原子、a-或P -構(gòu)型絲氨酸殘基、a-或P -構(gòu)型蘇氨酸殘基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或ct -或-構(gòu)型取代烷基；R2為氣原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R4為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R5為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或置氣；` (6)堿性水溶液中水解上述雙唾液酸化四糖的內(nèi)酯，得到四糖MAG拮抗劑，結(jié)構(gòu)如通式VI所示；其中=R1為氫原子、a -或P -構(gòu)型絲氨酸殘基、a -或0 -構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或a-或3-構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R4為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R5為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四糖MAG拮抗劑的合成方法，其特征在于:所述步驟(1)中的構(gòu)型的N-乙酰半乳糖胺采用以下方法合成:將半乳糖氨鹽酸鹽與醋酐進行反應(yīng)后，將其全部羥基用乙酰基保護；然后在微波條件下進行3 -構(gòu)型糖苷化反應(yīng)，然后依次疊氮化和脫保護后即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四糖MAG拮抗劑的合成方法，其特征在于:所述步驟(2)中的二糖Gal P (1-3) GalNAc O R1合成方法是:將化合物1、半乳糖(1.5-3.0當(dāng)量)、腺嘌呤核苷三磷酸(1.5-5.0 當(dāng)量)、MgCl2 (5-100mmol)、Tris-HCl 緩沖液(10-500mmol, pH5.0-10.0)配制水溶液，然后將反應(yīng)體系的PH值調(diào)節(jié)至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶和己糖磷酸化酶，待反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得二糖化合物II。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四糖MAG拮抗劑的合成方法，其特征在于:所述步驟(3)中的a 2，3唾液酸化二糖的合成方法:將化合物I1、唾液酸衍生物(1.5-5.0當(dāng)量)、胞苷三磷酸(0.5-10.0 當(dāng)量)、MgCl2 (5.0-1OOmmol)和 Tris-HCl 緩沖液(10-500mmol, pH5.0-10.5)配制水溶液，加入CMP-唾液酸合成酶和a 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶，實現(xiàn)“一鍋雙酶法”唾液酸化，反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得化合物III。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四糖MAG拮抗劑的合成方法，其特征在于:所述步驟(4)中內(nèi)酯三糖合成方法是:在冰浴的條件下，加入化合物II1、吡啶、醋酐，反應(yīng)5-24小時后旋蒸蒸干，拌入硅膠，柱分離純化，得到全乙酰化的化合物IV ;之后將全乙?；闹虚g體溶于甲醇，加入甲醇鈉粉末，使反應(yīng)體系的PH值保持在7-9，反應(yīng)5-10小時，然后柱分離純化即得化合物IV。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四糖MAG拮抗劑的合成方法，其特征在于:所述步驟(5)中四糖的合成方法是:將 化合物IV、CMP-唾液酸衍生物(1.5-5.0當(dāng)量)、MgCl2(5.0-1OOmmol)和Tris-HCl緩沖液(10-500mmol, pH5.0-10.5)配制水溶液，加入a 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，實現(xiàn)酶法唾液酸化，反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得化合物V。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四糖MAG拮抗劑的合成方法，其特征在于:所述步驟(6)中將化合物V溶于氫氧化鈉水溶液(0.1-1mol)中，反應(yīng)2-12小時，純化即可直接獲得化合物VI。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四糖MAG拮抗劑的合成方法，其特征在于:所述步驟(2)和步驟(3)中“一鍋雙酶法”合成中反應(yīng)溫度為0-37°C，轉(zhuǎn)速為0-240rpm ;所述酶反應(yīng)的停止方法是向反應(yīng)體系中加入與反應(yīng)液等體積的4°C無水乙醇并在4°C下培育0-30分鐘。
9.一種用于制備四糖MAG拮抗劑的中間體，其特征在于:結(jié)構(gòu)如通式IV所示，其中=R1為氫原子、a-或(6-構(gòu)型絲氨酸殘基、a-或(6-構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或a-或(6-構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氣基、羥基或置氣。
10.一種用于制備四糖MAG拮抗劑的中間體，其特征在于:結(jié)構(gòu)如通式V所示，其中=R1為氫原子、a-或(6-構(gòu)型絲氨酸殘基、a-或(6-構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或a-或(6-構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基、疊氮；R4為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R5為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮。
【文檔編號】C12P19/26GK103525888SQ201310508204
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】曹鴻志, 王鳳山, 孟欣 申請人:山東大學(xué)