一種黃龍病菌dna的快速提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黃龍病菌DNA快速提取方法，包括從感染黃龍病的柑橘葉片、根部、長春花葉片中依次通過冷凍抽干、研磨、加入適量NaOH和石英沙再次研磨、高速離心、無水乙醇沉淀幾個步驟將黃龍病菌的DNA分離。本發(fā)明簡便、安全、快速、成本低廉，提取的DNA溶液可直接用做巢式PCR和定量PCR檢測的模板，適用于感染黃龍病的柑橘葉片、根部、長春花葉片等各種組織中黃龍病菌DNA提取，同時本提取方法無需使用Tris飽和酚、氯仿等具有強(qiáng)腐蝕性試劑，可有效保證人身安全。
【專利說明】一種黃龍病菌DNA的快速提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種黃龍病菌DNA快速提取方法，適用于感染黃龍病的柑橘葉片、根部、長春花葉片等各種組織中黃龍病菌DNA提取。
【背景技術(shù)】
[0002]柑橘黃龍病又稱黃梢病，現(xiàn)已在世界上包括亞洲、非洲和美洲的40多個國家和地區(qū)發(fā)生與流行。我國種植柑橘的19個省中已有11個省(直轄市)的柑橘遭到黃龍病為害，受害面積占柑橘總的栽培面積的80%以上。該病害的病原菌是一種韌皮部桿菌屬細(xì)菌，可分為3個菌系，亞洲菌系Liberobacter asiaticus),非洲菌系(Cgflt/it/aiiAsLiberibacter africanus)和美洲菌系Liberobacteramercanus)。該病主要是通過嫁接及帶病苗木的進(jìn)行傳播,所以必然嚴(yán)格檢疫制度,杜絕和消滅病源是根本措施。目前，國內(nèi)外普遍利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法進(jìn)行柑橘黃龍病的檢測，主要有常規(guī)PCR、定量PCR和巢式PCR 3種檢測方法。但是無論用哪種PCR方法檢測，它都需要以黃龍病菌的DNA作為模板，首先要提取黃龍病菌DNA，而目前采用的提取方法均需使用Tris飽和酚和氯仿等具有強(qiáng)腐蝕性試劑，有可能危害人身安全，而且試驗成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是在減輕黃龍病菌DNA提取過程中對人體的傷害的基礎(chǔ)上提高效率，簡化提取步驟，為黃龍 病的PCR檢測提供有效保障。
[0004]為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種黃龍病菌DNA的快速提取方法，其特征在于:從感染黃龍病的柑橘葉片、根部、長春花葉片中依次通過冷凍抽干、研磨、加入適量NaOH和石英沙再次研磨、高速離心、無水乙醇沉淀幾個步驟將黃龍病菌的DNA分離。
[0005]具體包括以下步驟:
(1)取0.4g葉片中脈或根部樣品，剪碎后放入1.5mL離心管，冷凍抽干，用研磨儀磨成粉末；
(2)加入500μ L 0.5 M NaOH及適量石英沙，放置搖床上200轉(zhuǎn)/分鐘充分混勻I小時以上；
(3)沸水浴中放置30S，取出后加入500 μ L 0.5 M pH 8.0的Tris-HCl，顛倒混勻數(shù)次，12000 rpm 離心 10 min ；
(4)取上清液，加入2倍體積無水乙醇和1/10體積3M pH 5.2醋酸鈉沉淀核酸，-20°C放置0.5 h以上；
(5)12000 rpm 離心 10 min,棄上清；
(6)加入70%的乙醇清洗沉淀，12000rpm離心30 s,棄上清；
(7)重復(fù)步驟(6)—次;
(8)12000 rpm離心2 min,吸干后自然晾干,然后加入30~50 μ L TE bufer或ddH20溶解，即可得到黃龍病菌DNA。
[0006]本發(fā)明的有益效果是:通過在樣品中加入適量石英沙研磨加速黃龍病菌細(xì)胞裂解，使核酸充分釋放出來，從而有效提高黃龍病菌DNA得率；不同于常規(guī)DNA提取方法，無需使用Tris飽和酚和氯仿等具有強(qiáng)腐蝕性試劑，可有效保證人身安全，同時大大節(jié)約了試驗成本。
[0007]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為黃龍病菌DNA凝膠電泳檢測結(jié)果，其中M: marker, 1-17:不同感染黃龍病的柑橘葉片樣品，“_?，，..黃龍病菌DNA。
[0009]圖2為nest PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0010]
【具體實施方式】[0011]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不止限于此。
[0012]實施例1
供試樣品為福州市晉安區(qū)埔黨省農(nóng)科院果樹研究所試驗地采集的具有典型黃龍病癥狀的柑橘葉片，從中提取黃龍病菌DNA，具體操作如下:
(1)取0.4g葉片中脈，剪碎后放入1.5mL離心管，冷凍抽干，用研磨儀磨成粉末；
(2)加入500μ L 0.5 M NaOH及適量石英沙，放置搖床上200轉(zhuǎn)/分鐘充分混勻I小時以上；
(3)沸水浴中放置30S，取出后加入500 μ L 0.5 M pH 8.0的Tris-HCl，顛倒混勻數(shù)次，12000 rpm 離心 10 min ；
(4)取上清液，加入2倍體積無水乙醇和1/10體積3M pH 5.2醋酸鈉沉淀核酸，-20°C放置0.5 h以上；
(5)12000 rpm 離心 10 min,棄上清；
(6)加入70%的乙醇清洗沉淀，12000rpm離心30 s,棄上清；
(7)重復(fù)步驟(6)—次;
(8)12000rpm離心2 min,吸干后自然晾干,然后加入30~50 μ L TE bufer溶解，即可得到黃龍病菌DNA。
[0013]實驗結(jié)果:
(I)黃龍病菌DNA濃度檢測 提取的黃龍病菌DNA濃度檢測結(jié)果，見表1。
【權(quán)利要求】
1.一種黃龍病菌DNA的快速提取方法，其特征在于:從感染黃龍病的柑橘葉片、根部、長春花葉片中依次通過冷凍抽干、研磨、加入適量NaOH和石英沙再次研磨、高速離心、無水乙醇沉淀幾個步驟將黃龍病菌的DNA分離。
2.根據(jù)權(quán)利I要求所述的黃龍病菌DNA快速提取方法，其特征在于包括以下步驟: (1)取0.4g葉片中脈或根部樣品，剪碎后放入1.5mL離心管，冷凍抽干，用研磨儀磨成粉末； (2)加入500μ L 0.5 M NaOH及適量石英沙，放置搖床上200轉(zhuǎn)/分鐘充分混勻I小時以上； (3)沸水浴中放置30S，取出后加入500 μ L 0.5 M pH 8.0的Tris-HCl，顛倒混勻數(shù)次，12000 rpm 離心 10 min ； (4)取上清液，加入2倍體積無水乙醇和1/10體積3M pH 5.2醋酸鈉沉淀核酸，-20°C放置0.5 h以上； (5)12000 rpm 離心 10 min,棄上清； (6)加入70%的乙醇清洗沉淀，12000rpm離心30 s,棄上清； (7)重復(fù)步驟(6)—次; (8)12000 rpm離心2 min,吸干后自然晾干,然后加入30~50 μ L TE bufer或ddH20溶解，即可得到黃龍病菌DNA。
【文檔編號】C12R1/01GK103525808SQ201310510599
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月26日
【發(fā)明者】林雄杰, 范國成, 胡菡青, 蔡子堅, 阮傳清, 劉波 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所