一種無血清、無飼養(yǎng)層的多能干細胞培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種無血清、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)多能干細胞的新方法，該方法穩(wěn)定、可靠，能長期培養(yǎng)且維持多能干細胞的自我更新。本發(fā)明應(yīng)用無血清無飼養(yǎng)層化學(xué)成分明確的培養(yǎng)體系對多能干細胞進行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)15代后的干細胞的形態(tài)學(xué)、多能性標志分子的mRNA和蛋白表達，以及細胞染色質(zhì)核型分析均表明，該類新培養(yǎng)體系能在長期培養(yǎng)過程中維持多能干細胞的特性。此外，本發(fā)明還通過體外擬胚體形成實驗和體內(nèi)畸胎瘤形成實驗進一步驗證了經(jīng)15代懸浮培養(yǎng)后多能干細胞的分化潛能。
【專利說明】一種無血清、無飼養(yǎng)層的多能干細胞培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種無血清、無飼養(yǎng)層懸浮培養(yǎng)多能干細胞的體系和方法。具體地，本發(fā)明涉及使用無血清、無飼養(yǎng)層、化學(xué)成分明確的培養(yǎng)體系對多能干細胞進行懸浮培養(yǎng)的體系和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近幾十年來，干細胞生物學(xué)的研究推進了人們對于許多生物學(xué)基礎(chǔ)問題的認識，同時也促使人們探究許多疾病的細胞治療方法。自1981年Evans和Matthew Kaufman第一次發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細胞，胚胎干細胞研究一直是人們關(guān)注的焦點。此后，誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)的獲得使多能干細胞研究進入高潮。小鼠多能干細胞(包括小鼠胚胎干細胞和iPSCs)因具有無限增殖潛能和分化全能性，常常被用于研究人和哺乳動物細胞生長、分化和發(fā)育的最佳細胞模型；此外，由于多能干細胞在體內(nèi)、外的增殖和分化受各種特定信號的調(diào)控，人們可以在體外獲得大量由多能干細胞定向分化而來的組織特異型細胞，如心肌細胞、血液細胞、皮膚細胞、骨和肌肉細胞等，故其在臨床方面具有巨大潛在應(yīng)用價值，是一個有前景光明的研究領(lǐng)域。
[0003]若要有效使用多能干細胞進行基礎(chǔ)科學(xué)研究和臨床應(yīng)用，首先要保證能夠提供足夠數(shù)量的、高純度的均一細胞群體用于干細胞研究和臨床應(yīng)用。目前，未分化的多能干細胞是產(chǎn)生組織特異類型細胞的種子細胞來源，但現(xiàn)有的小鼠多能干細胞培養(yǎng)方法費時、費力，或不適合擴增或擴增后的細胞不純，導(dǎo)致其不能進行均一性分化。
[0004]目前維持小鼠多能干細胞培養(yǎng)的方法主要包括使用含血清、含飼養(yǎng)層或無血清、無飼養(yǎng)層的貼壁培養(yǎng)模式來進行的。但這些方法都有其自身缺點。首先，血清是一種成分極其復(fù)雜的外源物質(zhì)，在實驗和應(yīng)用中無法確定是血清中何種組分影響了細胞的行為，其次動物源性的血清和飼養(yǎng)層細胞的污染物會污染多能干細胞自身的應(yīng)用。此外，目前廣泛采用的貼壁培養(yǎng)方法需要在培養(yǎng)皿底部鋪基質(zhì)，一方面它增加了實驗的繁瑣性，也提高了細胞培養(yǎng)費用；另一方面，一些動物源性的基質(zhì)如動物明膠(gelatin)、層粘蛋白(Iaminin)和基質(zhì)膠(matrigel)等應(yīng)用在臨床上無法保證細胞的生物安全性和質(zhì)量控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、高效的多能干細胞培養(yǎng)體系，具體地，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)多能干細胞的培養(yǎng)基，以及使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)多能干細胞的方法。
[0006]一方面，本發(fā)明提供一種多能干細胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為無血清、無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)基，所述多能干細胞培養(yǎng)基包括100-2000單位/毫升的白血病抑制因子(LIF)，優(yōu)選地，所述白血病抑制因子為1000單位/毫升。
[0007]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為改良的N2B27完全培養(yǎng)基，包括按1:1的體積比混合的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以及體積百分比為所述培養(yǎng)基的I~2%的N2添加劑、體積百分比為所述培養(yǎng)基的I~2%的無維生素A添加的B27添加劑、以及100-2000單位/毫升的白血病抑制因子(LIF)。
[0008]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基還包括50~100毫摩爾/升的2-巰基乙醇、5~20微摩爾/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑(MAPK inhibitor)、10~50微摩爾/升的糖原合酶激酶抑制劑 3(GSK3 inhibitor)。
[0009]進一步優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基還包括50毫摩爾/升的2-巰基乙醇、10微摩爾/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑(MAPK inhibitor)、30微摩爾/升的糖原合酶激酶抑制劑3 (GSK3 inhibitor)。
[0010]優(yōu)選地，在配制前，使用二甲基亞砜(DMSO)將所述促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑和糖原合酶激酶抑制劑3稀釋為IOmM濃度的儲液。
[0011]其中，所述N2B27完全培養(yǎng)基源自2003年美國科學(xué)家首次應(yīng)用于小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)，但當前該培養(yǎng)基主要是應(yīng)用于維持貼壁狀態(tài)細胞的生長和分化，而且細胞培養(yǎng)的過程中需要貼壁生長在含動物源性基質(zhì)包被的培養(yǎng)皿上，基質(zhì)包括明膠、層粘蛋白等。
[0012]本申請使用的培養(yǎng)基添加了白血病抑制因子，并適當調(diào)整了促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑和糖原合酶激酶抑制劑3的配比。
[0013]其中，所述DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，可以購買商業(yè)化的培養(yǎng)基，也可以自行配制，在本申請的一個優(yōu)選的實施例中，所述DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司。
[0014]所述N2添加劑為N2神經(jīng)細胞生長添加劑，用于無血清培養(yǎng)神經(jīng)細胞，特別是神經(jīng)元細胞的生長。在本申請的一個優(yōu)選的實施例中，所述N2添加劑購自Gibco公司，貨號為17502-048。
[0015]所述B27添加劑為B27無血清培養(yǎng)基添加因子，通常用于海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元的生長和保持其短期或長期活性。在本申請的一個優(yōu)選的實施例中，所述B27添加劑購自Gibico公司，貨號為17504-044。
[0016]本發(fā)明還公開了所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)多能干細胞中的應(yīng)用。
[0017]優(yōu)選地，所述多能干細胞為小鼠多能干細胞。
[0018]優(yōu)選地，所述小鼠多能干細胞為小鼠胚胎干細胞。
[0019]另一方面，本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)多能干細胞的方法，所述方法包括以下步驟:
[0020]I)將多能性干細胞克隆使用胰蛋白酶消化，并吹散為單細胞懸液；優(yōu)選地，所述胰蛋白酶的濃度為0.05%~0.25% ；
[0021]優(yōu)選地，將細胞數(shù)為IX IO5~IX IO7的多能性干細胞克隆使用I~2毫升0.05%的胰蛋白酶在37°C下消化2分鐘，并吹散為單細胞懸液；
[0022]優(yōu)選地，所述多能性干細胞克隆為小鼠胚胎干細胞系Rl或小鼠胚胎成纖維細胞誘導(dǎo)的多能性干細胞克?。?br> [0023]2)使用胰蛋白酶抑制劑終止消化,然后加入PBS混合為細胞懸液,將懸液離心后，使用所述多能干細胞培養(yǎng)基重懸細胞，將得到的單細胞懸液接種于超低粘附培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0024]優(yōu)選地，所述胰蛋白酶抑制劑加入量與所述步驟I)中胰蛋白酶加入量相等；
[0025]優(yōu)選地，所述PBS加入量為所述步驟I)中胰蛋白酶加入量的4倍以上；[0026]優(yōu)選地，加入多能性干細胞培養(yǎng)基，使得所述單細胞懸液中單細胞的密度為
1.0XlO6L-1 ~1.0XlO9L-1 ；
[0027]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟2)為:在所述步驟I)中經(jīng)I~2毫升胰蛋白酶消化的多能干細胞克隆中加入I~2毫升胰蛋白酶抑制劑(T6414，Sigma)終止消化，再加入5~8毫升PBS，混合后將細胞懸液移入15毫升離心管中進行離心，離心后棄上清，用2毫升多能性干細胞培養(yǎng)基重懸細胞，將制得的單細胞懸液以1.ΟΧΙΟ7!/1~1.ΟΧΙΟ8!/1的密度接種于超低粘附6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入3-4毫升多能性干細胞培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0028]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)箱的條件為36_38°C、3_8% (體積比)CO2、濕度飽和；
[0029]更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)箱的條件為37°C、5% (體積比)CO2、濕度飽和；
[0030]3)每隔24-60小時更換一次培養(yǎng)基；
[0031]優(yōu)選地,更換培養(yǎng)基時間為48小時。
[0032]優(yōu)選地，所述更換培養(yǎng)基按照以下步驟進行:
[0033]更換培養(yǎng)基時，收集細胞球懸液至15毫升離心管中，采用800RPM離心轉(zhuǎn)速離心2分鐘，離心后棄上清，添加2毫升所述多能干細胞培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0034]4)將細胞傳代培養(yǎng)，將所述單細胞懸液培養(yǎng)3-4天后即可形成干細胞球，將所述干細胞球消化后按1.0X IO6L4~1.0X IO9I/1密度重新接種在新的超低粘附的6孔細胞培養(yǎng)板中，添加多能性干細胞進`行懸浮培養(yǎng)；
[0035]優(yōu)選地，所述傳代培養(yǎng)包括以下步驟:
[0036]a.將培養(yǎng)3-4天的干細胞球懸液移入15毫升離心管，采用800RPM離心轉(zhuǎn)速對細胞進行離心，離心后棄上清，使用PBS重懸再離心洗滌,然后用0.05%的胰蛋白酶消化2-5分鐘；優(yōu)選地，所述消化條件為37°C消化3分鐘；
[0037]優(yōu)選地，所述PBS加入量為5_8毫升,0.05%胰蛋白酶加入量為1-2毫升；
[0038]b.采用胰蛋白酶抑制劑(T6414，Sigma)終止消化，并吹打干細胞球以獲得單細胞懸液；加入PBS后，將上述單細胞懸液離心，棄上清后用新鮮的多能干細胞培養(yǎng)基重懸細胞，并按1.0X IO6L4~1.0X IO9I/1密度例將單細胞懸液重新接種于超低粘附的培養(yǎng)皿中；
[0039]優(yōu)選地，胰蛋白酶抑制劑加入量與上述胰蛋白酶加入量等同，所述細胞傳代的比例為按 1.0XlO7I/1 ~1.0XlO8I/1 密度；
[0040]優(yōu)選地，所述PBS加入量為所述胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制劑總量的3-5倍；
[0041]c.將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；
[0042]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)箱的條件為37°C、5% (體積比)CO2、濕度飽和；
[0043]d.重復(fù)步驟a-c連續(xù)傳代；
[0044]5)在傳3-4代后，細胞純化成高度均一的多能干細胞群；
[0045]優(yōu)選地，所述步驟4 )為:
[0046]a.將培養(yǎng)3-4天的干細胞球懸液移入15ml離心管，以800RPM離心收集細胞球，棄上清，添加PBS并在800RPM下再離心洗滌一次，細胞球沉淀后用0.05%~0.25%胰蛋白酶在37°C消化3~5min ；
[0047]優(yōu)選地:所述消化條件為濃度是0.05%的胰蛋白酶，溫度為37°C消化3分鐘。[0048]優(yōu)選地，所述PBS加入量為5-8毫升，0.05%胰蛋白酶加入量為1_2毫升。
[0049]b.采用胰蛋白酶抑制劑(T6414，Sigma)終止消化，并吹打細胞球以獲得單細胞懸液。添加適量PBS后，用1000RPM離心上述細胞懸液，棄上清后用新鮮的多能性干細胞培養(yǎng)基重懸細胞，并按按1.0X IO7I/1~1.0X IO8I/1密度將單細胞懸液重新接種于超低粘附的6孔細胞培養(yǎng)板中；
[0050]優(yōu)選地，所述PBS加入量為所述胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制劑總量的3-5倍。
[0051]c.將培養(yǎng)皿置于37°C、5% (體積比)CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；
[0052]d.將培養(yǎng)3-4天后的干細胞再次傳代。按照上述方法連續(xù)傳代；在傳3-4代后干細胞即可完全適應(yīng)無血清、無飼養(yǎng)層的懸浮培養(yǎng)體系，且可將含有雜細胞的細胞群純化成高度均一的多能干細胞群。
[0053]優(yōu)選地，所述單細胞在1-2天即可形成細胞球狀小克隆，3-4天細胞球進一步增大，形成直徑為80-150微米的干細胞球。
[0054]優(yōu)選地，所述多能干細胞為小鼠多能干細胞。
[0055]優(yōu)選地，所述小鼠多能干細胞為小鼠胚胎干細胞。
[0056]其中，所述胰蛋白酶百分比濃度的計算方法為:
[0057]百分比濃度=[胰蛋白酶質(zhì)量(克)/配制胰蛋白酶溶液所用體積(毫升)
[0058]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明利用了一種含有0CT4啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細胞系(0GR1)。該細胞系優(yōu)點在于表達0CT4的細胞在熒光顯微鏡下即可見綠色熒光，可用于實時追蹤0CT4的表達情況來判斷細胞的多能性狀態(tài)。
[0059]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0060]本發(fā)明選擇了化學(xué)成分明確的N2B27完全培養(yǎng)基和超低粘附的培養(yǎng)皿用于培養(yǎng)小鼠多能干細胞，建立了一種新型的小鼠多能干細胞培養(yǎng)體系。這種體系可以不需要利用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為滋養(yǎng)層細胞，同時也不需要利用到鋪有動物明膠或其它細胞外基質(zhì)的培養(yǎng)皿。而目前報道的傳統(tǒng)培養(yǎng)小鼠多能干細胞培養(yǎng)的方法主要包括使用含血清、含飼養(yǎng)層或無血清、無飼養(yǎng)層的貼壁培養(yǎng)模式來進行的。這些培養(yǎng)體系由于含有動物源性物質(zhì)，增加了實驗的不穩(wěn)定性和安全性，加大了實驗步驟的繁瑣。而本發(fā)明使用的小鼠多能干細胞培養(yǎng)體系和方法，其培養(yǎng)基成分明確，操作簡單，可懸浮培養(yǎng)小鼠多能干細胞，細胞能穩(wěn)定傳代15代以上，并能保持小鼠多能干細胞未分化狀態(tài)和多能性，維持干細胞自我更新和快速增殖能力。此外，本懸浮培養(yǎng)體系還可純化已經(jīng)部分分化的小鼠多能干細胞或作為小鼠多能細胞含其它雜細胞的純化方法，去除已分化的細胞或雜細胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0061]以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中:
[0062]圖1A是懸浮培養(yǎng)第15代的小鼠胚胎干細胞單細胞在明視場下的照片；B是懸浮培養(yǎng)第15代小鼠胚胎干細胞單細胞綠色熒光蛋白在激發(fā)光下顯示出綠色；C是懸浮培養(yǎng)第15代小鼠胚胎干細胞形成球狀克隆在明視場下照片；D是懸浮培養(yǎng)第15代小鼠胚胎干細胞形成球狀克隆在熒光顯微鏡激發(fā)下顯示綠色熒光照片。標尺=100um。
[0063]圖2是對懸浮培養(yǎng)第15代的小鼠胚胎干細胞球狀克隆堿性磷酸酶染色的照片，結(jié)果顯示球狀克隆堿性磷酸酶染色為陽性，表明細胞仍具有多能性。[0064]圖3是對長期懸浮培養(yǎng)后小鼠胚胎干細胞進行多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平表達PCR鑒定照片。結(jié)果顯示與傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)一樣，懸浮培養(yǎng)的干細胞高表達0ct4、Sox2、Nanog、Esgl、Rexl和Utfl多能性基因，Actin為持家基因。
[0065]圖4是對懸浮培養(yǎng)第15代的小鼠胚胎干細胞進行多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子0CT4、S0X2和NANOG蛋白水平表達免疫熒光染色照片。結(jié)果顯示長期懸浮培養(yǎng)后的小鼠胚胎干細胞高表達0CT4、S0X2和NAN0G。其中標尺=50 μ m。
[0066]圖5是對懸浮培養(yǎng)第15代的小鼠胚胎干細胞進行染色質(zhì)核型分析的照片。結(jié)果顯示長期懸浮培養(yǎng)后小鼠胚胎干細胞核型正常，染色體數(shù)為2n=40條。
[0067]圖6是對懸浮培養(yǎng)第15代的小鼠胚胎干細胞進行體外EB形成實驗。結(jié)果顯示長期懸浮培養(yǎng)后小鼠胚胎干細胞能形成EB。
[0068]圖7是對懸浮培養(yǎng)第15代的小鼠胚胎干細胞進行體內(nèi)注射驗證畸胎瘤的形成實驗。A是長期懸浮培養(yǎng)后的小鼠胚胎干細胞在裸鼠體內(nèi)形成的畸胎瘤，B-F是畸胎瘤石蠟切片進行的HE染色圖片。
[0069]圖8是傳統(tǒng)的含血清含飼養(yǎng)層貼壁培養(yǎng)方法和無血清無滋養(yǎng)層細胞懸浮培養(yǎng)方法培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞克隆。A是貼壁培養(yǎng)第10代小鼠胚胎干細胞克隆明視場下的照片，B是貼壁培養(yǎng)第10代小鼠胚胎干細胞克隆綠色熒光蛋白在激發(fā)光下顯示出綠色。C是懸浮培養(yǎng)第10代小鼠胚胎干細胞克隆明視場下的照片，D是懸浮培養(yǎng)第10代小鼠胚胎干細胞克隆綠色熒光蛋白在激發(fā)光下顯示出綠色。
【具體實施方式】
[0070]現(xiàn)結(jié)合實施例，對本發(fā)明做進一步闡述，但本發(fā)明的實施并不僅限于此。除非特別說明，本發(fā)明使用的小鼠胚胎干細胞購自美國伊利諾伊大學(xué)。
[0071]除非特別指明，以下實施例中所用的試劑均為分析純級試劑，且可從正規(guī)渠道商購獲得。
[0072]實施例1:無飼養(yǎng)層無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)基的制備
[0073]培養(yǎng)基的制備
[0074]本申請使用DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurolbasal培養(yǎng)基、N2添加劑、B27添加劑、2_巰基乙醇(2-Mercaptoethanol)、白血病抑制因子(LIF)、促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑(Stemolecule?PD0325901)、糖原合酶激酶抑制劑 3 (Stemolecule? CHIR99021)來配制。
[0075]其中，培養(yǎng)基的各組分分別購自:
[0076]DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司，貨號為11320-082 ；
[0077]Neurolbasal 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司，貨號為 21103-049 ；
[0078]N2添加劑購自Gibco公司，貨號為17502-048 ；
[0079]B27添加劑購自Gibco公司，貨號為12587-010 ；
[0080]2-巰基乙醇購自Gibco公司，貨號為21985-23 ；
[0081]白血病抑制因子購自Milipore公司，貨號為ESG1107 ；
[0082]促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑(Stemolecule? Η)0325901)購自Stemgene公司，貨號為04-0006 ；
[0083]糖原合酶激酶抑制劑3 (Stemolecule? CHIR99021)購自Stemgene公司，貨號為04-0004。
[0084]配制本發(fā)明所述的培養(yǎng)基。其中促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑和糖原合酶激酶抑制劑3分別為固態(tài)粉末狀，使用前需要用二甲基亞砜(DMSO)進行溶解粉末，使其稀釋成IOmM濃度的儲液。
[0085]具體地，所述培養(yǎng)基通過以下方法配制:
[0086]首先將向DMEM/F12基本培養(yǎng)基和Neurobasal基本培養(yǎng)基按1:1混合，攪拌均勻后，在混合后的基本培養(yǎng)基中添加以下因子，各種因子的最終濃度為:體積百分比為1%的N2添加劑，體積百分比為1%的B27添加劑，50毫摩爾/升的2-巰基乙醇，1000單位/毫升的白血病抑制因子(LIF)，10微摩爾/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑(MAPKinhibitor), 30微摩爾/升的糖原合酶激酶抑制劑3 (GSK3 inhibitor)。
[0087]各種因子的添加無嚴格的順序，在常溫操作即可，配制的過程無需加熱，但培養(yǎng)基整個制備過程需在無菌條件下進行。
[0088]或，所述培養(yǎng)基通過以下方法配制:
[0089]首先將向DMEM/F12基本培養(yǎng)基和Neurobasal基本培養(yǎng)基按1:1混合，攪拌均勻后，在混合后的基本培養(yǎng)基中添加以下因子，各種因子的最終濃度為:體積百分比為2%的N2添加劑，體積百分比為2%的B27添加劑，100毫摩爾/升的2-巰基乙醇，100單位/毫升的白血病抑制因子(LIF)，20微摩爾/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑(MAPKinhibitor), 50微摩爾/升的糖原合酶激酶抑制劑3 (GSK3 inhibitor)。
[0090]各種因子的添加無嚴格的順序，在常溫操作即可，配制的過程無需加熱，但培養(yǎng)基整個制備過程需在無菌條件下進行；
`[0091]或，所述培養(yǎng)基通過以下方法配制:
[0092]首先將向DMEM/F12基本培養(yǎng)基和Neurobasal基本培養(yǎng)基按1:1混合，攪拌均勻后，在混合后的基本培養(yǎng)基中添加以下因子，各種因子的最終濃度為:體積百分比為1%的N2添加劑，體積百分比為2%的B27添加劑，50毫摩爾/升的2-巰基乙醇，2000單位/毫升的白血病抑制因子(LIF)，5微摩爾/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑(MAPKinhibitor), 10微摩爾/升的糖原合酶激酶抑制劑3 (GSK3 inhibitor)。
[0093]各種因子的添加無嚴格的順序，在常溫操作即可，配制的過程無需加熱，但培養(yǎng)基整個制備過程需在無菌條件下進行。
[0094]實施例2小鼠胚胎干細胞的懸浮培養(yǎng)
[0095]本實施例采用的是0CT4-GFP小鼠胚胎干細胞系(OGRl)(購自美國伊利諾伊大學(xué))，可通過檢測綠色熒光信號表達強度直觀判斷胚胎干細胞多能性。
[0096]首先，將于傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的小鼠多能性干細胞克隆采用0.05%胰蛋白酶在37°C下消化2分鐘，將克隆團塊吹打成單細胞。
[0097]然后，將制得的單細胞懸液以Ι.ΟΧΙΟ7!/1~1.0X IO8L4的密度接種于超低吸附培養(yǎng)皿中，置于37°C、5% (體積比)CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞每隔48小時換一次液，換液時，收集細胞懸液至15ml離心管中，以800RPM (轉(zhuǎn)/分鐘)離心3分鐘，棄上清后添加新鮮的培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。小鼠胚胎干細胞細胞懸液在懸浮培養(yǎng)1-2天后，在光學(xué)顯微鏡下可見一些小的類似神經(jīng)球狀的球體形成，3-4天后球體增大,此時球體直徑可達到80-150 μ m，且每個球狀克隆內(nèi)細胞排列緊密。[0098]實施例3小鼠胚胎干細胞的傳代培養(yǎng)
[0099]將實施例2中培養(yǎng)3-4天的小鼠胚胎干細胞OGRl消化后按一定的細胞密度重新接種在新的超粘附的皿中，添加N2B27完全培養(yǎng)及進行懸浮培養(yǎng)。
[0100]具體地:
[0101](I)將實施例2中擴增后的球形細胞懸液移入15ml離心管，以800RPM離心收集細胞球，棄上清，添加PBS并在800RPM下再離心洗滌一次，細胞球沉淀后用0.05%胰蛋白酶在37°C 消化 2 ~3min。 [0102](2)采用胰蛋白酶抑制劑(T6414，Sigma)終止消化，并吹打細胞球以獲得單細胞懸液。添加適量PBS后，用1000RPM離心上述細胞懸液，棄上清后用新鮮的培養(yǎng)基重懸細胞，并按1.0X IO7I/1~1.0X IO8I/1的密度將單細胞懸液重新接種于超低粘附的培養(yǎng)皿中。37°C、5% (體積比)CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)3-4天后的OGRl細胞又可再次傳代。按照上述方法連續(xù)傳代。在傳3-4代后OGRl細胞即可完全適應(yīng)無血清、無飼養(yǎng)層的懸浮培養(yǎng)體系，且可將含有雜細胞的細胞群完全純化成高度均一的多能干細胞群。
[0103]實施例4小鼠胚胎干細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和綠色熒光蛋白表達鑒定
[0104]倒置熒光纖維鏡檢測OGRl細胞形態(tài)和綠色熒光蛋白的表達將實施例2中制得的單細胞懸液和實施例3中培養(yǎng)成球狀的干細胞克隆置于倒置熒光顯微鏡(顯微鏡型號:Nikon ECLIPSE Ti，購自NIKON公司)下觀察細胞形態(tài)及綠色熒光蛋白表達情況。觀察時，發(fā)綠色熒光的細胞即為表達0CT4的陽性細胞或球狀克隆，可以通過觀察細胞綠色熒光蛋白的表達情況初步確定細胞的多能性狀態(tài)。結(jié)果見圖1。
[0105]其中，圖1A是懸浮培養(yǎng)第15代小鼠胚胎干細胞單細胞懸液在明視場下的照片；B是懸浮培養(yǎng)第15代小鼠胚胎干細胞單細胞懸液綠色熒光蛋白在激發(fā)光下顯示出綠色；(:是懸浮培養(yǎng)第15代小鼠胚胎干細胞形成球狀克隆在明視場下照片；D是懸浮培養(yǎng)第15代小鼠胚胎干細胞形成球狀干細胞克隆在熒光顯微鏡激發(fā)下顯示綠色熒光照片。
[0106]結(jié)果表明，使用本發(fā)明的無血清、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系和懸浮培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)15代的小鼠胚胎干細胞保持均質(zhì)細胞形態(tài)，可以檢測到多能性標志分子0CT4的表達。
[0107]實施例5小鼠胚胎干細胞的堿性磷酸酶染色鑒定
[0108]將實施例3中懸浮培養(yǎng)15代的小鼠胚胎干細胞球狀克隆移入15ml離心管，以800RPM離心收集細胞球，棄上清，添加適當?shù)男迈r培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞球的濃度在每毫升液體含500~1000個干細胞球，將用多聚賴氨酸包被過的顯微鏡載玻片安裝于甩片機的轉(zhuǎn)頭后(離心機型號:CytoSpin3，購自美國SHAND0N)，加入0.05ml細胞懸液，室溫下1000RPM離心lmin。離心后可見載玻片上有貼壁的細胞球。將載玻片置于空氣中干燥5min，干燥后加入4%多聚甲醛(PFA)進行固定，PBS洗滌1_2遍，然后加入堿性磷酸酶底物BCIP/NBT顯示液(ZL1-9041，購買自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，染色詳細步驟見其說明書。染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。檢測結(jié)果見圖2。
[0109]結(jié)果表明，使用本發(fā)明的無血清、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系和懸浮培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)15代的小鼠胚胎干細胞球狀克隆顯示堿性磷酸酶染色陽性。
[0110]實施例6小鼠胚胎干細胞多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平表達鑒定
[0111]收集實施例3中懸浮培養(yǎng)后的干細胞樣品進行mRNA水平的檢測，參照文獻 Chen Q, Zhang Y, Peng H, Lei L, Kuang H, Zhang L, Ning L, Cao Y, DuanE.Transient{beta}2-adrenoceptor activation confers pregnancy lossby disrupting embryo spacing at implantation.J Biol Chem.2011 Feb11； 286 (6):4349-56中描述的TRIzol提取RNA方法及RT-PCR步驟。實驗中分別收集實施例3中懸浮培養(yǎng)第10代和第15代的小鼠胚胎干細胞球狀克隆，并提取其總mRNA，通過普通RT-PCR進行鑒定。實驗中所使用的引物序列見表1，即國際上公認的小鼠胚胎干細胞常用多能性標志分子的基因。多能性標志分子分別為0ct4、Sox2、Nanog、Esgl、Rexl和Utfl等，以持家基因Actin的表達作為內(nèi)參。
[0112]結(jié)果表明與傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)一樣，懸浮培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞高表達0ct4、Sox2、Nanog、Esgl、Rexl 和 Utfl 多能性基因。
[0113]表1 RT-PCR弓丨物序列
[0114]
【權(quán)利要求】
1.一種多能干細胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為無血清、無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)基，其特征在于，所述多能干細胞培養(yǎng)基包括100-2000單位/毫升的白血病抑制因子(LIF)， 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基包括按1:1的體積比混合的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以及體積百分比為所述培養(yǎng)基的I~2%的N2添加劑、體積百分比為所述培養(yǎng)基的I~2%的無維生素A添加的B27添加劑、以及100-2000單位/毫升的白血病抑制因子(LIF)； 優(yōu)選地，所述白血病抑制因子為1000單位/毫升。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多能干細胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基還包括50~100毫摩爾/升的2-巰基乙醇、5~20微摩爾/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑、10~50微摩爾/升的糖原合酶激酶抑制劑3 ； 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基還包括50毫摩爾/升的2-巰基乙醇、10微摩爾/升的促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑、30微摩爾/升的糖原合酶激酶抑制劑3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多能干細胞培養(yǎng)基，其中，所述促分裂素原活化蛋白激酶抑制劑和糖原合酶激酶抑制劑3使用二甲基亞砜稀釋為IOmM濃度的儲液。
4.一種多能干細胞的培養(yǎng)方法，所述方法包括以下步驟: 1)將多能性干細胞克隆使用胰蛋白酶消化，并吹散為單細胞懸液； 優(yōu)選地，所述胰蛋白酶的濃度為0.05%~0.25% ； 優(yōu)選地，將細胞數(shù)為I X IO5~I X IO7的多能性干細胞克隆使用I~2毫升0.05%的胰蛋白酶在37°C下消化2分鐘，并吹散為單細胞懸液； 2)使用胰蛋白酶抑制劑終止消化，然后加入PBS混合為細胞懸液，將細胞懸液離心后，使用如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多能干細胞培養(yǎng)基重懸細胞，將得到的單細胞懸液接種于超低粘附培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 優(yōu)選地，所述胰蛋白酶抑制劑加入量與所述步驟I)中胰蛋白酶加入量相等； 優(yōu)選地，所述PBS加入量為步驟I)中胰蛋白酶加入量的4倍以上； 優(yōu)選地，加入如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多能性干細胞培養(yǎng)基，使得所述單細胞懸液中單細胞的密度為Ι.ΟΧΙΟ6!/1~l.0XlO9!/1 ； 3)每隔24-60小時更換一次培養(yǎng)基； 優(yōu)選地，更換培養(yǎng)基時間為48小時； 優(yōu)選地，所述更換培養(yǎng)基按照以下步驟進行: 更換培養(yǎng)基時，收集細胞球懸液至15毫升離心管中，采用800RPM離心轉(zhuǎn)速離心2分鐘，離心后棄上清，添加2毫升如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多能干細胞培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)； 4)將細胞傳代培養(yǎng)，將所述單細胞懸液培養(yǎng)3-4天后既可形成干細胞球，將所述干細胞球消化后按1.0X IO6L-1~1.0X IO9L-1密度接種在新的超低粘附的6孔細胞培養(yǎng)板中，添加如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多能性干細胞培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng)； 5)在傳3-4代后，細胞純化成高度均一的多能干細胞群。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述步驟2)為:在所述步驟I)中經(jīng)I~2毫升胰蛋白酶消化的多能干細胞克隆中加入I~2毫升胰蛋白酶抑制劑終止消化，再加入5~8毫升PBS，混合后將細胞懸液移入15毫升離心管中進行離心，離心后棄上清，用2毫升如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多能干細胞培養(yǎng)基重懸細胞，將制得的單細胞懸液以1.0X10V1~1.0X IO8L4的密度接種于超低粘附6孔培養(yǎng)板中，每孔加入3_4毫升如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多能干細胞培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)箱的條件為36-38°C、3-8% (體積比)CO2、濕度飽和； 更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)箱的條件為37°C、5% (體積比)CO2、濕度飽和。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，所述步驟4)的傳代培養(yǎng)包括以下步驟: a.將培養(yǎng)3-4天的干細胞球懸液移入15毫升離心管，采用800RPM離心轉(zhuǎn)速對細胞進行離心，離心后棄上清，使用PBS重懸再離心洗滌，然后用胰蛋白酶消化2-5分鐘； b.采用胰蛋白酶抑制劑終止消化，并吹打干細胞球以獲得單細胞懸液；加入PBS后，將上述單細胞懸液離心，棄上清后用如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多能干細胞培養(yǎng)基重懸細胞，并按1.0X10V1~1.ΟΧΙΟ8!/1密度比例將單細胞懸液重新接種于超低粘附的培養(yǎng)皿中； c.將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)； 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)箱的條件為37°C、5% (體積比)CO2、濕度飽和； d.重復(fù)步驟a-c連續(xù)傳代； 優(yōu)選地，所述步驟4)為: a.將培養(yǎng)3-4天的干細胞球懸液移入15ml離心管，以800RPM離心收集細胞球，棄上清，添加PBS并在800RPM下再離心洗滌一次，細胞球沉淀后用0.05%~0.25%胰蛋白酶在37°C消化3~5分鐘； 優(yōu)選地，所述消化條件為濃度是0.05%的胰蛋白酶，溫度為37°C消化3分鐘； b.采用胰蛋白酶抑制劑終止消化，并吹打細胞球以獲得單細胞懸液；添加PBS后，用1000RPM離心上述細胞懸液，棄上清后用如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多能干細胞培養(yǎng)基重懸細胞，并按1.ΟΧΙΟ7!/1~1.ΟΧΙΟ8!/1密度比例將單細胞懸液重新接種于超低粘附的培養(yǎng)皿中； c.將培養(yǎng)皿置于37°C、5%(體積比)CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)； d.將培養(yǎng)3-4天后的干細胞球重復(fù)a-c的步驟再次傳代。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項所述的方法，其中所述單細胞懸液為經(jīng)胰蛋白酶消化后的貼壁培養(yǎng)小鼠多能性干細胞克隆和飼養(yǎng)層細胞懸液。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項所述的方法，其中所述多能性干細胞克隆為小鼠胚胎干細胞系Rl或小鼠胚胎成纖維細胞誘導(dǎo)的多能性干細胞克隆。
9.一種培養(yǎng)多能干細胞的培養(yǎng)體系,其中所述體系包括權(quán)利要求1-3中任一項所述的培養(yǎng)基和/或權(quán)利要求5-8中任一項所述的方法。
10.權(quán)利要求1-3所述的培養(yǎng)基和權(quán)利要求4-8所述的方法以及權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)體系在培養(yǎng)多能干細胞中的應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述多能干細胞為小鼠多能干細胞； 優(yōu)選地，所述小鼠多能干細胞為小鼠胚胎干細胞。
【文檔編號】C12N5/0735GK103555661SQ201310511821
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】段恩奎, 雷曉華, 鄧智利 申請人:中國科學(xué)院動物研究所