一種以紅松籽粕為原料制備免疫活性肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明的一種以紅松籽粕為原料制備免疫活性肽的方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品精深加工及其副產(chǎn)物綜合利用的【技術(shù)領(lǐng)域】。經(jīng)過原料預(yù)處理、復(fù)合酶可控酶解、膜分離、減壓濃縮、真空冷凍干燥過程，獲得分子量為3000～10000Da、蛋白質(zhì)含量為92%～96%、水分2%～4%、灰分為0.5%～1.5%，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.40～0.60、NK細(xì)胞活性為45%～65%的紅松籽粕免疫活性肽，并使用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及NK細(xì)胞活性測(cè)定進(jìn)行免疫活性評(píng)價(jià)。本發(fā)明所選用的紅松籽粕源于長(zhǎng)白山紅松籽冷壓榨法榨油后產(chǎn)生的副產(chǎn)物，未接觸任何有機(jī)提取溶劑，方便有效地分離出一種紅松籽粕免疫活性肽，保存了長(zhǎng)白山紅松籽原有的品質(zhì)及功能。
【專利說明】一種以紅松籽粕為原料制備免疫活性肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品精深加工及其副產(chǎn)物綜合利用的【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法，獲得分子量為3000~lOOOODa、蛋白質(zhì)含量為92.0%~ 96.0%、含水量2.0%~4.0%、灰分為0.5%~1.5%,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.40~0.60,NK細(xì)胞活性為45%~65%的紅松籽柏免疫活性肽。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)紅松籽生產(chǎn)歷史悠久，是出口紅松籽的主要國(guó)家，長(zhǎng)白山是紅松籽的主產(chǎn)區(qū)， 具有得天獨(dú)厚的紅松籽資源優(yōu)勢(shì)，紅松籽種仁大，產(chǎn)量高，因其生長(zhǎng)于無污染的自然環(huán)境中，大都屬于有機(jī)或綠色食品，品質(zhì)也久富盛名。但是，我國(guó)的紅松籽生產(chǎn)，目前仍處于采集野生資源的階段，產(chǎn)品初加工多，產(chǎn)品開發(fā)程度低。所以，如何發(fā)揮長(zhǎng)白山天然資源優(yōu)勢(shì)，提高紅松籽精深加工產(chǎn)品的科技含量，用以創(chuàng)造最大經(jīng)濟(jì)效益具有十分重要的意義。
[0003]紅松籽蛋白是一種良好的食源性功能肽來源。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，紅松籽蛋白中含有19 種氨基酸，分別是異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、門冬酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、精氨酸、纈氨酸、組氨酸、門冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸和絲氨酸，其中，含有8種人體必需氨基酸。將這19種氨基酸的含量與WHO(國(guó)際衛(wèi)生組織)和FAO(聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織)氨基酸人體必需量的標(biāo)準(zhǔn)值對(duì)比，得出紅松籽蛋白的氨基酸含量與國(guó)際規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)十分接近，其中異亮氨酸、苯丙氨酸的含量均高于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。此外，谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸含量也較高，它們對(duì)人體的生理作用有著重要功能。
[0004]目前，國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)主要集中于紅松籽油脂的功能活性，開發(fā)紅松籽飲料產(chǎn)品，而對(duì)于紅松籽柏活性肽的研究與開發(fā)鮮有報(bào)道。且在紅松籽油脂提取過程中，副產(chǎn)物多數(shù)被當(dāng)作廢棄物處理，因此，研究紅松籽柏活性肽，對(duì)于提高紅松籽產(chǎn)品附加值，開發(fā)紅松籽柏活性肽系列功能性食品，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)收益意義重大。
[0005]免疫活性肽 是指一類存在于生物體內(nèi)具有免疫功能的活性肽，這種肽在體內(nèi)一般含量較低，結(jié)構(gòu)多樣，是一種細(xì)胞信號(hào)傳遞物質(zhì)。免疫活性肽的研究始于1981年，Jolles等首次用用胰蛋白酶水解人乳蛋白，能增強(qiáng)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞對(duì)綿羊紅細(xì)胞的吞噬作用。目前，已有的報(bào)道中表明，不同生物學(xué)功能的免疫活性肽，如抗血栓轉(zhuǎn)化酶抑制肽、酪蛋白磷酸肽、抗菌肽等，能夠刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)巨嗜細(xì)胞的吞噬功能，但既有研究中， 未見過采用天然優(yōu)質(zhì)紅松籽柏進(jìn)行免疫活性肽相關(guān)研究。因此，以紅松籽柏為基礎(chǔ)，分離制備免疫活性肽，進(jìn)而評(píng)價(jià)其體內(nèi)相關(guān)免疫活性，對(duì)食物蛋白來源免疫活性肽的相關(guān)研究意義重大，同時(shí)為提高紅松籽產(chǎn)品附加值，開發(fā)輔助提高免疫力產(chǎn)品，奠定了研究基礎(chǔ)，并產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。
[0006]本申請(qǐng)發(fā)明專利的技術(shù)優(yōu)勢(shì)分析
[0007]第一，本專利所采用的原料來源廣泛、天然、無污染，易獲取，成本低。紅松籽柏源于長(zhǎng)白山紅松籽冷壓榨法榨油后產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其特征在于未接觸任何有機(jī)提取溶劑，保存了長(zhǎng)白山紅松籽蛋白的原有的品質(zhì)及功能。[0008]第二，本發(fā)明采用復(fù)合酶可控酶解技術(shù)，膜分離技術(shù)方便有效地分離出一種紅松籽柏免疫活性肽，并使用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及NK細(xì)胞活性測(cè)定進(jìn)行免疫活性評(píng)價(jià)；
[0009]( I)本發(fā)明使用復(fù)合酶對(duì)紅松籽柏進(jìn)行酶解，獲得了紅松籽柏酶解液，實(shí)現(xiàn)了對(duì)紅松籽優(yōu)質(zhì)蛋白資源的有效增值利用；
[0010](2)采用膜分離技術(shù)方便有效地分離出一種3000~lOOOODa、蛋白質(zhì)含量為 92.0%~96.0%、含水量2.0%~4.0%、灰分為0.5%~1.5%，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.40~0.60、 NK細(xì)胞活性為45%~65%的紅松籽柏免疫活性肽；
[0011](3)本專利采用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化法作為一種紅松籽柏免疫活性肽的衡量指標(biāo)，經(jīng)測(cè)定，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.40~0.60 ;
[0012](4)本專利采用NK細(xì)胞活性測(cè)定法作為一種紅松籽柏免疫活性肽的衡量指標(biāo)，以 YAC-1為細(xì)胞模型，以受試小鼠脾細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)定，NK細(xì)胞活性為45%~65%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題:公開一種以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法，是以紅松籽柏為原料，經(jīng)過原料預(yù)處理、復(fù)合酶可控酶解、膜分離、減壓濃縮、真空冷凍干燥過程，獲得分子量為3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0015]1.一種以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法，其特征在于，是以蛋白質(zhì)含量為30%~40%，脂肪含量為15%~25%，淀粉含量為25%~35%，水分含量為2%~4%，灰分含量為5%~7%的紅松籽柏為原料，經(jīng)過原料預(yù)處理、復(fù)合酶可控酶解、膜分離、減壓濃縮、 真空冷凍干燥過程，獲得分子量為3000~lOOOODa、蛋白質(zhì)含量為92.0%~96.0%、水分含量2.0%~4.0%、灰分含量為0.5%~1.5%，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.40~0.60,NK細(xì)胞活性為 45%~65%的紅松籽柏免疫活性肽；
[0016]1)所述的原料預(yù)處理過程，是指以蛋白質(zhì)含量為30%~40%，脂肪含量為15%~ 25%，淀粉含量為25%~35%，水分含量為2%~4%，灰分含量為5%~7%的紅松籽柏為原料， 在室溫條件下，按照紅松籽柏與水的比例為3: 100g/mL~10: 100g/mL范圍內(nèi)進(jìn)行混合， 浸泡12~20h后；再利用超聲波儀處理物料混合液，超聲功率為100~300W，超聲時(shí)間為 5~35min，再將超聲后的樣液置于儲(chǔ)存罐中，4°C存放20~60min，剝離凝固的紅松籽油脂層，獲得超聲處理液，備用；
[0017]2)所述的復(fù)合酶可控酶解過程，是指將超聲處理液置于反應(yīng)罐中，啟動(dòng)攪拌器將轉(zhuǎn)速設(shè)置為20~30r/min，同時(shí)加熱升溫使其內(nèi)料液溫度為85~95°C，保溫時(shí)間為 10~15min，將反應(yīng)罐中料液溫度降低至35~45°C后，保持恒溫和攪拌狀態(tài)，利用8.0~
10.0mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整反應(yīng)罐中料液pH為5.5~8.5 ;將木瓜蛋白酶與中性蛋白酶按照比例為1: 2~1: 10投入反應(yīng)罐中，控制其底物濃度為6%~12%，使用8~IOmol/ L的氫氧化鈉溶液使反應(yīng)罐中料液的pH為5.5~8.5 ;控制酶解溫度為35~45°C，酶解時(shí)間為1.5~3.5h，酶解結(jié)束后，將反應(yīng)罐中紅松籽柏酶解液迅速升溫至90~95°C時(shí)，保溫 10~30min后，冷卻至5~20°C，將冷卻后的酶解液進(jìn)行離心處理，離心溫度為0~4°C，轉(zhuǎn)速為8000~10000r/min，離心時(shí)間為10~20min，收集上清液，獲得紅松籽柏酶解物離心液；[0018]3)所述的膜分離過程，是指將紅松籽柏酶解物離心液進(jìn)行膜分離處理，膜分截流量為3000~lOOOODa，調(diào)控進(jìn)口壓力為10~30psi，回流壓力為5~20psi，流速為1.0~
2.0mL/min，收集膜下液，獲得分子量為3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽液；
[0019]4)所述的減壓濃縮過程，是指將3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽液，置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，控制轉(zhuǎn)速為1000~1500rpm,溫度45~65°C,濃縮至初始體積的1/3~ 1/8，收集獲得分子量為3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽濃縮液，冷卻至5~15°C備用；
[0020]5)所述的真空冷凍干燥過程，是指將5~15°C的3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽濃縮液，分裝于400X 200mm的冷凍盤中，厚度為3~5mm ;然后置于預(yù)凍溫度為-40~_30°C冷凍庫(kù)中，預(yù)凍時(shí)間為0.5~1.5h后，再移至真空冷凍干燥機(jī)中，制冷溫度設(shè)定為-60~-50°C，真空度壓力設(shè)定為20~60Pa，凍干時(shí)間為8~15h，獲得一種分子量為 3000~lOOOODa、蛋白質(zhì)含量為92.0%~96.0%、含水量2.0%~4.0%、灰分為0.5%~1.5%, 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.40~0.60、NK細(xì)胞活性為45%~65%的紅松籽柏免疫活性肽。
[0021]2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法，其特征在于，是以長(zhǎng)白山紅松籽為原料，通過冷壓榨技術(shù)處理后，獲得的紅松籽柏固體，原料的蛋白質(zhì)含量為30%~40%，脂肪含量為15%~25%，淀粉含量為25%~35%，水分含量為2%~ 4%,灰分含量為5%~Tl。
[0022]3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法，其特征在于，原料預(yù)處理過程，水是PH為7.0的去離子水。
[0023]4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法的超聲波提取水溶性蛋白過程，其特征在于，所述的利用超聲波儀處理物料混合液，是利用高能超聲波破碎細(xì)胞，控制功率為100~300W，溫度為35~45°C，處理時(shí)間25~35min。
[0024]5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法的復(fù)合酶可控酶解過程，其特征在于，所述的木瓜蛋白酶與中性蛋白酶，酶活`力均為20萬u/g。
[0025]6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法的膜分離過程，其特征在于，利用分子截流量為3000~1000ODa的超濾膜，調(diào)控進(jìn)口壓力為10~ 30psi,回流壓力為5~20psi，流速為1.0~2.0mL/min。
[0026]7.一種紅松籽柏免疫活性肽，其特征在于，分子量為3000~lOOOODa，蛋白質(zhì)含量為92.0%~96.0%、含水量2.0%~4.0%、灰分為0.5%~1.5%,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.40~
0.60、NK細(xì)胞活性為45%~65%。
[0027]本發(fā)明技術(shù)效果:
[0028](I)本發(fā)明是以長(zhǎng)白山紅松籽柏為原料，經(jīng)超聲波提取水溶性蛋白，使用復(fù)合酶可控酶解技術(shù)進(jìn)行酶解，采用膜分離技術(shù)，對(duì)酶解液進(jìn)行分離，獲得分子量為3000~ lOOOODa、蛋白質(zhì)含量為92.0%~96.0%、水分含量2.0%~4.0%、灰分含量為0.5%~1.5%, 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.40~0.60、NK細(xì)胞活性為45%~65%的紅松籽柏免疫活性肽；
[0029](2)本發(fā)明設(shè)計(jì)的工藝技術(shù)路線簡(jiǎn)單，投入設(shè)備較少，產(chǎn)品利用價(jià)值高，有助于提高提高紅松籽產(chǎn)品附加值，可用于工業(yè)推廣。
【具體實(shí)施方式】[0030]實(shí)施例1:
[0031]以蛋白質(zhì)含量為32%，脂肪含量為15%，淀粉含量為26%，水分含量為2%，灰分含量為7%的紅松籽柏為原料，使用溫度為18°C的去離子水，按照紅松籽柏與水的比例為
5: 100g/mL進(jìn)行混合，浸泡12h后，置于超聲處理儀中，調(diào)整紅松籽柏浸泡液pH為6.0， 設(shè)置超聲處理儀工作參數(shù)，功率為100W，溫度為45°C，處理時(shí)間33min，超聲處理后，剝離凝固的紅松籽油脂層，獲得超聲處理液，將超聲處理液置于反應(yīng)罐中，開啟攪拌器使其轉(zhuǎn)速為20r/min，同時(shí)加熱升溫使罐內(nèi)料液溫度為89°C時(shí)，保持溫度為IOmin后，啟動(dòng)冷卻器， 使反應(yīng)罐中料液溫度降低至35°C后，利用8.0mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整反應(yīng)罐中的料液 pH為6.5 ;稱取初始松籽柏質(zhì)量的6%的復(fù)合酶投入反應(yīng)罐中，木瓜蛋白酶與中性蛋白酶投放比例為1: 8，繼續(xù)用8.0mol/L的氫氧化鈉溶液使反應(yīng)罐中料液的保持pH6.5 ;酶解溫度為35°C，酶解時(shí)間為2.5h，酶解結(jié)束后，將反應(yīng)罐中紅松籽柏酶解液迅速升溫至90°C時(shí)， 保持溫度20min后，然后冷卻至10°C，將冷卻后的酶解液進(jìn)行離心處理，設(shè)置離心參數(shù)，溫度為TC，轉(zhuǎn)速為8500r/min，離心時(shí)間為lOmin，收集上上清液，獲得紅松籽柏酶解物離心液。將PH6.5的紅松籽柏酶解液進(jìn)行膜分離處理，膜分截流量為3000~lOOOODa，進(jìn)口壓力為IOpsi，回流壓力為20psi，流速度為1.2mL/min，收集膜下液，即為3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽液，將其置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，控制轉(zhuǎn)速為lOOOrpm，溫度65°C，濃縮至初始體積的1/5，冷卻至15°C，獲得紅松籽柏免疫活性肽濃縮液。將1000~3000Da 的紅松籽柏免疫活性肽濃縮液，分裝于400 X 200mm的冷凍盤中，厚度為3.5mm ;置于溫度為_32°C冷凍庫(kù)中進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍時(shí)間為1.5h后，再移至真空冷凍干燥機(jī)中，制冷溫度設(shè)定為-50°C，真空度壓力設(shè)定為30Pa，凍干時(shí)間為9h，獲得一種分量為3000~lOOOODa、蛋白質(zhì)含量為92.5%、含水量2.0%、灰分為1.2%，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.60,NK細(xì)胞活性為65%的紅松籽柏免疫活性肽。
[0032]實(shí)施例2:
[0033]以蛋白質(zhì)含量為35%，脂肪含量為25%，淀粉含量為25%，水分含量為3%，灰分含量為5.5%的紅松籽柏為原料，使用溫度為19°C的去離水，按照紅松籽柏與水的比例為 8: 100g/mL進(jìn)行混合，浸泡19h后，置于超聲處理儀中，調(diào)整紅松籽柏浸泡液pH為7.5， 設(shè)置超聲處理儀工作參數(shù)，功率為300W，溫度為35°C，處理時(shí)間25min，超聲處理后，剝離凝固的紅松籽油脂層，獲得超聲處理液，將超聲處理液置于反應(yīng)罐中，開啟攪拌器使其轉(zhuǎn)速為 30r/min，同時(shí)加熱升溫使罐內(nèi)料液溫度為95°C時(shí)，保持溫度為Ilmin后，啟動(dòng)冷卻器，使反應(yīng)罐中料液溫度降低至45°C后，利用9.0mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整反應(yīng)罐中的料液pH 為7.5 ;稱取初始松籽柏質(zhì)量的12%的復(fù)合酶投入反應(yīng)罐中，木瓜蛋白酶與中性蛋白酶投放比例為1: 2，繼續(xù)用9.0mol/L的氫氧化鈉溶液使反應(yīng)罐中料液的保持pH7.5 ;酶解溫度為36°C，酶解時(shí)間為1.5h，酶解結(jié)束后，將反應(yīng)罐中紅松籽柏酶解液迅`速升溫至93°C時(shí)，保持溫度IOmin后，然后冷卻至15°C，將冷卻后的酶解液進(jìn)行離心處理，設(shè)置離心參數(shù)，溫度為0°C，轉(zhuǎn)速為9000r/min，離心時(shí)間為15min，收集上上清液，獲得紅松籽柏酶解物離心液。 將pH7.5的紅松籽柏酶解液進(jìn)行膜分離處理，膜分截流量為3000~lOOOODa，進(jìn)口壓力為 18psi,回流壓力為15psi，流速度為1.5mL/min，收集膜下液，即為3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽液，將其置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，控制轉(zhuǎn)速為1300rpm，溫度45 V，濃縮至初始體積的1/4，冷卻至8°C，獲得紅松籽柏免疫活性肽濃縮液。將1000~3000Da的紅松籽柏免疫活性肽濃縮液，分裝于400 X 200mm的冷凍盤中，厚度為3.0mm ;置于溫度為_30°C冷凍庫(kù)中進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍時(shí)間為0.9h后，再移至真空冷凍干燥機(jī)中，制冷溫度設(shè)定為_52°C， 真空度壓力設(shè)定為60Pa，凍干時(shí)間為10h，獲得一種分量為3000~lOOOODa、蛋白質(zhì)含量為 96.0%、含水量4.0%、灰分為0.8%，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.50、NK細(xì)胞活性為48%的紅松籽柏免疫活性肽。
[0034]實(shí)施例3:
[0035]以蛋白質(zhì)含量為40%，脂肪含量為19%，淀粉含量為34%，水分含量為4%，灰分含量為6%的紅松籽柏為原料，使用溫度為20°C的去離水，按照紅松籽柏與水的比例為 7: 100g/mL進(jìn)行混合，浸泡14h后，置于超聲處理儀中，調(diào)整紅松籽柏浸泡液pH為6.5， 設(shè)置超聲處理儀工作參數(shù)，功率為250W，溫度為39°C，處理時(shí)間35min，超聲處理后，剝離凝固的紅松籽油脂層，獲得超聲處理液，將超聲處理液置于反應(yīng)罐中，開啟攪拌器使其轉(zhuǎn)速為 29r/min,同時(shí)加熱升溫使罐內(nèi)料液溫度為85°C時(shí)，保持溫度為14min后，啟動(dòng)冷卻器，使反應(yīng)罐中料液溫度降低至37°C后，利用8.5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整反應(yīng)罐中的料液pH為
5.5 ;稱取初始松籽柏質(zhì)量的8%的復(fù)合酶投入反應(yīng)罐中，木瓜蛋白酶與中性蛋白酶投放比例為1: 5，繼續(xù)用8.5mol/L的氫氧化鈉溶液使反應(yīng)罐中料液的保持pH5.5 ;酶解溫度為 44°C，酶解時(shí)間為3.5h，酶解結(jié)束后，將反應(yīng)罐中紅松籽柏酶解液迅速升溫至92°C時(shí)，保持溫度15min后，然后冷卻至20°C，將冷卻后的酶解液進(jìn)行離心處理，設(shè)置離心參數(shù)，溫度為 2°C，轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心時(shí)間為18min，收集上上清液，獲得紅松籽柏酶解物離心液。 將pH5.5的紅松籽柏酶解液進(jìn)行膜分離處理，膜分截流量為3000~lOOOODa，進(jìn)口壓力為 30psi,回流壓力為5psi，流速度為1.9mL/min,收集膜下液，即為3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽液，將其置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，控制轉(zhuǎn)速為1200rpm，溫度55°C，濃縮至初始體積的1/3，冷卻至11 °C，獲得紅松籽柏免疫活性肽濃縮液。將1000~3000Da的紅松籽柏免疫活性肽濃縮液，分裝于400 X 200mm的冷凍盤中，厚度為5.0mm ;置于溫度為_40°C冷凍庫(kù)中進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍時(shí)間為1.0h后，再移至真空冷凍干燥機(jī)中，制冷溫度設(shè)定為-55°C， 真空度壓力設(shè)定為50Pa，凍干時(shí)間為15h，獲得一種分量為3000~lOOOODa、蛋白質(zhì)含量為 94.0%、含水量3.5%、灰分為1.5%，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.58、NK細(xì)胞活性為55%的紅松籽柏免疫活性肽。
[0036]實(shí)施例4:
[0037]以蛋白質(zhì)含量為30%，脂肪含量為20%，淀粉含量為35%，水分含量為3.5%，灰分含量為6.8%的紅松籽柏為原料，使用溫度為25°C的去離水，按照紅松籽柏與水的比例為 3: 100g/mL進(jìn)行混合，浸泡13h后，置于超聲處理儀中，調(diào)整紅松籽柏浸泡液pH為8.0， 設(shè)置超聲處理儀工作參數(shù)，功率為200W，溫度為38°C，處理時(shí)間30min，超聲處理后，剝離凝固的紅松籽油脂層，獲得超聲處理液，將超聲處理液置于反應(yīng)罐中，開啟攪拌器使其轉(zhuǎn)速為 20r/min,同時(shí)加熱升溫使罐內(nèi)料液溫度為93°C時(shí)，保持溫度為15min后，啟動(dòng)冷卻器，使反應(yīng)罐中料液溫度降低至39°C后，利用10.0mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整反應(yīng)罐中的料液pH 為8.0 ;稱取初始松籽柏質(zhì)量的9%的復(fù)合酶投入反應(yīng)罐中，木瓜蛋白酶與中性蛋白酶投放比例為1: 10，繼續(xù)用10.0mol/L的氫氧化鈉溶液使反應(yīng)罐中料液的保持pH8.0 ;酶解溫度為45°C，酶解時(shí)間為3.0h，酶解結(jié)束后，將反應(yīng)罐中紅松籽柏酶解液迅速升溫至95°C時(shí)， 保持溫度30min后，然后冷卻至5°C，將冷卻后的酶解液進(jìn)行離心處理，設(shè)置離心參數(shù)，溫度為3°C，轉(zhuǎn)速為8000r/min，離心時(shí)間為20min，收集上上清液，獲得紅松籽柏酶解物離心液。 將pH8.0的紅松籽柏酶解液進(jìn)行膜分離處理，膜分截流量為3000~lOOOODa，進(jìn)口壓力為 20psi,回流壓力為IOpsi，流速度為2.0mL/min,收集膜下液，即為3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽液，將其置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，控制轉(zhuǎn)速為1400rpm，溫度50°C，濃縮至初始體積的1/8，冷卻至5°C，獲得紅松籽柏免疫活性肽濃縮液。將1000~3000Da的紅松籽柏免疫活性肽濃縮液，分裝于400 X 200mm的冷凍盤中，厚度為4.0mm ;置于溫度為_35°C冷凍庫(kù)中進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍時(shí)間為0.5h后，再移至真空冷凍干燥機(jī)中，制冷溫度設(shè)定為-60°C， 真空度壓力設(shè)定為40Pa，凍干時(shí)間為8h，獲得一種分量為3000~lOOOODa、蛋白質(zhì)含量為 93.5%、含水量3.0%、灰分為1.0%，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.40、NK細(xì)胞活性為45%的紅松籽柏免疫活性肽。
[0038]實(shí)施例5:
[0039]以蛋白質(zhì)含量為38%，脂肪含量為17%，淀粉含量為29%，水分含量為2.5%，灰分含量為5%的紅松籽柏為原料，使用溫度為23°C的去離水，按照紅松籽柏與水的比例為
6: 100g/mL進(jìn)行混合，浸泡18h后，置于超聲處理儀中，調(diào)整紅松籽柏浸泡液pH為9.0， 設(shè)置超聲處理儀工作參數(shù)，功率為150W，溫度為43°C，處理時(shí)間28min，超聲處理后，剝離凝固的紅松籽油脂層，獲得超聲處理液，將超聲處理液置于反應(yīng)罐中，開啟攪拌器使其轉(zhuǎn)速為 25r/min，同時(shí)加熱升溫使罐內(nèi)料液溫度為86 °C時(shí)，保持溫度為13min后，啟動(dòng)冷卻器，使反應(yīng)罐中料液溫度降低至42°C后，利用9.5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整反應(yīng)罐中的料液pH 為8.5 ;稱取初始松籽柏質(zhì)量的11%的復(fù)合酶投入反應(yīng)罐中，木瓜蛋白酶與中性蛋白酶投放比例為1: 3，繼續(xù)用9.5mol/L的氫氧化鈉溶液使反應(yīng)罐中料液的保持pH8.5 ;酶解溫度為38°C，酶解時(shí)間為2.0h，酶解結(jié)束后，將反應(yīng)罐中紅松籽柏酶解液迅速升溫至91°C時(shí)， 保持溫度25min后，然后冷卻至8°C，將冷卻后的酶解液進(jìn)行離心處理，設(shè)置離心參數(shù)，溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為9500r/min，離心時(shí)間為13min，收集上上清液，獲得紅松籽柏酶解 物離心液。 將pH8.5的紅松籽柏酶解液進(jìn)行膜分離處理，膜分截流量為3000~lOOOODa，進(jìn)口壓力為 25psi,回流壓力為8psi，流速度為1.0mL/min，收集膜下液，即為3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽液，將其置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，控制轉(zhuǎn)速為1500rpm，溫度60°C，濃縮至初始體積的1/7，冷卻至10°C，獲得紅松籽柏免疫活性肽濃縮液。將1000~3000Da的紅松籽柏免疫活性肽濃縮液，分裝于400 X 200mm的冷凍盤中，厚度為4.5mm ;置于溫度為_37°C冷凍庫(kù)中進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍時(shí)間為1.2h后，再移至真空冷凍干燥機(jī)中，制冷溫度設(shè)定為-55°C， 真空度壓力設(shè)定為20Pa，凍干時(shí)間為12h，獲得一種分量為3000~lOOOODa、蛋白質(zhì)含量為 92.0%、含水量2.5%、灰分為0.5%，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.49、NK細(xì)胞活性為50%的紅松籽柏免疫活性肽。
【權(quán)利要求】
1.一種以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法，其特征在于，是以蛋白質(zhì)含量為 30%~40%，脂肪含量為15%~25%，淀粉含量為25%~35%，水分含量為2%~4%，灰分含量為5%~7%的紅松籽柏為原料，經(jīng)過原料預(yù)處理、復(fù)合酶可控酶解、膜分離、減壓濃縮、真空冷凍干燥過程，獲得分子量為3000~lOOOODa、蛋白質(zhì)含量為92.0%~96.0%、水分含量2.0%~4.0%、灰分含量為0.5%~1.5%，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值為0.40~0.60、NK細(xì)胞活性為 45%~65%的紅松籽柏免疫活性肽； 1)所述的原料預(yù)處理過程，是指在室溫條件下，按照紅松籽柏與水的比例為3: 100g/ mL~10: 100g/mL范圍內(nèi)進(jìn)行混合，浸泡12~20h后；再利用超聲波儀處理物料混合液， 超聲功率為100~300W，超聲時(shí)間為5~35min，再將超聲后的樣液置于儲(chǔ)存罐中，4°C存放 20~60min，剝離凝固的紅松籽油脂層，獲得超聲處理液，備用；2)所述的復(fù)合酶可控酶解過程，是指將超聲處理液置于反應(yīng)罐中，啟動(dòng)攪拌器將轉(zhuǎn)速設(shè)置為20~30r/min，同時(shí)加熱升溫使其內(nèi)料液溫度為85~95°C，保溫時(shí)間為10~15min， 將反應(yīng)罐中料液溫度降低至35~45°C后，保持恒溫和攪拌狀態(tài)，利用8.0~10.0moI/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整反應(yīng)罐中料液PH為5.5~8.5 ;將木瓜蛋白酶與中性蛋白酶按照比例為 1: 2~1: 10投入反應(yīng)罐中，控制其底物濃度為6%~12%，使用8~lOmol/L的氫氧化鈉溶液使反應(yīng)罐中料液的pH為5.5~8.5 ;控制酶解溫度為35~45°C，酶解時(shí)間為1.5~3.5h，酶解結(jié)束后，將反應(yīng)罐中紅松籽柏酶解液迅速升溫至90~95°C時(shí)，保溫10~30min 后，冷卻至5~20°C，將冷卻后的酶解液進(jìn)行離心處理，離心溫度為0~4°C，轉(zhuǎn)速為8000~ 10000r/min，離心時(shí)間為10~20min，收集上清液，獲得紅松籽柏酶解物離心液；3)所述的膜分離過程，是指將紅松籽柏酶解物離心液進(jìn)行膜分離處理，膜分截流量為 3000~lOOOODa，調(diào)控進(jìn)口壓力為10~30psi，回流壓力為5~20psi，流速為1.0~2.0mL/ min，收集膜下液，獲得分子量為3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽液；4)所述的減壓濃縮過程，是指將紅松籽柏免疫活性肽液，置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，控制轉(zhuǎn)速為1000~1500rpm，溫度45~65°C，濃縮至初始體積的1/3~1/8，收集獲得分子量為 3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽濃縮液，冷卻至5~15°C備用；5)所述的真空冷凍干燥過程，是指將5~15°C的3000~1000ODa的紅松籽柏免疫活性肽濃縮液，分裝于400X200mm的冷凍盤中，厚度為3~5mm;然后置于預(yù)凍溫度為-40~_30°C冷凍庫(kù)中，預(yù)凍時(shí)間為0.5~1.5h后，再移至真空冷凍干燥機(jī)中，制冷溫度設(shè)定為-60~_50°C，真空度壓力設(shè)定為20~60Pa，凍干時(shí)間為8~15h，獲得紅松籽柏免疫活性肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法，其特征在于，原料預(yù)處理過程，水是pH為7.0的去離子水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法，其特征在于，所述的利用超聲波儀處理物料混合液，是利用高能超聲波破碎細(xì)胞，控制功率為100~300W， 溫度為35~45°C，處理時(shí)間25~35min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法，其特征在于，所述的木瓜蛋白酶與中性蛋白酶，酶活力均為20萬u/g。
5.一種權(quán)利要求1以紅松籽柏為原料制備免疫活性肽的方法制備的紅松籽柏免疫活性肽，其特征在于，分子量為3000~lOOOODa，蛋白質(zhì)含量為92.0%~96.0%、含水量2.0%~`4.0%、灰分為0.5%~1.5%,淋巴細(xì)`胞轉(zhuǎn)化值為0.40~0.60、NK細(xì)胞活性為45%~65%。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK103555800SQ201310513028
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月26日
【發(fā)明者】林松毅, 劉軒廷, 劉博龍, 賈亞平, 王爽, 劉顥然, 姜源 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)