重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達(dá)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達(dá)方法，將在大腸桿菌中難以實(shí)現(xiàn)表達(dá)的重組人Endomucin膜蛋白，通過GST-Endomucin融合蛋白策略的開發(fā)，對(duì)表達(dá)質(zhì)粒的改造，表達(dá)宿主菌株的優(yōu)選，和表達(dá)工藝的開發(fā)，實(shí)現(xiàn)了大量制備重組人Endomucin的目的。
【專利說明】重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達(dá)方法,屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]本發(fā)明涉及的“重組人Endomucin”是一種表達(dá)在造血干細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白。Endoumcin是1999年Morgan在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)的,其表達(dá)特定于造血祖細(xì)胞、成體造血干細(xì)胞和處于發(fā)育期的多能祖細(xì)胞的膜表面，并與粘液素類糖蛋白有相似的結(jié)構(gòu)。Endomucin的表達(dá)與造血干細(xì)胞膜表面的2個(gè)重要標(biāo)志分子:c_Kit和Sca-1的表達(dá)密切相關(guān)。而且，Endomucin可以代替c-Kit和Sca-1,單獨(dú)鑒定造血干細(xì)胞。Endomucin作為最新發(fā)現(xiàn)的最重要的造血干細(xì)胞標(biāo)志分子，一般用于在骨髓和外周血中鑒定和分析造血干細(xì)胞。
[0003]目前，臨床上還沒有用于促進(jìn)造血干細(xì)胞自我更新和促進(jìn)造血祖細(xì)胞再生修復(fù)的藥物。研究發(fā)現(xiàn)，Endomucin是造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞增殖的促進(jìn)因子。在化療藥物5-氟尿喃唳(5-Fu)損傷作用下,骨髓中Endomucin基因的表達(dá)量迅速提高,促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖與分化以應(yīng)對(duì)5-Fu對(duì)細(xì)胞的殺傷。當(dāng)骨髓造血進(jìn)入恢復(fù)期后，Endomucin基因的表達(dá)量下降使骨髓造血保持一個(gè)平衡的狀態(tài)。如果能應(yīng)用基因工程技術(shù)，在大腸桿菌中表達(dá)重組Endomucin蛋白，并進(jìn)而開發(fā)成治療腫瘤的輔助藥物，將具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0004]應(yīng)用原核表達(dá)體系表達(dá)蛋白具有簡(jiǎn)便、快捷、蛋白表達(dá)量高的優(yōu)勢(shì)。但是由于Endomucin是一種結(jié)合在細(xì)胞膜表面的疏水性很強(qiáng)的跨膜蛋白，因此與分泌型蛋白比較，要想在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)是非常困難的。應(yīng)用pET28a、pET22b、pQE、pBV220等多種常用的表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)均未獲成功。目前，重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達(dá)方面尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達(dá)方法，達(dá)到制備大量重組人Endomucin蛋白的目的。
[0006]本發(fā)明公開的一種重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達(dá)方法，其技術(shù)解決方案如下:
1)將人Endomucin全長基因(Genebank編號(hào):AF205940)克隆到pGEX_2T表達(dá)質(zhì)粒中，采用的限制性內(nèi)切酶分別是N末端的BamH I和C末端的RcoR I，使目的基因連接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，在GST和Endomucin基因中間插入一個(gè)凝血酶酶切位點(diǎn)，構(gòu)建的克隆質(zhì)粒命名為pGEX-Endomucin。將pGEX_2T表達(dá)質(zhì)粒中的GST基因和人Endomucin基因連接在一起，以GST-Endomucin融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。因?yàn)镚ST是能夠在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)的蛋白，采用GST-Endomucin融合蛋白的策略，可以在表達(dá)GST的時(shí)候，將連在其后面的Endomucin蛋白一起表達(dá)出來，然后用凝血酶將GST從融合蛋白上切下來，獲得Endomucin蛋白。其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白(人Endomucin)。
[0007]編碼人Endomucin全長基因的多聚核苷酸序列可以用人工合成的方法獲得，也可以用RT-PCR的方法從人肝胎cDNA文庫、或來源于任何含有相應(yīng)mRNA或cDNA的組織、細(xì)胞及文庫中獲得。可用本領(lǐng)域公知的方法將編碼人Endomucin蛋白序列的核酸克隆到各種表達(dá)載體中去，所用的標(biāo)準(zhǔn)分子克隆過程見(J.薩姆布魯克等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社，1995.)的敘述。pGEX-2T表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)應(yīng)的宿主菌從Invitrogen Corp購得。
[0008]2)應(yīng)用大腸桿菌BL21(DE3) (plySs)菌株作為表達(dá)Endomucin蛋白的宿主菌，使得在常用的大腸桿菌BL21 (DE3)中不能表達(dá)GST-Endomucin融合蛋白的情況得到改善,在該宿主菌中能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)。將pGEX-Endomucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (plySs)，構(gòu)建能表達(dá)GST-Endomucin融合蛋白的大腸桿菌工程菌株BL21_GEn，_70°C保存。
[0009]3)在GST-Endomucin融合蛋白的表達(dá)工藝上,具體工藝步驟是:
①將大腸桿菌工程菌株BL21-GEn劃線接種LB半固體培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C倒置培養(yǎng)過夜，至半固體培養(yǎng)基上長出工程菌株BL21-GEn的單菌落。
[0010]②無菌挑取一個(gè)單菌落接種IOOmL LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp)，在37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260 rpm下培養(yǎng)大腸桿菌BL21_GEn過夜，收獲培養(yǎng)物。
[0011]③將收獲的培養(yǎng)物以2-8%接種LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260rpm下培養(yǎng)至0D600達(dá)到0.6-1.0，然后降低溫度至32°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180_220rpm，繼續(xù)培養(yǎng)
1-2h，然后加入誘導(dǎo)劑IPTG達(dá)到0.8-1.2mM，進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，
④誘導(dǎo)4-6h后停止發(fā)酵,收獲發(fā)酵液。人Endomucin蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的33-42%。
[0012]4)收集發(fā)酵液，應(yīng)用高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體。破碎后，應(yīng)用高速冷凍離心機(jī)收集上清液，操作條件是:4°C下,在14000rpm離心30min,收集離心上清液進(jìn)行下一步柱層析純化。應(yīng)用針對(duì)GST的親和層析介質(zhì)Glutathione-Sepharose進(jìn)行親和柱層析純化，收獲GST-Endomucin融合蛋白。采用凝血酶切下GST-Endomucin融合蛋白中的GST肽段,應(yīng)用Superdex 75凝膠過濾柱層析純化,獲得純度超過98%的重組人Endomucin蛋白。
[0013]本發(fā)明的積極效果在于:
將在大腸桿菌中難以實(shí)現(xiàn)表達(dá)的重組人Endomucin膜蛋白，通過GST-Endomucin融合蛋白策略的開發(fā)，對(duì)表達(dá)宿主菌株的優(yōu)選，和表達(dá)工藝的開發(fā)，實(shí)現(xiàn)了大量制備重組人Endomucin 的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1.Endomucin在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)果圖；
圖2.Endomucin的純化蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。
[0015]圖3.Endomucin在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)果圖；
圖4.Endomucin的純化蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。
[0016]圖5.Endomucin在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)果圖；
圖6.Endomucin的純化蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】[0017]實(shí)施例1
I)將人Endomucin全長基因克隆到pGEX_2T表達(dá)質(zhì)粒中，采用的限制性內(nèi)切酶分別是N末端的BamH I和C末端的RcoR I，使目的基因連接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，在GST和Endomucin基因中間插入一個(gè)凝血酶酶切位點(diǎn)，構(gòu)建新的克隆質(zhì)粒pGEX-Endomucin,表達(dá) GST-Endomucin 融合蛋白。
[0018]2)應(yīng)用大腸桿菌BL21(DE3) (plySs)菌株作為表達(dá)Endomucin蛋白的宿主菌，將pGEX-Endomucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (plySs),構(gòu)建能表達(dá)GST-Endomucin融合蛋白的大腸桿菌工程菌株BL21-GEn。
[0019]3)在GST-Endomucin融合蛋白的表達(dá)工藝上,具體工藝步驟是:
①將大腸桿菌工程菌株BL21-GEn劃線接種LB半固體培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C倒置培養(yǎng)過夜，至半固體培養(yǎng)基上長出工程菌株BL21-GEn的單菌落。
[0020]②無菌挑取一個(gè)單菌落接種IOOmL LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp)，在37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260 rpm下培養(yǎng)大腸桿菌BL21_GEn過夜，收獲培養(yǎng)物。
[0021]③將收獲的培養(yǎng)物以2-8%接種LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260rpm下培養(yǎng)至0D600達(dá)到0.6，然后降低溫度至32°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180rpm，繼續(xù)培養(yǎng)lh，然后加入誘導(dǎo)劑IPTG達(dá)到0.8mM,進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0022]④誘導(dǎo)4h后停止發(fā)酵，收獲發(fā)酵液。人Endomucin蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的35%。
[0023]圖1.Endomucin在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)果圖(LanelO: Protein marker ；Lane9:1nduction and expression of recombinant GST-Endomucin fusion protein)；
圖 2.Endomucin 的純化蛋白的 SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖(Lane 9: Protein marker ；Lane6:Purified recombinant GST-Endomucin fusion protein)。
[0024]實(shí)施例2
I)將人Endomucin全長基因克隆到pGEX_2T表達(dá)質(zhì)粒中，采用的限制性內(nèi)切酶分別是N末端的BamH I和C末端的RcoR I，使目的基因連接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，在GST和Endomucin基因中間插入一個(gè)凝血酶酶切位點(diǎn)，構(gòu)建新的克隆質(zhì)粒pGEX-Endomucin,表達(dá) GST-Endomucin 融合蛋白。
[0025]2)應(yīng)用大腸桿菌BL21(DE3) (plySs)菌株作為表達(dá)Endomucin蛋白的宿主菌，將pGEX-Endomucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (plySs),構(gòu)建能表達(dá)GST-Endomucin融合蛋白的大腸桿菌工程菌株BL21-GEn。
[0026]3)在GST-Endomucin融合蛋白的表達(dá)工藝上,具體工藝步驟是:
①將大腸桿菌工程菌株BL21-GEn劃線接種LB半固體培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C倒置培養(yǎng)過夜，至半固體培養(yǎng)基上長出工程菌株BL21-GEn的單菌落。
[0027]②無菌挑取一個(gè)單菌落接種IOOmL LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp)，在37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260 rpm下培養(yǎng)大腸桿菌BL21_GEn過夜，收獲培養(yǎng)物。
[0028]③將收獲的培養(yǎng)物以2-8%接種LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260rpm下培養(yǎng)至0D600達(dá)到1.0，然后降低溫度至32°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)220rpm，繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后加入誘導(dǎo)劑IPTG達(dá)到1.2mM，進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0029]④誘導(dǎo)6h后停止發(fā)酵，收獲發(fā)酵液。人Endomucin蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的42%。
[0030]圖 3.Endomucin 在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)果圖(Lane9: Protein marker ；Lane8:1nduction and expression of recombinant GST-Endomucin fusion protein)；
圖4.Endomucin 的純化蛋白的SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖(Lane 10: Protein marker ;Lane6: Purified recombinant GST-Endomucin fusion protein)。
[0031]實(shí)施例3
I)將人Endomucin全長基因克隆到pGEX_2T表達(dá)質(zhì)粒中，采用的限制性內(nèi)切酶分別是N末端的BamH I和C末端的RcoR I，使目的基因連接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，在GST和Endomucin基因中間插入一個(gè)凝血酶酶切位點(diǎn)，構(gòu)建新的克隆質(zhì)粒pGEX-Endomucin,表達(dá) GST-Endomucin 融合蛋白。
[0032]2)應(yīng)用大腸桿菌BL21(DE3) (plySs)菌株作為表達(dá)Endomucin蛋白的宿主菌，將pGEX-Endomucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (plySs),構(gòu)建能表達(dá)GST-Endomucin融合蛋白的大腸桿菌工程菌株BL21-GEn。
[0033]3)在GST-Endomucin融合蛋白的表達(dá)工藝上,具體工藝步驟是:
①將大腸桿菌工程菌株BL21-GEn劃線接種LB半固體培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C倒置培養(yǎng)過夜，至半固體培養(yǎng)基上長出工程菌株BL21-GEn的單菌落。
[0034]②無菌挑取一個(gè)單菌落接種IOOmL LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp)，在37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260 rpm下培養(yǎng)大腸桿菌BL21_GEn過夜，收獲培養(yǎng)物。
`[0035]③將收獲的培養(yǎng)物以2-8%接種LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260rpm下培養(yǎng)至0D600達(dá)到0.8，然后降低溫度至32°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)200rpm，繼續(xù)培養(yǎng)1.5h，然后加入誘導(dǎo)劑IPTG達(dá)到1.0mM，進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0036]④誘導(dǎo)5h后停止發(fā)酵，收獲發(fā)酵液。人Endomucin蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的38%。
[0037]圖5.Endomucin 在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)果圖(Lane6: Protein marker ；Lane7:1nduction and expression of recombinant GST-Endomucin fusion protein)；
圖 6.Endomucin 的純化蛋白的 SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖(Lane 9: Protein marker ；Lane7: Purified recombinant GST-Endomucin fusion protein)。
【權(quán)利要求】
1.一種重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達(dá)方法,包括以下步驟: 1)將人Endomucin全長基因(Genebank編號(hào):AF205940)克隆到pGEX_2T表達(dá)質(zhì)粒中，采用的限制性內(nèi)切酶分別是N末端的Bam H I和C末端的EcoR I，使目的基因連接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，在GST和Endomucin基因中間插入一個(gè)凝血酶酶切位點(diǎn)，構(gòu)建的克隆質(zhì)粒命名為pGEX-Endomucin ;將pGEX_2T表達(dá)質(zhì)粒中的GST基因和人Endomucin基因連接在一起，以GST-Endomucin融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)；然后用凝血酶將GST從融合蛋白上切下來，獲得Endomucin蛋白； 2)應(yīng)用大腸桿菌BL21(DE3)(plySs)菌株作為表達(dá)Endomucin蛋白的宿主菌，使得在常用的大腸桿菌BL21 (DE3)中不能表達(dá)GST-Endomucin融合蛋白的情況得到改善,在該宿主菌中能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)；將pGEX-Endomucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (plySs)，構(gòu)建能表達(dá)GST-Endomucin融合蛋白的大腸桿菌工程菌株BL21_GEn，_70°C保存； 3)在GST-Endomucin融合蛋白的表達(dá)工藝上,具體工藝步驟是: ①將大腸桿菌工程菌株BL21-GEn劃線接種LB半固體培養(yǎng)基(含100ug/mLAmp), 37°C倒置培養(yǎng)過夜，至半固體培養(yǎng)基上長出工程菌株BL21-GEn的單菌落； ②無菌挑取一個(gè)單菌落接種IOOmLLB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp)，在37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù).260 rpm下培養(yǎng)大腸桿菌BL21_GEn過夜，收獲培養(yǎng)物； ③將收獲的培養(yǎng)物以2-8%接種LB培養(yǎng)基(含100ug/mLAmp)，37 °C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260rpm下培養(yǎng)至0D600達(dá)到0.6-1.0，然后降低溫度至32°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180_220rpm，繼續(xù)培養(yǎng)1-2h，然后加入誘導(dǎo)劑IPTG達(dá)到0.8-1.2mM，進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)； ④誘導(dǎo)4-6h后停止發(fā)酵，收獲發(fā)酵液:人Endomucin蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的33-42% ； 4)收集發(fā)酵液，應(yīng)用高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體； 破碎后，應(yīng)用高速冷凍離心機(jī)收集上清液，操作條件是:4 °C下，在HOOOrpm離心.30min,收集離心上清液進(jìn)行下一步柱層析純化； 應(yīng)用針對(duì)GST的親和層析介質(zhì)Glutathione-Sepharose進(jìn)行親和柱層析純化，收獲GST-Endomucin融合蛋白；采用凝血酶切下GST-Endomucin融合蛋白中的GST肽段,應(yīng)用Superdex 75凝膠過濾柱層析純化,獲得純度超過98%的重組人Endomucin蛋白。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103555752SQ201310516865
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】王群, 鞠長軍, 高俊芳 申請(qǐng)人:長春長生生物科技股份有限公司