一種凝膠電泳分離純化pcr產(chǎn)物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物的方法。具體步驟為：首先將目的基因用膠回收試劑盒回收，CRT－PD－1回收產(chǎn)物用NotⅠ/XholⅠ酶切，同時(shí)用NotⅠ和XholⅠ對pET28a(+)載體雙酶切，純化后兩者等體積混合用T4連接酶16℃連接16h～20h；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至預(yù)先制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α(DE3)，離心后棄300μl上清，重懸剩余菌液涂于已預(yù)熱的卡那霉素的LB平板上，細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；第二日挑克隆接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中37℃搖床振蕩過夜。其后需要經(jīng)PCR及酶切鑒定后，將陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序。本發(fā)明的有益效果是，所得產(chǎn)物經(jīng)SDS－PAGE檢測后，在45kDa處顯示特異條帶，最后經(jīng)WesternBlotting鑒定，所純化蛋白能被CRT抗體和PD1抗體抗體識(shí)別；獲得較純的融合蛋白，所構(gòu)建的載體可為進(jìn)一步研究兩者的功能和免疫學(xué)特性及腫瘤的免疫治療奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】-種凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種PCR的生成方法，具體來說，是指一種凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物 的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 鈣網(wǎng)蛋白是屬于熱休克蛋白家族的一類高度保守內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可溶性蛋白，分子量為46 kD，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。研究顯示，應(yīng)用蒽環(huán)類藥物和γ -射線能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋 亡時(shí)，CRT從胞內(nèi)向膜表面快速轉(zhuǎn)位并在細(xì)胞膜上簇集，出現(xiàn)在凋亡細(xì)胞膜上的CRT能被吞 噬細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體識(shí)別，由此活化吞噬細(xì)胞并啟動(dòng)對凋亡細(xì)胞的吞噬作用，這類凋亡 的腫瘤細(xì)胞具有良好的免疫原性。程序性死亡因子及其配體ro - L1是蛋白家族的兩個(gè)新 成員，屬于I型跨膜分子。作為一種免疫共刺激分子，ro - 1主要表達(dá)于活化的淋巴細(xì)胞 膜表面，PDL1與ro - 1結(jié)合產(chǎn)生負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用，在機(jī)體的免疫穩(wěn)定與耐受方面發(fā)揮正 常的調(diào)節(jié)功能。新近的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞膜上高表達(dá)ro - L1分子，它與淋巴細(xì)胞 上的ro - 1結(jié)合后，將抑制效應(yīng)性T細(xì)胞活性，同時(shí)降低后者IL 一 2和IFN - γ的表達(dá) 和分泌，形成腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的生長。而可溶性PD1與ro - L1的結(jié) 合可以阻斷ro - L1的活性，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的活性，在抗腫瘤和抗病毒中具有重要作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為克服上述技術(shù)問題，我們提出了以下技術(shù)方案： 一種凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物的方法，其特征在于：首先將目的基因用膠回收試劑 盒回收，CRT - PD-1回收產(chǎn)物用Not I / Xhol I酶切，同時(shí)用Not I和Xhol I對pET28a (+ )載體雙酶切，純化后兩者等體積混合用T4連接酶16 °C連接16h?20 h;連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化至預(yù)先制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a( DE3)，離心后棄300 μ 1上清，重懸剩余 菌液涂于已預(yù)熱的卡那霉素的LB平板上，細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；第二日挑克隆接種于含有 卡那霉素的LB培養(yǎng)液中37°C搖床振蕩過夜。
[0004] 本發(fā)明中，其后需要經(jīng)PCR及酶切鑒定后，將陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序。
[0005] 本發(fā)明的有益效果是，所得產(chǎn)物經(jīng)SDS - PAGE檢測后，在45 kDa處顯示特異條 帶，最后經(jīng)Western Blotting鑒定，所純化蛋白能被CRT抗體和PD1抗體抗體識(shí)別；獲得 較純的融合蛋白，所構(gòu)建的載體可為進(jìn)一步研究兩者的功能和免疫學(xué)特性及腫瘤的免疫治 療奠定了基礎(chǔ)。

【具體實(shí)施方式】
[0006] 具體步驟為：首先將目的基因用膠回收試劑盒回收，CRT - ro - 1回收產(chǎn)物用 Not I / Xhol I酶切，同時(shí)用Not I和Xhol I對pET28a ( + )載體雙酶切，純化后兩者等 體積混合用T4連接酶16 °C連接16h?20 h ;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至預(yù)先制備好的大腸桿菌感 受態(tài)細(xì)胞DH5 a ( DE3)，離心后棄300 μ 1上清，重懸剩余菌液涂于已預(yù)熱的卡那霉素的LB
【權(quán)利要求】
1. 一種凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物的方法，其特征在于：首先將目的基因用膠回收 試劑盒回收，CRT - ro - 1回收產(chǎn)物用Not I / Xhol I酶切，同時(shí)用Not I和Xhol I對 pET28a ( + )載體雙酶切，純化后兩者等體積混合用T4連接酶；16 °C連接16h?20 h; 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至預(yù)先制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a( DE3)，離心后棄300 μ 1上清， 重懸剩余菌液涂于已預(yù)熱的卡那霉素的LB平板上，細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；第二日挑克隆接 種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中37°C搖床振蕩過夜。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物的方法，其特征在于：其后需 要經(jīng)PCR及酶切鑒定后，將陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104120140SQ201310519248
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】王景文 申請人:王景文