一種高效制備食品級酸性脲酶的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效制備食品級酸性脲酶及其應(yīng)用的方法及其應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。利用食品級乳酸乳球菌表達系統(tǒng)成功實現(xiàn)了酸性脲酶的高效表達制備方法及應(yīng)用，酸性脲酶酶活達到10200U/L，純化后酸性脲酶比酶活為325.6U/mg。純化后的酶對氨基甲酸乙酯底物的比酶活達到243.4U/mg，在黃酒中加入本發(fā)明制備的酸性脲酶可高效降解尿素(2天降解率100%)和氨基甲酸乙酯（3天降解率72%）。本發(fā)明制備的重組酸性脲酶可以用于發(fā)酵食品中尿素和氨基甲酸乙酯的消除，可高效解決發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的殘留問題，本發(fā)明為實現(xiàn)食品級酸性脲酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種高效制備食品級酸性脲酶的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及在乳酸菌中高效表達酸性脲酶的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]脲酶(Urease，EC3.5.1.5)又稱氨基水解酶，廣泛存在與生物界的動物、植物、細菌、真菌等中，其能專一性的催化尿素水解產(chǎn)生兩分子氨和一分子碳酸。自從1926年Summer首次從刀豆中提取出結(jié)晶態(tài)的脲酶，各國對脲酶進行了廣泛的研究。根據(jù)脲酶作用的最適PH值，可將脲酶分為酸性脲酶、中性脲酶和堿性脲酶。
[0003]進入80年代后，研究證實在酒精類(如我國的黃酒類)的發(fā)酵生產(chǎn)中，酵母細胞由于氮源利用的先后次序?qū)е戮彼岽x產(chǎn)生的尿素被分泌的細胞外，同時，原材料中的尿素也殘留在酒類中。而生成的乙醇和尿素會自發(fā)發(fā)生反應(yīng)生成一種具有致癌的物質(zhì)——氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate，簡稱EC)。長期飲用含有較高濃度氨基甲酸乙酯的酒類容易誘發(fā)多種癌癥，如肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等。因此國外如加拿大、日本以及歐洲紛紛制定了酒中EC的限量標準，而我國遲遲不能制定相應(yīng)的標準。因此，如何盡快解決氨基甲酸乙酯的問題已經(jīng)提上了議事日程。國內(nèi)外已有多種相關(guān)報道，其中，通過人為添加制備的酸性脲酶是一個非常實際、可行的方法，2005年OIV (國際葡萄.葡萄酒組織)通過了允許添加酸性脲酶降低酒中尿素的決議。
[0004]我國擁 有十分悠久的釀酒歷史，尤其是黃酒，其與葡萄酒和啤酒并稱為世界三大古酒。我國黃酒因其品質(zhì)優(yōu)良，口感醇厚，營養(yǎng)豐富，具有深厚的文化底蘊而遠銷日本，韓國，東南亞和歐美等國家，但近年來，由于EC殘留問題遭到了嚴重的技術(shù)貿(mào)易壁壘威脅。我國黃酒PH值為3.5-5.5，且有一定的乙醇濃度，中性脲酶和堿性脲酶在此條件下酶活力幾乎或者完全喪失，酒用脲酶在我國尚未形成生產(chǎn)能力，紹興黃酒集團至今仍需從日本進口昂貴的酒用酸性脲酶，因此獲得具有耐酸和耐乙醇的酸性脲酶是問題解決的關(guān)鍵。
[0005]目前，許多課題組已從自然界中篩選獲得了多種產(chǎn)酸性脲酶的菌株，研究表明，菌株多為腸桿菌屬、幽門螺桿菌、肺炎克雷伯氏菌，由于這些菌多為致病菌或者條件致病菌，從而限制了其進一步的應(yīng)用。而日本商業(yè)化的酸性脲酶生產(chǎn)依然是利用野生菌進行發(fā)酵生產(chǎn)的，產(chǎn)酶水平較低，這也是現(xiàn)在酒用酸性脲酶價格居高不下的原因。
[0006]鑒于此，構(gòu)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型食品級重組工程菌高效生產(chǎn)酒用酸性脲酶的方法更有利于酸性脲酶今后的工業(yè)化生產(chǎn)，也更有利于我國釀酒業(yè)的發(fā)展和國際市場拓展。
[0007]本發(fā)明從一株食品安全級的乳桿菌中克隆獲得酒用酸性脲酶的全長基因，并實現(xiàn)利用重組乳酸乳球菌，異源高效表達酒用酸性脲酶及其純化制備的方法。本發(fā)明的實現(xiàn)為食品級酒用酸性脲酶的工業(yè)化制備生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種高效制備食品級酸性脲酶的方法，技術(shù)方案為:從羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，將重組質(zhì)
粒導(dǎo)入乳酸乳球菌、植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌中任--種，構(gòu)建高效表達酸性脲酶的重組
菌，利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
[0009]所述酸性脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受Nisin啟動子調(diào)控，據(jù)此制備食品級酸性脲酶的方法步驟如下:
[0010]I)根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒；
[0011]2)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒；
[0012]3)將步驟2)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受Nisin啟動子調(diào)控；
[0013]4)利用重組乳酸乳球菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
[0014]依據(jù)上述制備食品級酸性脲酶的方法，具體步驟如下:
[0015]I)根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒；
[0016]2)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒pNZ8148或pNZ8149酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒;
[0017]3)將步驟2)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌NZ9000或NZ3900構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組乳酸乳球菌NZ9000 (pNZ8148-ureLR)或NZ3900 (pNZ8149_ureLR)，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受Nisin啟動子調(diào)控；
[0018]4)利用重組乳酸乳球菌 NZ9000(pNZ8148-ureLR)或 NZ3900 (pNZ8149_ureLR)發(fā)酵
生產(chǎn)脲酶。
[0019]酸性脲酶基因簇表達在乳酸乳球菌、植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌中受p32或p59啟動子調(diào)控。其中，重組菌株酸性脲酶基因簇表達受P32啟動子調(diào)控，據(jù)此制備食品級酸性脲酶的方法，具體步驟如下:
[0020]I)根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒；
[0021]2)根據(jù)NCBI公布的P32 (GenBank:M24764.1)啟動子序列，設(shè)計引物擴增P32啟動子基因，與質(zhì)粒PNZ8148酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ32 ；
[0022]3)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒pNZ32酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ32-ureLR ；
[0023]4)將步驟3)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌，植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受P32啟動子調(diào)控；
`[0024]5)利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
[0025]重組菌株酸性脲酶基因簇表達受p59啟動子調(diào)控的制備食品級酸性脲酶的方法，具體步驟如下:
[0026]I)根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒；
[0027]2)根據(jù)NCBI公布的P59 (GenBank:M24806.1)啟動子序列，設(shè)計引物擴增P59啟動子基因，與質(zhì)粒PNZ8148酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ59 ；
[0028]3)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒pNZ59酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ59-ureLR ；
[0029]4)將步驟3)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌，植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組菌，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受P59啟動子調(diào)控；
[0030]5)利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
[0031]以乳酸乳球菌為表達宿主，且重組菌株酸性脲酶基因簇的表達受P32或P59啟動子調(diào)控，制備食品級酸性脲酶的方法，具體步驟如下:
[0032]I)根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒；
[0033]2)根據(jù) NCBI 公布的 P32 或 P59 (GenBank:M24764.1,GenBank:M24806.1)啟動子序列，設(shè)計引物擴增P32或P59啟動子基因，與質(zhì)粒pNZ8148酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ32或pNZ59 ；
[0034]3)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒pNZ32或pNZ59酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ32-ureLR 或 pNZ59_ureLR ；
[0035]4)將步驟3)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受P32或P59啟動子調(diào)控；
[0036]5)利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
[0037]以嗜熱鏈球菌或植物乳桿菌為表達宿主制備食品級酸性脲酶的方法，具體步驟如下:
[0038]I)根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒；
[0039]2)根據(jù) NCBI 公布的 P32 或 P59 (GenBank:M24764.1,GenBank:M24806.1)啟動子序列，設(shè)計引物擴增P32或P59啟動子基因，與質(zhì)粒pNZ8148酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ32或pNZ59 ；
[0040]3)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒pNZ32或pNZ59酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ32-ureLR 或 pNZ59_ureLR ；
[0041]4)將步驟3)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受P32或P59啟動子調(diào)控；
[0042]5)利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
[0043]同時，本發(fā)明對發(fā)酵制得的酸性脲酶產(chǎn)物，采用60%乙醇沉淀，DEAE離子交換，疏水層析進行純化，并測定重組酸性脲酶的酶活及酶學(xué)性質(zhì)。
[0044]本發(fā)明還提供了一種用于消除黃酒等發(fā)酵食品中的尿素和氨基甲酸乙酯的方法。將重組制備的酸性脲酶加入黃酒或含有尿素和氨基甲酸乙酯的食品中，用以降低食品中尿素和氨基甲酸乙酯的含量。本發(fā)明成功從乳桿菌中克隆獲得酸性脲酶全長基因，并實現(xiàn)利用重組乳酸乳球菌，異源高效表達酸性脲酶及其純化制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明為實現(xiàn)食品安全級酸性脲酶的工業(yè)化制備生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
[0045]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0046]本發(fā)明利用食品級乳酸乳球菌表達系統(tǒng)成功實現(xiàn)了酸性脲酶的高效表達，酸性脲酶酶活達到10200U/L，純化后酸性脲酶比酶活為325.6U/mg。純化后的酶對氨基甲酸乙酯底物的比酶活達到243.4U/mg，在黃酒中加入本發(fā)明制備的酸性脲酶可高效降解尿素(2天降解率100%)和氨基甲酸乙酯(3天降解率72%)。本發(fā)明制備的重組酸性脲酶可以用于發(fā)酵食品中尿素和氨基甲酸乙酯的消除，可高效解決發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的殘留問題，本發(fā)明為實現(xiàn)食品級酸性脲酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0047]圖1所示為酸性脲酶基因克隆的電泳結(jié)果；
[0048](M, marker ;1，酸性脲酶基因)。
[0049]圖2所示為構(gòu)建的不同酸性脲酶工程菌發(fā)酵結(jié)果。
[0050]圖3 所示為 L.1actis NZ3900 (pNZ8149_UreLR)上罐發(fā)酵結(jié)果。
[0051]圖4所示為重組酸性脲酶的蛋白純化SDS-PAGE電泳結(jié)果；
[0052](M,蛋白 marker ；1, L.1actis NZ3900 (pNZ8149_UreLR)全細胞液；2,重組菌株L.1actis NZ3900 (pNZ8149-UreLR)酒精沉淀；`3，DEAE純化后活性部位；4，疏水層析純化后活性部位)。
[0053]圖5所示為重組表達的酸性脲酶分別以尿素和EC為底物時的比酶活。
[0054]圖6重組酸性脲酶酶學(xué)性質(zhì)測定結(jié)果；
[0055](A，溫度對酶活的影響；B，pH對酶活的影響；C，酒精濃度對酶活的影響；D，溫度對脲酶穩(wěn)定性的影響；E，pH對脲酶穩(wěn)定性的影響；F，酒精濃度對脲酶穩(wěn)定性的影響)。
[0056]圖7所示為酸性脲酶在黃酒中降解尿素和EC的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0057]材料與方法
[0058]1.GMl7培養(yǎng)基:M17培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)，0.5%葡萄糖，PH7.0-7.2，固體培養(yǎng)基添加15%瓊脂。
[0059]2.LMl7培養(yǎng)基:M17培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)，0.5%乳糖，pH7.0-7.2，固體培養(yǎng)基添加15%瓊脂。
[0060]3.MRS培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)。
[0061]4.酸性脲酶酶活測定方法:用移液管準確吸取由pH4.550mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋至適當濃度的純化后酶液各0.2mL于2支25mL的比色管中，其中一支作為對照，加塞，沸水浴處理5min，使酶失活，冷卻后將2支比色管于37°C水浴中保溫平衡lOmin，分別加入0.8mL3%EC底物溶液(pH4.5,0.05mol.L—1的檸檬酸緩沖液配制)，搖勻，于37°C下恒溫反應(yīng)20min，立即用移液管加ImL終止劑(10%三氯乙酸)于比色管中，振蕩混勻，再向比色管中依次加入ImL顯色劑(15g苯酹和0.625g亞硝基鐵氰化鈉用超純水定容至250mL)和ImL顯色劑11(13.125gNaOH和7.5mLNaC10用超純水定容至250mL)，每加入一種顯色劑均需強烈振蕩，使之充分混勻，37°C下恒溫反應(yīng)20min，然后用超純水定容至25mL，在625nm下比色測定OD值，計算酶活(采用氯化銨繪制標準曲線)。
[0062]5.酸性脲酶酶活力單位定義:在常壓，pH4.5 (50mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)和37°C下，每分鐘降解尿素產(chǎn)生Ιμπιο? NH3+所需的酶量為一個酶活力單位。
[0063]表1
【權(quán)利要求】
1.一種高效制備食品級酸性脲酶的方法，其特征在于，從羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)基因組上克隆獲得酸性脲酶基因,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌、植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌中任一一種，構(gòu)建高效表達酸性脲酶的重組菌，利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
2.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述酸性脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受Nisin啟動子調(diào)控。
3.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，制備步驟如下: O根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒； 2)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒； 3)將步驟2)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受Nisin啟動子調(diào)控； 4)利用重組乳酸乳球菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
4.權(quán)利要求3 所述方法，其特征在于，具體步驟如下: O根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒； 2)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒pNZ8148或pNZ8149酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒； 3)將步驟2)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌NZ9000或NZ3900構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組乳酸乳球菌NZ9000 (pNZ8148-ureLR)或NZ3900 (pNZ8149_ureLR)，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受Nisin啟動子調(diào)控； 4)利用重組乳酸乳球菌NZ9000 (pNZ8148-ureLR)或 NZ3900 (pNZ8149_ureLR)發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
5.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述酸性脲酶基因簇受p32或p59啟動子調(diào)控。
6.權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，具體步驟如下: O根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒； 2)根據(jù)NCBI公布的P32(GenBank:M24764.1)啟動子序列，設(shè)計引物擴增P32啟動子基因，與質(zhì)粒PNZ8148酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ32 ； 3)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒pNZ32酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ32_ureLR； 4)將步驟3)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌，植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受P32啟動子調(diào)控； 5)利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
7.權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，具體步驟如下: O根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒；2)根據(jù)NCBI公布的P59(GenBank:M24806.1)啟動子序列，設(shè)計引物擴增P59啟動子基因，與質(zhì)粒PNZ8148酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ59 ； 3)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒pNZ59酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ59_ureLR； 4)將步驟3)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌，植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組菌，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受P59啟動子調(diào)控； 5)利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
8.權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，具體步驟如下: O根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒；
2)根據(jù)NCBI 公布的 P32 或 P59 (GenBank:M24764.1，GenBank:Μ24806.I)啟動子序列，設(shè)計引物擴增Ρ32或Ρ59啟動子基因，與質(zhì)粒ρΝΖ8148酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒ρΝΖ32或ΡΝΖ59 ； 3)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒ρΝΖ32或ρΝΖ59酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ32-ureLR 或 pNZ59_ureLR ； 4)將步驟3)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受P32或P59啟動子調(diào)控； 5)利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
9.權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，具體步驟如下: O根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，從羅伊氏乳桿菌基因組上克隆獲得酸性脲酶基因，目的基因連接載體得到ureLR基因的重組質(zhì)粒； 2)根據(jù)NCBI 公布的 P32 或 P59 (GenBank:M24764.1,GenBank:Μ24806.I)啟動子序列，設(shè)計引物擴增Ρ32或Ρ59啟動子基因，與質(zhì)粒ρΝΖ8148酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒ρΝΖ32或ΡΝΖ59 ； 3)將含有ureLR基因的重組質(zhì)粒與質(zhì)粒ρΝΖ32或ρΝΖ59酶切、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ32-ureLR 或 pNZ59_ureLR ； 4)將步驟3)構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌構(gòu)建產(chǎn)脲酶重組乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表達在乳酸乳球菌中受P32或P59啟動子調(diào)控； 5)利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)脲酶。
10.權(quán)利要求1所述方法用于消除黃酒等發(fā)酵食品中的尿素和氨基甲酸乙酯。
【文檔編號】C12N15/74GK103571815SQ201310524588
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】陳堅, 堵國成, 康振, 楊宇清 申請人:江南大學(xué)