一種柑橘黃龍病病原pcr檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物檢測(cè)鑒定方法，尤其涉及柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法。一種柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，包括待檢樣品DNA提??；配制PCR擴(kuò)增體系，所述的擴(kuò)增體系包括第一輪PCR擴(kuò)增體系和第二輪PCR擴(kuò)增體系；PCR擴(kuò)增反應(yīng)；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，其中所述的第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增體系最終體積為7μL～10μL，其中DNA模板2.5μL、2×Taq?PCR?Master?Mix2.5μL、引物0.25μL，其余為滅菌雙蒸水。本發(fā)明的第一輪和第二輪各自PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系均為7μL～10μL，可達(dá)到20或25μL反應(yīng)體系檢測(cè)出來的效果，大幅度降低了檢測(cè)經(jīng)濟(jì)成本；本發(fā)明所需的試劑量少，能減輕對(duì)環(huán)境的污染。
【專利說明】—種柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方 法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測(cè)鑒定方法，尤其涉及柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]柑橘黃龍病是為害柑橘最嚴(yán)重的病害之一，被國(guó)內(nèi)外列為植物重點(diǎn)檢疫對(duì)象，病原為類細(xì)菌，可以通過嫁接傳染，苗木擴(kuò)散，在田間則通過柑橘木虱傳播。它不僅使葉片轉(zhuǎn)黃，還使柑橘產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，病情嚴(yán)重時(shí)會(huì)使根系腐爛，甚至?xí)斐烧賵@被毀，是柑橘管護(hù)中的重要防治對(duì)象。
[0003]常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)只需要一對(duì)引物，準(zhǔn)確度不夠高；由于柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)反應(yīng)體系所需的各種試劑、藥品價(jià)格昂貴，很多科研院所研究由于經(jīng)費(fèi)有限，無力承擔(dān)高額檢測(cè)費(fèi)用，盡管很多地方的柑橘生產(chǎn)部門有檢測(cè)疑似黃龍病樣品的要求，但也由于檢測(cè)經(jīng)費(fèi)捉襟見肘，往往也沒有能夠完成實(shí)際上的檢測(cè)任務(wù)指標(biāo)，地域來源復(fù)雜及海量樣品的檢測(cè)更是難以實(shí)現(xiàn)，這就造成一方面全國(guó)柑橘黃龍病有逐年蔓延發(fā)展趨勢(shì)，一方面卻由于樣品的檢測(cè)成本居高不下，柑橘生產(chǎn)實(shí)踐與理論的嚴(yán)重脫節(jié)的現(xiàn)象。同時(shí)，檢測(cè)所需的試劑、藥品均有毒性，會(huì)造成環(huán)境污染。當(dāng)前，柑橘黃龍病亞洲種病原的PCR檢測(cè)技術(shù)總反應(yīng)體系一般都是20 μ L或25 μ L，試劑使用量大、資源耗費(fèi)高。所以急需研發(fā)出一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用、環(huán)境污染小、準(zhǔn)確度高的巢氏PCR檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]一種柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟:
[0007](I)待檢樣品DNA提?。?br> [0008](2)配制PCR擴(kuò)增體系，所述的擴(kuò)增體系包括第一輪PCR擴(kuò)增體系和第二輪PCR擴(kuò)增體系；
[0009](3) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)；
[0010](4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，
[0011]其中所述的第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增體系最終體積為7 μ L~10 μ L，其中DNA模板 2.5 μ L、2 X Taq PCR Master Mix2.5 μ L、引物 0.25 μ L，余量為滅菌雙蒸水。
[0012]優(yōu)選的是:所述的待檢樣品DNA的0D26Q/0D28Q值為1.7~1.9。
[0013]優(yōu)選的是:所述的第一輪PCR擴(kuò)增體系中，DNA模板由待檢樣品DNA稀釋100倍體積后制得。
[0014]優(yōu)選的是:所述的2 X Taq PCR Master Mix 不含染料，其中 dATP、dCTP、dGTP、dTTP濃度相同，為0.4mmol/L ；Mgcl2濃度為4mmol/L ；Taq酶和Pfu DNA聚合酶總濃度為0.05U/μ L0
[0015]優(yōu)選的是:所述的第一輪PCR擴(kuò)增體系中，使用的引物為柑橘黃龍病亞洲種的16SrDNA引物，所述引物為SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2，序列表信息如下所示:
[0016]SEQ ID NO:1:5' -AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'
[0017]SEQ ID NO:2:5/ -AAGGAGGTGA TCCAGCC-3'，
[0018]引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2濃度相同，為5 μ mol/L，兩條引物體積比為1:1。
[0019]優(yōu)選的是:所述的第二輪PCR擴(kuò)增體系中，使用的引物為柑橘黃龍病亞洲種的16SrDNA引物，所述引物為SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4，序列表信息如下所示:
[0020]SEQ ID NO:3:5' -GCGCGTATGC AATACGAGCG GCA-3'
[0021]SEQ ID NO:4:5' -GCCTCGCGAC TTCGCAACCC AT-3/ ，
[0022]引物SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4濃度相同，為5 μ mol/L，兩條引物體積比為1:1。
[0023]優(yōu)選的是:所述的第二輪PCR擴(kuò)增體系中，DNA模板由第一輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍體積后制得。
[0024]優(yōu)選的是:所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)包括第一輪擴(kuò)增反應(yīng)和第二輪擴(kuò)增反應(yīng)第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，94°C變性45sec，58°C退火30sec，72°C延伸45sec，35個(gè)循環(huán)，72°C最后延伸7min ;第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，94°C變性45sec, 55°C退火 30sec, 72°C延伸 45sec, 35 個(gè)循環(huán)，72°C最后延伸 7min。
[0025]本發(fā)明的有益效果:
[0026](I)本發(fā)明的PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系為7yL~IOyL,在大幅度減少2XTaq PCRMaster Mix和引物劑量的基礎(chǔ)上， 可達(dá)到20 μ L或25 μ L反應(yīng)體系檢測(cè)出來的效果，大幅度降低了檢測(cè)經(jīng)濟(jì)成本。
[0027](2)本發(fā)明所需的試劑量少，能減輕對(duì)環(huán)境的污染。
[0028](3)巢氏PCR檢測(cè)克服了常規(guī)PCR檢測(cè)單次擴(kuò)增“平臺(tái)期效應(yīng)”的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大的提高了 PCR的敏感性；降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大進(jìn)行的可能性，保證了反應(yīng)的特異性；內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增的模板是外側(cè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，第二輪擴(kuò)增反應(yīng)能否進(jìn)行，也是對(duì)第一輪擴(kuò)增反應(yīng)正確性的鑒定，因引可以保證整個(gè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性及可行性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1是實(shí)施例1中20 μ L擴(kuò)增體系經(jīng)過PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的電泳圖；
[0030]圖2是實(shí)施例1中7 μ L擴(kuò)增體系經(jīng)過PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種修改，這些等價(jià)變化同樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0032]柑橘黃龍病亞洲種的16S rDNA 引物 SEQ ID NO:1/SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:3/SEQID NO:4由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0033]引物SEQ ID NO:1/SEQ ID N0:2序列表信息如下:
[0034]SEQ ID NO:1:5' -AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'
[0035]SEQ ID NO:2:5/ -AAGGAGGTGA TCCAGCC-3'。[0036]引物SEQ ID N0:3/SEQ ID NO:4序列表信息如下:
[0037]SEQ ID NO:3:5' -GCGCGTATGC AATACGAGCG GCA-3'
[0038]SEQ ID NO:4:5' -GCCTCGCGAC TTCGCAACCC AT-3/。
[0039]實(shí)施例1 [0040]剪取疑似有黃龍病葉片的主葉脈約lOOmg，加入液氮充分研磨至粉末狀，置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。按照試劑盒提供的方法提取DNA(試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，為快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng))。DNA提取液通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，DNA的0D26(i/0D28(i值為1.7，加TE Buffer稀釋100倍體積后，制成第一輪PCR擴(kuò)增體系DNA模板。將 2.5μ L 的 DNA 模板、2.5μ L 的 2XTaq PCR Master Mix、0.125 μ L 的引物 SEQ IDNO: 1,0.125 μ L的引物SEQ ID NO: 2，加入滅菌雙蒸水使擴(kuò)增體系最終體積為7 μ L，使用的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2 引物濃度都是 5 μ mol/L ;2XTaq PCR Master Mix 不含染料，其中 dATP、dCTP、dGTP、dTTP濃度相同，為 0.4mmol/L ;Mgcl2濃度為 4mmol/L ;Taq酶和Pfu DNA聚合酶總濃度為0.05U/ μ L0 (購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(版本號(hào):01182013 ；目錄號(hào):CW0716)。將樣品管放入PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng):941:預(yù)變性41^11，941:變性45sec，58°C退火30sec，72°C延伸45sec，35個(gè)循環(huán)，72°C最后延伸7min。
[0041]所得的第一輪PCR產(chǎn)物加TE Buffer稀釋20倍體積后，制成第二輪PCR擴(kuò)增體系DNA模板。取2.5 μ LDNA模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)。將2.5 μ L的DNA模板、2.5 μ L的2XTaq PCR Master Mix、0.125 μ L 的引物 SEQ ID NO:3、0.125 μ L 的引物 SEQ ID Ν0:4，加入滅菌雙蒸水使擴(kuò)增體系最終體積為7 μ L，使用的SEQ ID N0:3/SEQ ID N0:4引物濃度都是5 μ mol/L。將樣品管放入PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng):94°C預(yù)變性4min，94°C變性45sec, 55°C退火 30sec，72°C延伸 45sec，35 個(gè)循環(huán)，72°C最后延伸 7min。
[0042]所得的第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，按每克瓊膠糖加入I X TAE緩沖液IOml配置成濃度為1%的瓊脂糖膠。把凝好的膠放在IXTAE電泳緩沖液的電泳槽中，取2μ L6XLoading buffer與5 μ L PCR產(chǎn)物混合均勻后上樣，對(duì)比使用的Marker為DNAMarker W ；
[0043]在上述相同的實(shí)驗(yàn)操作條件下，只調(diào)整第一輪和第二輪擴(kuò)增體系里各物質(zhì)的加入量，各物質(zhì)的加入量為:2.0yL 的DNA模板、10.0yI^^2XTaq PCR Master Mix、1.0yL 的引物，加入滅菌雙蒸水7.0使第一輪和第二輪的擴(kuò)增體系最終體積為20 μ L。最后取5μ L的PCR產(chǎn)物和2 μ L的6 X Loading buffer混合均勻后上樣，對(duì)比使用的Marker是DM2000。在電壓130V下電泳時(shí)間15min。電泳結(jié)束后，在FIRE READER XS D-56-26.M凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。實(shí)施例2
[0044]剪取疑似有黃龍病葉片的主葉脈約lOOmg，加入液氮充分研磨至粉末狀，置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。按照試劑盒提供的方法提取DNA(試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，為快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng))。DNA提取液通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，DNA的0D26(i/0D28(i值為1.8，加TE Buffer稀釋100倍體積后，制成第一輪PCR擴(kuò)增體系DNA模板。將 2.5μ L 的 DNA 模板、2.5μ L 的 2XTaq PCR Master Mix、0.125 μ L 的引物 SEQ IDNO: 1,0.125 μ L的引物SEQ ID NO: 2，加入滅菌雙蒸水使擴(kuò)增體系最終體積為8 μ L，所述的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2 引物濃度都是 5 μ mol/L ;2XTaq PCR Master Mix 不含染料，其中 dATP、dCTP、dGTP、dTTP濃度相同，為 0.4mmol/L ;Mgcl2濃度為 4mmol/L ;Taq酶和Pfu DNA聚合酶總濃度為0.05U/ μ L0 (購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(版本號(hào):01182013 ；目錄號(hào):CW0716)。將樣品管放入PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng):941:預(yù)變性41^11，941:變性45sec, 58°C退火30sec, 72°C延伸45sec, 35個(gè)循環(huán)，72°C最后延伸7min。
[0045]所得的第一輪PCR產(chǎn)物加TE Buffer稀釋20倍體積后，制成第二輪PCR擴(kuò)增體系DNA模板。取2.5 μ LDNA模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)。將2.5 μ L的DNA模板、2.5 μ L的2XTaq PCR Master Mix、0.125 μ L 的引物 SEQ ID NO:3、0.125 μ L 的引物 SEQ ID Ν0:4，加入滅菌雙蒸水使擴(kuò)增體系最終體積為8 μ L，所述的SEQ ID N0:3/SEQ ID NO:4引物濃度都是5 μ mol/L。將樣品管放入PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng):94°C預(yù)變性4min，94°C變性45sec, 55°C退火 30sec, 72°C延伸 45sec, 35 個(gè)循環(huán)，72°C最后延伸 7min。
[0046]所得的第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，按每克瓊膠糖加入I X TAE緩沖液IOml配置成濃度為1%的瓊脂糖膠。把凝好的膠放在IXTAE電泳緩沖液的電泳槽中，取2μ L6XLoading buffer與5 μ L PCR產(chǎn)物混合均勻后上樣，對(duì)比使用的Marker為DNAMarker W。
[0047]在上述相同的實(shí)驗(yàn)操作條件下，只調(diào)整第一輪和第二輪擴(kuò)增體系里各物質(zhì)的加入量，各物質(zhì)的加入量為:2.0μ L的DNA模板、10.0μ L的2XTaq PCR Master Mix、1.0μ L的引物，加入滅菌雙蒸水7.0使第一輪和第二輪的擴(kuò)增體系最終體積為20 μ L。最后取5μ L的PCR產(chǎn)物和2 μ L的6 X Loading buffer混合均勻后上樣，對(duì)比使用的Marker為DM2000。在電壓130V下電泳時(shí)間15min。電泳結(jié)束后，在FIRE READER XS D-56-26.M凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。實(shí)施例3 [0048]剪取疑似有黃龍病葉片的主葉脈約lOOmg，加入液氮充分研磨至粉末狀，置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。按照試劑盒提供的方法提取DNA(試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，為快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng))。DNA提取液通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，DNA的0D26(i/0D28(i值為1.9，加TE Buffer稀釋100倍體積后，制成第一輪PCR擴(kuò)增體系DNA模板。將 2.5μ L 的 DNA 模板、2.5μ L 的 2XTaq PCR Master Mix、0.125 μ L 的引物 SEQ IDN0:1、0.125yL的引物SEQ ID NO: 2，加入滅菌雙蒸水使擴(kuò)增體系最終體積為10 μ L，使用的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2 引物濃度都是 5 μ mol/L ;2XTaq PCR Master Mix 不含染料，其中 dATP、dCTP、dGTP、dTTP濃度相同，為 0.4mmol/L ;Mgcl2濃度為 4mmol/L ;Taq酶和Pfu DNA聚合酶總濃度為0.05U/ μ L0 (購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(版本號(hào):01182013 ；目錄號(hào):CW0716)。將樣品管放入PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng):941:預(yù)變性41^11，941:變性45sec, 58°C退火30sec, 72°C延伸45sec, 35個(gè)循環(huán)，72°C最后延伸7min。
[0049]所得的第一輪PCR產(chǎn)物加TE Buffer稀釋20倍體積后，制成第二輪PCR擴(kuò)增體系DNA模板。取2.5 μ LDNA模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)。將2.5 μ L的DNA模板、2.5 μ L的2XTaq PCR Master Mix、0.125 μ L 的引物 SEQ ID NO:3、0.125 μ L 的引物 SEQ ID Ν0:4，加入滅菌雙蒸水使擴(kuò)增體系最終體積為10 μ L，使用的SEQ ID N0:3/SEQ ID NO: 4引物濃度都是5 μ mol/L。將樣品管放入PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng):94°C預(yù)變性4min，94°C變性45sec, 55°C退火 30sec, 72°C延伸 45sec, 35 個(gè)循環(huán)，72°C最后延伸 7min。
[0050]所得的第 二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，按每克瓊膠糖加入I X TAE緩沖液IOml配置成濃度為1%的瓊脂糖膠。把凝好的膠放在IXTAE電泳緩沖液的電泳槽中，取2μ L6XLoading buffer與5 μ L PCR產(chǎn)物混合均勻后上樣，對(duì)比使用的Marker為DNAMarker VII。在上述相同的實(shí)驗(yàn)操作條件下，只調(diào)整第一輪和第二輪擴(kuò)增體系里各物質(zhì)的加入量，各物質(zhì)的加入量為:2.0μ L的DNA模板、10.0μ L的2XTaq PCR Master MixU.0μ L的引物，加入滅菌雙蒸水7.0使第一輪和第二輪的擴(kuò)增體系最終體積為20 μ L。最后取5 μ L的PCR產(chǎn)物和2 μ L的6 X Loading buffer混合均勻后上樣，對(duì)比使用的Marker為DM2000。在電壓130V下電泳時(shí)間15min。電泳結(jié)束后，在FIRE READER XS D-56-26.M凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。
【權(quán)利要求】
1.一種柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟:(1)待檢樣品DNA提??；(2)配制PCR擴(kuò)增體系，所述的擴(kuò)增體系包括第一輪PCR擴(kuò)增體系和第二輪PCR擴(kuò)增體(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，其特征在于:所述的第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增體系最終體積為7 μ L~10 μ L，其中DNA模板 2.5 μ L、2 X Taq PCR Master Mix2.5 μ L、引物 0.25 μ L，余量為滅菌雙蒸水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的待檢樣品 DNA 的 OD260/OD280 值為 1.7 ~1.9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的第一輪PCR擴(kuò)增體系中，DNA模板由待檢樣品DNA稀釋100倍體積后制得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的2X TaqPCR Master Mix 不含染料，其中 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 濃度相同，為 0.4mmol/L ；Mgcl2 濃度為4mmol/L ；Taq酶和Pfu DNA聚合酶總濃度為0.05U/ μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的第一輪PCR擴(kuò)增體系中，使用的引物為柑橘黃龍病亞洲種的16S rDNA引物，所述引物為SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2，序列表信息如下所示:`SEQ ID N0:1:5/ -AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'SEQ ID NO:2:5' -AAGGAGGTGA TCCAGCC-3'。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的第二輪PCR擴(kuò)增體系中，使用的引物為柑橘黃龍病亞洲種的16S rDNA引物，所述引物為SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4，序列表信息如下所示:SEQ ID N0:3:5/ -GCGCGTATGC AATACGAGCG GCA-3'SEQ ID NO:4:5' -GCCTCGCGAC TTCGCAACCC AT-3/ 。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的第一輪PCR擴(kuò)增體系中，引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2濃度相同，為5 μ mol/L，兩條引物體積比為1:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的第二輪PCR擴(kuò)增體系中，引物SEQ ID NO: 3和SEQ ID N0:4濃度相同，為5 μ mol/L，兩條引物體積比為1:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的第二輪PCR擴(kuò)增體系中，DNA模板由第一輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍體積后制得。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)包括第一輪擴(kuò)增反應(yīng)和第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，94°C 變性 45sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 45sec，35 個(gè)循環(huán)，72 °C 最后延伸 7min ；第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，94°C變性45sec，55°C退火30sec，72°C延伸45sec, 35個(gè)循環(huán)，72°C最后延伸7min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103525943SQ201310532794
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月1日
【發(fā)明者】黃宏明, 廖惠紅, 王茜, 徐寧 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所