重組瓜氨酸酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種重組瓜氨酸酶的制備方法：首先化學(xué)合成序列如SEQ?ID?No.1所示的CTU基因編碼區(qū)DNA，再與表達(dá)載體pET-22b連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b-ctu，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），篩選陽性克隆經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組瓜氨酸酶；本發(fā)明成功合成并克隆了瓜氨酸酶的基因，構(gòu)建了大腸桿菌的重組表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)和分離純化了重組瓜氨酸酶CTU；純化的重組CTU經(jīng)過體外測(cè)定，具有活性，可以將瓜氨酸分解成為鳥氨酸，為酶法制備鳥氨酸增加了一條新途徑。
【專利說明】重組瓜氨酸酶的制備方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組瓜氨酸酶的制備方法，制得重組瓜氨酸酶可以水解瓜氨酸制備鳥氨酸。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]鳥氨酸，分子式H2N(CH2)3CH(NH2) COOH，是一種堿性氨基酸，是非蛋白質(zhì)氨基酸。鳥氨酸是人體代謝中必不可少的中間代謝產(chǎn)物，存在于人尿及動(dòng)物肝臟中，是代謝循環(huán)中最早發(fā)現(xiàn)的與尿素循環(huán)有關(guān)的重要氨基酸。在生物體內(nèi)，尿素循環(huán)具有重要的生理意義，對(duì)于體內(nèi)氨態(tài)氮的排出有重要作用。氨對(duì)組織細(xì)胞具有毒性作用，如引起肌肉共濟(jì)失調(diào)、過敏，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒害作用等，大量堆積會(huì)對(duì)大腦產(chǎn)生巨大損傷。因此，解除氨的毒性對(duì)于維持正常生理機(jī)能具有重要的意義。正常人體解除氨毒性的方式主要通過在肝臟進(jìn)行的尿素酸循環(huán)而完成。在尿素循環(huán)中，胺甲酰磷酸與鳥氨酸化合生成瓜氨酸和磷酸，瓜氨酸再轉(zhuǎn)化為精氨酸，精氨酸再裂解為尿素和鳥氨酸，鳥氨酸進(jìn)一步進(jìn)入下一輪循環(huán)，因此尿素循環(huán)也叫鳥氨酸循環(huán)。鳥氨酸和瓜氨酸均為尿素循環(huán)中的主要氨基酸，通過尿素循環(huán)將人體蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨基酸、氨基酸產(chǎn)生的氨轉(zhuǎn)化為尿素并排出體外而解毒，促進(jìn)氮的正常代謝。
[0003]因此，鳥氨酸在臨床上常用來進(jìn)行相 除作為試劑與注射液外，通常與精氨酸一起用于配置恢復(fù)疲勞的發(fā)泡飲料。鳥氨酸雖然是非蛋白氨基酸，但存在于生物體多種組織和細(xì)胞中，對(duì)肝硬化以及無顯著特點(diǎn)的感染、癌癥、外傷和燒傷的恢復(fù)有很大幫助，被廣泛用于制備保肝、護(hù)肝、治療肝病、抗疲勞、抗虛弱等各種復(fù)方氨基酸輸液及抗疲勞的發(fā)泡飲料中。研究發(fā)現(xiàn)烏氨酸可剌激腦垂體分泌生長(zhǎng)激素，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及糖與脂肪的分解代謝，增強(qiáng)肌肉和體力，起到減肥的作用。因此，它是抗衰老所需要的，它有助于維護(hù)肌肉和身體組織營養(yǎng)需求。鳥氨酸還能增加聚乙烯膠的合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖，有提高免疫功能和抗癌作用。鳥氨酸衍生物依氟鳥氨酸能抑制多膠合成，延緩腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，是新型抗癌藥物。門冬氨酸鳥氨酸注射液用于治療肝性腦病，機(jī)理可能與它們能夠快速激活肝臟解毒功能中的關(guān)鍵酶，清除體內(nèi)氨中毒，從而快速改善肝性腦病臨床癥狀，顯著提高患者神志清醒率并且極大縮短清醒時(shí)間。此外，鳥氨酸和精氨酸也是健美和肌肉營養(yǎng)補(bǔ)充品中的主要成分。鳥氨酸負(fù)責(zé)提高激素水平，人們需要它在體能訓(xùn)練中建立和保持肌肉。它有助于減少衰老過程中的肌肉損失。隨著年齡的老化，人體合成蛋白質(zhì)的效率會(huì)降低，肌肉組織再生能力也會(huì)降低。鳥氨酸通過提高生長(zhǎng)激素水平，有助于加快肌肉組織生產(chǎn)，并延遲衰老的影響。
[0004]目前鳥氨酸主要生產(chǎn)方法有化學(xué)法、發(fā)酵法和酶法3種(張鵬等，2009)?；瘜W(xué)法是利用弱堿水解精氨酸得到鳥氨酸和少量瓜氨酸?；瘜W(xué)法生產(chǎn)鳥氨酸產(chǎn)物為DL-型外消旋體，分離困難，生產(chǎn)過程不易控制，現(xiàn)已被淘汰。發(fā)酵法主要是利用微生物發(fā)酵，如利用精氨酸或瓜氨酸的營養(yǎng)缺陷型突變株來積累鳥氨酸。發(fā)酵法原料成本低廉，但是發(fā)酵液中成分復(fù)雜，后續(xù)分離困難。酶法是利用生物體內(nèi)的酶來水解精氨酸、瓜氨酸等生成鳥氨酸。該法轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品較純，利于后續(xù)分離。目前報(bào)道的酶法制備鳥氨酸的方法中，只有精氨酸酶，即利用該酶水解精氨酸得到鳥氨酸，但精氨酸酶大都來自于動(dòng)物的肝臟，成本較高。因此，有必要開發(fā)新酶來制備鳥氨酸。瓜氨酸水解也是制備鳥氨酸的重要途徑，利用瓜氨酸酶水解瓜氨酸制備鳥氨酸尚未報(bào)道。 [0005]瓜氨酸(Citrulline)的化學(xué)式是H2NC(O)NH(CH2)3CH(NH2)COOH，也是尿素循環(huán)的關(guān)鍵中間體。它是由Koga等于1914年首次從西瓜中分離到的，瓜氨酸通常存在于西瓜、植物種子等中，現(xiàn)代技術(shù)能夠?qū)⑵渲苯臃蛛x提純得到。瓜氨酸不止存在于植物中，比如肉，魚，乳，蛋等食物中也都有發(fā)現(xiàn)瓜氨酸的存在。瓜氨酸酶(citrulline ureidase, CTU,EC3.5.1.20)是一種能將瓜氨酸降解成鳥氨酸，CO2和氨的酶。Mahawar等(2009)已經(jīng)證明土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)表現(xiàn)出高的CTU活性，CTU是由土拉弗朗西斯菌基因(FTT0435)編碼的碳氮水解酶家族成員。土拉弗朗西斯菌是強(qiáng)致病菌，不適用進(jìn)行科學(xué)研究和安全生產(chǎn)。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一種重組瓜氨酸酶的制備方法，為酶法制備鳥氨酸提供了基礎(chǔ)。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0008]一種重組瓜氨酸酶的制備方法，所述方法包括:
[0009](I)化學(xué)合成序列如SEQ ID N0.1所示的CTU基因編碼區(qū)DNA ；
[0010](2)合成的DNA在5'端引入Nco I位點(diǎn)、3'端引入Xho I位點(diǎn)，經(jīng)過亞克隆化和測(cè)序確認(rèn)后，用Nco I/Xho I雙酶切目標(biāo)基因和表達(dá)載體pET-22b，酶切產(chǎn)物經(jīng)過割膠回收后，將目標(biāo)片段和載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，獲得重組質(zhì)粒pET-22b-ctu ；
[0011](3)重組質(zhì)粒pET-22b-ctu加入到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min，然后42°C水浴中熱擊1.5min后，迅速置于冰上2min，加入SOC培養(yǎng)基，再于37°C、200r/min搖床培養(yǎng)lh，取轉(zhuǎn)化液涂布到含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，經(jīng)PCR確認(rèn)，挑選出陽性克隆；所述SOC培養(yǎng)基終濃度組成如下:胰化蛋白胨20g/L，酵母提取物 5g/L, NaCl0.5g/L, KC12.5mmol/L, MgCl20.01mmol/L，葡萄糖 3.6g/L, ρΗ7.0，溶劑為ddH20 ；
[0012](4)挑取陽性克隆單菌落至含100 μ g/mL Amp、山梨醇l%(w/v,質(zhì)量體積百分比,濃度1%即IOOmL培養(yǎng)基中含有該組分Ig)的2XYT培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)至OD6tltl為0.5，加入0.5mM異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，20°C >200r/min搖床培養(yǎng)6h，收集菌體細(xì)胞，經(jīng)分離純化獲得所述重組瓜氨酸酶；所述2X YT培養(yǎng)基終濃度組成如下:蛋白胨16g/L，酵母提取物 10g/L，NaC15g/L, pH7.0，溶劑為 ddH20。
[0013]所述分離純化方法可如下:收集所得菌體細(xì)胞先用瓊脂糖磁珠試劑盒進(jìn)行細(xì)胞破碎，所得蛋白洗脫液進(jìn)行梯度透析脫鹽和復(fù)性，收集透析后蛋白液，即得所述重組瓜氨酸酶酶液。
[0014]具體梯度透析過程如下:將收集到的重組蛋白洗脫液小心的裝入透析袋中，加上夾子，放入裝有IL PBS緩沖液(含有250mM NaCl,500mM咪唑，pH7.0)的燒杯中，冰浴條件下磁力攪拌透析lh，然后換透析液IL PBS (含有125mM NaCl，250mM咪唑，ρΗ7.0)，繼續(xù)冰浴磁力攪拌下透析lh，再換透析液IL PBS (含有62.5mM NaCl, 125mM咪唑，pH7.0)，繼續(xù)冰浴磁力攪拌下透析lh，最后換透析液IL PBS(pH7.0)，透析過夜。收集透析后蛋白液，記錄體積，測(cè)試蛋白濃度和活性，濃度過低的話使用超濾濃縮管進(jìn)行濃縮。
[0015]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明成功合成并克隆了瓜氨酸酶的基因，構(gòu)建了大腸桿菌的重組表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)和分離純化了重組瓜氨酸酶CTU;純化的重組CTU經(jīng)過體外測(cè)定，具有活性，可以將瓜氨酸分解成為鳥氨酸，為酶法制備鳥氨酸增加了一條新途徑。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1 為 pET-22b_ctu 雙酶切結(jié)果； M:DNA ladder ；1:質(zhì)粒 pET-22b_ctu 經(jīng) Nco I/Not I雙酶切；
[0017]圖2為培養(yǎng)基添加物對(duì)CTU表達(dá)的影響；M:蛋白質(zhì)marker ；1:1%葡萄糖；2:l%NaCl ；3:1%甜菜堿；4:1%山梨醇；5:1%DTT ;箭頭所示為CTU蛋白；
[0018]圖3為培養(yǎng)基pH對(duì)CTU表達(dá)的影響；M:蛋白質(zhì)marker ;1~5:重組CTU分別在pH為6.0,6.5,7.0,7.5,8.0下誘導(dǎo)表達(dá)；箭頭所示即為CTU蛋白。
[0019]圖4為為表達(dá)重組蛋白CTU的大腸桿菌;M:蛋白質(zhì)marker ；1:菌體破碎后離心的上清液；2:菌體破碎、離心后沉淀的溶解液(包涵體溶解液)；3:培養(yǎng)基；
[0020]圖5為薄層層析測(cè)定蛋白酶活；1:瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品；2:鳥氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品；3:瓜氨酸在重組CTU催化后的反應(yīng)液。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0022]實(shí)施例1:
[0023]I表達(dá)載體的構(gòu)建
[0024]根據(jù)Mahawar等(2009)報(bào)道的CTU基因(FTT0435)序列化學(xué)合成按照大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的編碼區(qū)DNA?；瘜W(xué)合成由南京金斯瑞生物公司完成。
[0025]CTU基因的序列如下:
[0026]ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCATATCGACGACGACGACAAGCATATGCTCGAGATGGCGAATATAAAAGTTGCAGTTGTCCAATTATCTTTTAATGATAATGAAGCTGAAAATTTAGCAAAACTGGAGAGTAAAATTATTCAAGCAGCTAAAAATGGTGCAAAAATAATTCTTACTCCAGAGTTACCAAGTTATCTATATTTTTGCAAAAAACAAAATTCTAAATATTTTGATTTAGCTAAAACCATTGATGAATCACCAATAGTAAAATTATATAAACTCTTAGCACATAAATATAATATTGTTTTGCCTGCTAGTTTTTTTGAGAGAGATGGAAATGCTTGTTATAACTCGATAGCAATGATTGATGCGGATGGTTCGATAATGGGTGTATATCGTAAAGCCCATATTCCAGACGGTATTGGTTACCAAGAGAAATATTATTTCTCACCTGGAAGTGCTGGTTTTAAGGTTTGGGATACTAAATATGCTAAAGTTGGAGTTGGTATTTGCTGGGATCAATGGTTTCCAGAAGCTGCTAGAGTAATGGCTTTAAAAGGTGCTGAAATTTTATTATATCCAACAGCAATAGGGAGCGAACCACACTTACCAGATTACGATTCAAAAGATCATTGGCAAAGAGTGATGCAAGGGCATGCTGCGGCAAATATGTTGCCCGTATTAGCATCAAATAGATATGCAACTGAGGCAAATGATGATATCACAGCAACTTATTAT
【權(quán)利要求】
1.重組瓜氨酸酶的制備方法，所述方法包括: (1)化學(xué)合成序列如SEQID N0.1所示的CTU基因編碼區(qū)DNA ； (2)合成的DNA在5'端引入NcoI位點(diǎn)、3'端引入Xho I位點(diǎn)，經(jīng)過亞克隆化和測(cè)序確認(rèn)后，用Nco I/Xho I雙酶切目標(biāo)基因和表達(dá)載體pET-22b，酶切產(chǎn)物經(jīng)過割膠回收后，將目標(biāo)片段和載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，獲得重組質(zhì)粒pET-22b-ctu ； (3)重組質(zhì)粒pET-22b-ctu加入到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min，然后42°C水浴中熱擊1.5min后，迅速置于冰上2min，加入SOC培養(yǎng)基，再于37°C、200r/min搖床培養(yǎng)lh，取轉(zhuǎn)化液涂布到含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，經(jīng)PCR確認(rèn)，挑選出陽性克隆；所述SOC培養(yǎng)基終濃度組成如下:胰化蛋白胨20g/L，酵母提取物 5g/L, NaCl0.5g/L, KC12.5mmol/L, MgCl20.01mmol/L,葡萄糖 3.6g/L, ρΗ7.0，溶劑為ddH20 ； (4)挑取陽性克隆單菌落至含lOOyg/mLAmp、山梨醇1%的2 X YT培養(yǎng)基中，37 °C、200r/min培養(yǎng)至OD6tltl為0.5，加入0.5mM異丙基-β _D_硫代吡喃半乳糖苷，20°C、200r/min搖床培養(yǎng)6h，收集菌體細(xì)胞，經(jīng)分離純化獲得所述重組瓜氨酸酶；所述2 XYT培養(yǎng)基終濃度組成如下:蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，NaC15g/L, pH7.0，溶劑為ddH20。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)所述分離純化方法如下:收集所得菌體細(xì)胞先用瓊脂糖磁珠試劑盒進(jìn)行細(xì)胞破碎，所得蛋白洗脫液進(jìn)行梯度透析脫鹽和復(fù)性，收集透析后蛋白液，即得所述重 組瓜氨酸酶酶液。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103571816SQ201310534080
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】朱廷恒, 方三余, 王渭霞, 汪琨, 崔志峰 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)