一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法。通過設(shè)計(jì)特異的擴(kuò)增引物，PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增到了該基因的cDNA序列，其核苷酸序列具有1425bp，編碼的氨基酸序列具有474個(gè)氨基酸殘基。誘導(dǎo)多巴脫羧酶基因在淡水小龍蝦體內(nèi)過量表達(dá)可以提高淡水小龍蝦先天免疫系統(tǒng)中多巴轉(zhuǎn)化為多巴胺的能力，從而可以提高淡水小龍蝦的抗菌能力。
【專利說明】—種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]無脊椎動(dòng)物在進(jìn)化方面的地位要比脊椎動(dòng)物低，其免疫系統(tǒng)不如脊椎動(dòng)物發(fā)達(dá)，但是也具有比較全面的免疫類型和相關(guān)的信號途徑網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。無脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)在低等的甲殼類動(dòng)物中研究的較為清楚，目前統(tǒng)一稱為先天免疫系統(tǒng)。在以甲殼類動(dòng)物為代表的無脊椎動(dòng)物體內(nèi)，先天免疫系統(tǒng)主要包括物理屏障、細(xì)胞免疫和體液免疫三種形式。這個(gè)先天免疫系統(tǒng)發(fā)揮著防御細(xì)菌與病毒等病原微生物的侵染，物理屏障是防御病原微生物入侵的第一道天然屏障，主要包括甲殼類動(dòng)物的體表和腸道，細(xì)胞免疫主要包括免疫細(xì)胞的吞噬作用、結(jié)節(jié)的形成和包囊作用，體液免疫主要是指酚氧化酶原活化系統(tǒng)介導(dǎo)的黑化作用和相關(guān)信號途徑介導(dǎo)的抗菌肽類物質(zhì)的表達(dá)。
[0003]酚氧化酶原活化系統(tǒng)介導(dǎo)的黑化作用在發(fā)揮功能的過程中，需要借助于絲氨酸蛋白酶水解級聯(lián)反應(yīng)來將酚氧化酶原激活為酚氧化酶，活化后的酚氧化酶可以將多巴胺轉(zhuǎn)化為醌類物質(zhì)，形成包囊來進(jìn)一步發(fā)揮黑化作用。其中，作為酚氧化酶底物的多巴胺是由多巴脫羧酶催化多巴進(jìn)行脫羧反應(yīng)生成的，因此，多巴脫羧酶活性的高低可以影響多巴胺的濃度，從而影響黑化反應(yīng)的進(jìn)展，從而反應(yīng)了多巴脫羧酶的重要地位。一般情況下，當(dāng)發(fā)生病原微生物入侵之后，多巴脫羧酶的基因表達(dá)量就會(huì)被上調(diào)表達(dá)，從而蛋白質(zhì)表達(dá)量也會(huì)被上調(diào)，從而促進(jìn)了多巴 轉(zhuǎn)化為多巴胺的反應(yīng)進(jìn)行，使黑化作用進(jìn)一步加強(qiáng)，促進(jìn)宿主對于病原微生物的清除。在中國對蝦、凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、日本對蝦中，相關(guān)研究結(jié)果表明，細(xì)菌或者白斑病毒的入侵都會(huì)引起多巴脫羧酶基因的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步顯示了多巴脫羧酶通過參與黑化反應(yīng)的信號途徑從而發(fā)揮免疫防衛(wèi)作用，也就是說甲殼類動(dòng)物的多巴脫羧酶基因是一個(gè)先天免疫防御相關(guān)的基因。
[0004]淡水小龍蝦是一種重要的甲殼類動(dòng)物，具有較高的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖價(jià)值，一直是我國比較重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物。同時(shí)，伴隨著淡水小龍蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，細(xì)菌入侵和病毒感染造成的蝦類疾病也在頻繁發(fā)生，困擾著淡水小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。開展淡水小龍蝦先天免疫相關(guān)基因的研究工作，可以不斷完善先天免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)理論，同時(shí)，多巴脫羧酶基因的研究工作將會(huì)進(jìn)一步豐富先天免疫系統(tǒng)相關(guān)的免疫防御基因的種類與數(shù)量。更重要的是，開展淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因的研究工作將會(huì)為淡水小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)中病害的防治提供一定的理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC的核苷酸序列，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，具有1425bp。[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼的氨基酸序列，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2，具有474個(gè)氨基酸殘基。
[0007]同時(shí)，本發(fā)明還提供該淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆方法。
[0008]本發(fā)明所提供的多巴脫羧酶基因Pc-DDC來源于淡水小龍奸(Procambarusclarkii)，命名為Pc-DDC基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，具有1425bp。
[0009]上述多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼的蛋白質(zhì)來源于淡水小龍奸(Procambarusclarkii)，命名為Pc-DDC蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2，具有474個(gè)氨基酸殘基。
[0010]上述淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆方法，包括如下步驟:
[0011](1)選用淡水小龍蝦作為實(shí)驗(yàn)材料，利用動(dòng)物總RNA提取試劑盒提取各組織總RNA,獲得淡水小龍蝦各個(gè)組織的總RNA樣品；
[0012](2)以步驟(1)獲得的總RNA樣品作為模板，利用一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得淡水小龍蝦各個(gè)組織的cDNA樣品；
[0013](3)設(shè)計(jì)擴(kuò)增淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼區(qū)的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0014]Pc-DDC-F: 5' -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
[0015]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0016]以步驟(2)中的淡水小龍蝦各個(gè)組織的cDNA樣品作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0017](4)將步驟(3)獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，之后進(jìn)行EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切，并且與經(jīng)過EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞之后，進(jìn)行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進(jìn)行序列測定，獲得淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0018](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學(xué)Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進(jìn)行氨基酸序列的翻譯,獲得對應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0020]本發(fā)明涉及一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法。該基因在淡水小龍蝦體內(nèi)過量表達(dá)可以提高淡水小龍蝦先天免疫系統(tǒng)中多巴轉(zhuǎn)化為多巴胺的能力，從而可以提高淡水小龍蝦的抗菌能力。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述
[0022]實(shí)施例1淡水小龍蝦肝胰腺組織中多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆
[0023](1)選用淡水小龍蝦肝胰腺組織作為實(shí)驗(yàn)材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動(dòng)物總RNA快速抽提試劑盒進(jìn)行總RNA的提取,獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織的總RNA樣品；
[0024](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦肝胰腺組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織的cDNA樣品；[0025](3)設(shè)計(jì)擴(kuò)增淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼區(qū)的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0026]Pc-DDC-F:5/ -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
[0027]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0028]以步驟(2)中的淡水小龍蝦肝胰腺組織的cDNA樣品作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0029](4)將步驟(3)獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，之后進(jìn)行EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切，并且與經(jīng)過EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R進(jìn)行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織多巴脫羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0030](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學(xué)Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進(jìn)行氨基酸序列的翻譯,獲得對應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0031]實(shí)施例2淡水小龍蝦血淋巴組織多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆
[0032]( I)選用淡水小龍蝦作為實(shí)驗(yàn)材料，利用淡水小龍蝦血淋巴抗凝劑作為佐劑，使用醫(yī)用注射器從淡水小龍蝦腹節(jié)中部抽取血淋巴組織液，之后，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動(dòng)物總RNA快速抽提試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織的總RNA樣品；
[0033](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦血淋巴組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織的cDNA樣品；`
[0034](3)設(shè)計(jì)擴(kuò)增淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼區(qū)的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0035]Pc-DDC-F:5/ -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
[0036]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0037]以步驟(2)中的淡水小龍蝦血淋巴組織的cDNA樣品作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0038](4)將步驟(3)獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，之后進(jìn)行EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切，并且與經(jīng)過EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R進(jìn)行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織多巴脫羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0039](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學(xué)Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進(jìn)行氨基酸序列的翻譯,獲得對應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
`[0040]實(shí)施例3淡水小龍蝦腮組織中多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆
[0041](I)選用淡水小龍蝦腮組織作為實(shí)驗(yàn)材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的TotalRNA Extractor (Trizol)動(dòng)物總RNA快速抽提試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，獲得淡水小龍蝦腮組織的總RNA樣品；
[0042](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦腮組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得淡水小龍蝦腮組織的cDNA樣品；
[0043](3)設(shè)計(jì)擴(kuò)增淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼區(qū)的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0044]Pc-DDC-F:5/ -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3' [0045]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0046]以步驟(2)中的淡水小龍蝦腮組織的cDNA樣品作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0047](4)將步驟(3)獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，之后進(jìn)行EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切，并且與經(jīng)過EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R進(jìn)行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，獲得淡水小龍蝦腮組織多巴脫羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0048](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學(xué)Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進(jìn)行氨基酸序列的翻譯,獲得對應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
【權(quán)利要求】
1.一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC，其特征在于，其核苷酸序列為SEQ IDN0.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC，其特征在于，淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
3.一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)選用淡水小龍蝦作為實(shí)驗(yàn)材料，利用動(dòng)物總RNA提取試劑盒提取各組織總RNA，獲得淡水小龍蝦各個(gè)組織的總RNA樣品； (2)以步驟(1)獲得的總RNA樣品作為模板，利用一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得淡水小龍蝦各個(gè)組織的cDNA樣品； (3)設(shè)計(jì)擴(kuò)增淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼區(qū)的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
Pc-DDC-F: 5' -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
Pc-DDC-R:5/ -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3/ 以步驟(2)中的淡水 小龍蝦各個(gè)組織的cDNA樣品作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物； (4)將步驟(3)獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，之后進(jìn)行EcoRI和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切，并且與經(jīng)過EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞之后，進(jìn)行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進(jìn)行序列測定，獲得淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC基因序列。 (5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學(xué)Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進(jìn)行氨基酸序列的翻譯,獲得對應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
【文檔編號】C12N9/88GK103667324SQ201310534689
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】杜志強(qiáng), 任乾, 李新蒼 申請人:內(nèi)蒙古科技大學(xué)