一種生產(chǎn)中低溫β-甘露聚糖酶的菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)中低溫β-甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)OPUS-001,該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC?No.7361。本發(fā)明的菌株培養(yǎng)方法簡單,原料易得,菌株產(chǎn)酶性能強,所產(chǎn)堿性β-甘露聚糖酶制劑活力高且耐堿耐鹽,在中低區(qū)間溫度條件下對油田用瓜爾膠或改性瓜爾膠壓裂液具有高效破膠能力,且與壓裂液中絕大部分化學助劑無配伍禁忌,可滿足油田壓裂工程需求。
【專利說明】一種生產(chǎn)中低溫β-甘露聚糖酶的菌株及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株及其發(fā)酵、酶分離提純和該菌株在中低溫井水力壓裂破膠中的應用,以及利用該菌株制備β -甘露聚糖酶的方法。所述β-甘露聚糖酶具有嗜中低溫、耐堿性的特點。
【背景技術(shù)】
[0002]水力壓裂是油氣井增產(chǎn)、水井增注的一項重要技術(shù)措施。當?shù)孛娓邏罕媒M將高粘液體以大大超過地層吸收能力的排量注入井中,在井底附近憋起超過井壁附近地應力及巖石抗張強度的壓力后,即在地層中形成裂縫。隨著帶有支撐劑的液體注入裂縫中,裂縫逐漸向前延伸。這樣在地層中形成了具有足夠長度以及一定寬度和高度的填砂裂縫。由于人工裂縫具有很高的滲濾能力,使油氣能夠通暢流入井中,起到增產(chǎn)增注的作用。
[0003]在水基壓裂液體系稠化劑選擇方面,油田曾使用過田菁膠、魔芋膠、香豆膠等天然植物膠,但目前,主要使用的是瓜爾膠或其衍生物(羥丙基瓜爾膠HPG、羧甲基羥丙基瓜爾膠CMHPG,等)。這類植物膠除魔芋膠主要成分為葡萄甘露聚糖外,其他均屬于半乳甘露聚糖類,經(jīng)交聯(lián)劑(中低溫井用硼砂,中高溫用有機硼)交聯(lián)形成高強度的凍膠,具有很強的攜砂能力。入井液連同支撐劑注入地縫后,為了不使改造的油層導流裂縫堵塞,必須降低粘度將膠體破膠后返排回地面,以保所造裂縫的高通透性。
[0004]目前油田主力破膠劑為過硫酸鹽,如過硫酸銨,過硫酸鉀等。作為化學物質(zhì),過硫酸鹽的半衰期和釋放游離氧的速率受溫度影響極大;以過硫酸銨為例,其在100°C時的半衰期為0.17h,80°C為2.lh,60°C為38.5h,而在40°C時則長達1030h。這種特性決定其在操作上存在不可控性,即:過硫酸鹽往往在高溫環(huán)境下破膠過快,而在中低溫時無法實現(xiàn)完全破膠,或必須添加激活劑方可部分起效。
`[0005]在40_55°C中低溫環(huán)境下,增大過硫酸鹽的投加量,雖然可實現(xiàn)壓裂液的最終水化破膠,但同時會導致壓裂液粘度過低,從而影響壓裂液攜砂性能,施工安全性差;而且殘渣量高、返排率低、壓裂效果差,導致油氣采出效率不高。若采用經(jīng)修飾包裝的膠囊破膠劑,雖可部分保障壓裂液的流變性能,但過硫酸鹽在井下低溫環(huán)境下依然難以分離出使壓裂液凍膠破膠水化所需的足夠的游離氧;為了能滿足快速破膠的施工目的,需要追加大量的膠囊破膠劑,最終導致成本大幅提高,同時增加了對地層的傷害風險。
[0006]而在低于40°C的低溫環(huán)境下,過硫酸鹽單獨作用無法實現(xiàn)徹底破膠,必須添加激活劑物質(zhì)。而這類激活劑通常具有強烈刺激性氣味,因本身也是化學類物質(zhì),對地層存在傷害隱患;同時還可能存在水溶解性差、易被氧化、見光分解、穩(wěn)定性差、成本高昂等缺點。
[0007]同時,過硫酸鹽破膠后的殘余聚合物分子量通常介于20-30萬之間,雖然表觀粘度下降,但實際對地層依然會造成一定的傷害。同時含硫過氧化物毒性大,腐蝕性強,對環(huán)境有一定的污染。
[0008]在上世紀晚期,油田工程師開始將生物酶應用于水力壓裂破膠。其原理在于:特定的聚糖水解酶可與植物膠(主要為瓜爾膠及其衍生物)中的主要成分半乳甘露聚糖形成了遠遠低于糖鍵活化能的過渡物,使活化分子大大增多,從而顯著提升糖鍵斷裂速率。用于破膠的生物酶遵循酶配位催化動力學中的“鎖鑰”原理,只作用于瓜爾膠及其衍生物結(jié)構(gòu)中的特定糖苷鍵,從而將聚合物降解為小分子量低聚糖,并可進一步在其他催化功能的復合酶的協(xié)同作用下,將低聚糖轉(zhuǎn)化為非還原性的單糖和二糖。而生物酶本身在瓜爾膠及其衍生物降解前后不產(chǎn)生消耗,只是參與反應過程,反應后又恢復原狀,繼續(xù)發(fā)揮催化作用。所以在低濃度劑量下,在短時間內(nèi)即可將大量的瓜爾膠及其衍生物徹底分解,此為其高效性的機制所在。 [0009]β -1, 4-D-甘露聚糖酶(β -1, 4-D-mannanmannanohydrolase, EC.3.2.1.78 ;以下簡稱β_甘露聚糖酶)是一類能水解以3-l,4-D-甘露糖為主鏈的多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖等)的內(nèi)切酶,是目前被應用證明為最理想的壓裂破膠用生物酶。
[0010]β-甘露聚糖酶用途廣泛,目前被廣泛應用在食品、醫(yī)藥、造紙、紡織印染、飼料工業(yè)等領(lǐng)域。與上述應用領(lǐng)域不同的是,因油氣藏的特殊環(huán)境,破膠用酶需要耐受較高的礦化度,同時由于油田措施用壓裂液一般為堿性,要求生物酶需要在偏堿條件下(pH8.0-11.0)保持較高的活力。同時還要保證其具有與殺菌劑、表活類物質(zhì)等油田化學助劑良好的配伍性能。
[0011]目前,堿性β-甘露聚糖酶在國外已廣泛應用于油氣田壓裂工藝,尤其適于中低溫油氣井的壓裂破膠(20-50°C),但尚無20°C以下低溫條件下的應用報道。在國內(nèi),有關(guān)低溫β_甘露聚糖酶報道較多,但多為通過天然誘變菌株或工程菌所產(chǎn)生的酸性、中性甘露聚糖酶,且大多是用作為飼料添加劑或洗滌劑和醫(yī)藥,不適應油藏的具體要求。在PH適應性方面,堿性β -甘露聚糖酶也有專利報道,但目前只是在洗滌劑和食品及飼料行業(yè)應用(馬延和等公開:CN1266096)。
[0012]此外,低產(chǎn)和高成本限制了 β_甘露聚糖酶在油氣藏開發(fā)中的應用規(guī)模,能改變這種狀況的最重要的途徑之一是篩選和培育可產(chǎn)高活力的且耐堿性的β-甘露聚糖酶的高產(chǎn)酶菌株。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0013]本發(fā)明旨在提供一種可通過發(fā)酵生產(chǎn)中低溫井水力壓裂破膠用耐堿性β -甘露聚糖酶的微生物菌株,并提供該菌株的培養(yǎng)及發(fā)酵方法,以及發(fā)酵產(chǎn)物中β -甘露聚糖酶活性成份的分離純化方法及應用。
[0014]本發(fā)明所提供的生產(chǎn)β -甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)0PUS-001是由陜西省神木縣紅堿淖湖畔植物根部土壤樣品中篩選獲得的。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱:CGMCC,地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號,中國科學院微生物研究所,郵編:100101)保藏,保藏號為CGMCC N0.7361,保藏日期為2013年3月22日。
[0015]本發(fā)明的枯草芽孢桿菌0PUS-001的生理生化特性及遺傳學特征為如下:
[0016](I)菌體特征:單個細胞(0.7-0.8) X (2.0-3.0) μ m,著色均勻。無莢膜,周生鞭毛,能運動。芽孢(0.6-0.9)X (1.0-1.5) μπι,橢圓到柱狀,位于菌體中央或稍偏,芽孢形成后菌體不膨大。在液體培養(yǎng)基中生長時,常形成皺醭。
[0017](2)菌落特征:菌落表面粗糙不透明,污白色或微黃色。[0018](3)理化性質(zhì):革蘭氏陽性菌,需氧菌??衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉,分解色氨酸形成吲哚。
[0019](4)遺傳學特征:16S rDNA分析,表明其屬于枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)相似但又有區(qū)別的類群,定名為OPUS-OOI,菌株0PUS-001的16S rDNA序列具體可見序列表。
[0020]本發(fā)明還提供利用所述枯草芽孢桿菌0PUS-001制備β -甘露聚糖酶的方法,包括如下步驟:
[0021](I)將枯草芽孢桿菌0PUS-001菌種接種于瓜爾膠固體培養(yǎng)基上,30-37°C、培養(yǎng)1_2 天;
[0022](2)將固體培養(yǎng)基單菌落接于種子培養(yǎng)基內(nèi),30_37°C、震蕩培養(yǎng)1_2天,成為種子液;
[0023](3)將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,30_37°C、培養(yǎng)2_5天,離心,得發(fā)酵液;
[0024](4)發(fā)酵液經(jīng)分離純化,得β -甘露聚糖酶;
[0025]其中所述瓜爾膠固體培養(yǎng)基為:瓊脂粉20g/L,瓜爾膠2_4g/L,酵母浸粉5g/L,K2HPO4 5g/L,MgSO4.7H20 0.2g/L,補水至 1L,pH 7.0-8.0 ;所述種子培養(yǎng)基為:瓜爾膠2_4g/L,酵母浸粉 5g/L,K2HPO4 5g/L, MgS04.7H20 0.2g/L,L-谷氨酸 5.0g/L, KCl 0.5g/L, MnSO4 5X l(T5g/L,F(xiàn)eSO4.7H20 1.5X l(T6g/L,CuSO4.5H20 1.6 X l(T8g/L,補水至 1L, pH7.0-8.0 ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:瓜爾膠2-4g/L,酵母浸粉5g/L,NaNO3 5g/L,K2HPO4 5g/L,MgSO4.7H20 0.2g/L, MnSO4 5 X l(T5g/L,F(xiàn)eSO4.7H20 1.5 X l(T6g/L,CuSO4.5H20 1.6 X l(T8g/L,補水至 1L,pH 7.0-8.0。
[0026]在上述方法中,步驟(2)中所述的震蕩速率為150-200rpm/min。
[0027]在上述方法中,步驟(3)中所述的種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比優(yōu)選為1:20-50。
[0028]在上述方法中,步驟(4)所述的分離純化包括如下步驟:
[0029]①將發(fā)酵液離心,取上清液濾去殘渣得粗提液;
[0030]②粗提液中加入的飽和硫酸銨,經(jīng)放置沉淀后離心,取上清液;上清液加入飽和硫酸銨,經(jīng)放置沉淀后離心,得沉淀;沉淀溶于PBS,透析得到透析酶液;
[0031]③步驟(2)的透析酶液經(jīng)Sepharose G_75柱層析分離,獲得β -甘露聚糖酶洗脫峰組份,超濾膜濃縮,得液狀β -甘露聚糖酶;
[0032]進一步,將步驟③得到的液狀β -甘露聚糖酶經(jīng)冷凍干燥,得粉狀β -甘露聚糖酶。
[0033]進一步,步驟②中所述的飽和硫酸銨濃度為45-65% ;粗提液與飽和硫酸銨的體積比為1:10,上清液與飽和硫酸銨的體積比為0.5:1。
[0034]本發(fā)明還提供枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is )0PUS_001在中低溫井水力壓裂破膠中的應用。進一步,所述枯草芽孢桿菌0PUS-001用于發(fā)酵制備中低溫井水力壓裂破膠用耐堿性β-甘露聚糖酶。其應用方向還包括,但不限于,石油工業(yè)領(lǐng)域中的聚合物解堵、含聚廢水及泥漿處理、原油品質(zhì)改良;以及在食品、醫(yī)藥、造紙、紡織印染、飼料工業(yè)等領(lǐng)域。本發(fā)明所述的中低溫是指70°c以下的溫度,尤其是指10-70°c,更好為20-50°C。
[0035]本發(fā)明的方法獲得的β -甘露聚糖酶能夠高效降解瓜爾膠及其衍生物,其pH耐受范圍4.0-11.0,最適反應pH為6.8-9.2,溫度耐受范圍10_70°C,最適溫度30_50°C;在上述溫度和pH范圍內(nèi),酶活力可保持85%以上。
[0036]本發(fā)明的0PUS-001發(fā)酵產(chǎn)物,以及經(jīng)純化的發(fā)酵液活力組份可制備中低溫井水力壓裂破膠用耐堿性β -甘露聚糖酶,其應用方向還包括,但不限于,石油工業(yè)領(lǐng)域中的聚合物解堵、含聚廢水及泥漿處理、原油品質(zhì)改良;以及在食品、醫(yī)藥、造紙、紡織印染、飼料工業(yè)等領(lǐng)域。
[0037]本發(fā)明的有益效果:
[0038]本發(fā)明的枯草芽孢桿菌0PUS-001是一株高產(chǎn)β -甘露聚糖酶的菌株,所產(chǎn)β -甘露聚糖酶其PH耐受范圍廣,尤其是在堿性條件下還能保持較高的酶活力;其溫度耐受范圍廣,尤其是在低溫10-20°C下也能維持足以完成凍膠徹底水化的酶活力,是現(xiàn)有技術(shù)未能達到的溫度極限。
[0039]本發(fā)明的菌株培養(yǎng)方法簡單,培養(yǎng)基原料易得,菌株產(chǎn)酶性能強,發(fā)酵產(chǎn)物中β -甘露聚糖酶含量高,其產(chǎn)品得率高于3.2g/L,所產(chǎn)堿性β -甘露聚糖酶制劑活力高且耐堿耐鹽,在中低區(qū)間溫度條件下對油田用瓜爾膠或改性瓜爾膠壓裂液具有高效破膠能力,且與壓裂液中絕大部分化學助劑無配伍禁忌,可滿足油田壓裂工程需求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1為實施例3得到的透析酶液的Sepharose G-75柱層析洗脫圖,其中峰2為本發(fā)明的中低溫β_甘露聚糖酶洗脫峰。
[0041]圖2為實施例3得到的本發(fā)明中低溫液態(tài)β -甘露聚糖酶的SDS-PAGE電泳圖。
[0042]圖3為本發(fā)明的β -甘露聚糖酶溫度適應性檢測結(jié)果。
[0043]圖4為本發(fā)明的β -甘露聚糖酶pH適應性檢測結(jié)果。`【具體實施方式】
[0044]下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明,但不以任何方式限制本發(fā)明。另外,下述實施例中,如無特殊說明,所使用的實驗方法均為常規(guī)方法,所用材料、試劑等均可從生物或化學試劑公司購買。
[0045]下述實施例采用的培養(yǎng)基及其組成為如下:
[0046]瓜爾膠固體培養(yǎng)基:瓊脂粉20g/L,瓜爾膠2.5g/L,酵母浸粉5g/L,K2HPO4 5g/L,MgSO4.7H20 0.2g/L,補水至 IL ;
[0047]種子培養(yǎng)基:瓜爾膠2.5g/L,酵母浸粉 5g/L,K2HPO4 5g/L,MgSO4.7H20 0.2g/L,L-谷氨酸 5.0g/L,KCl 0.5g/L, MnSO4 5 X 10_5g/L, FeSO4.7Η20 1.5 X l(T6g/L,CuSO4.5Η20
1.6 X l(T8g/L,補水至 1L, pH7.0-8.0 ;
[0048]發(fā)酵培養(yǎng)基:瓜爾膠2-4g/L,酵母浸粉 5g/L,NaNO3 5g/L, K2HPO4 5g/L, MgSO4.7Η20
0.2g/L, MnSO4 5X l(T5g/L,F(xiàn)eSO4.7H20 1.5X l(T6g/L,CuSO4.5H20 1.6 X l(T8g/L,補水至ILj 7.0-8.0o
[0049]實施例1菌株OPUS-OOl的分離與鑒定
[0050]1.菌株 0PUS-001 的分離
[0051 ] (I)樣品采集:自陜西省神木縣紅堿淖湖畔植物根部土壤;
[0052](2)熱處理:將土壤樣品用無菌的去離子水制成懸浮液,在80°C條件下熱處理10分鐘,殺死菌體;
[0053](3)富集培養(yǎng):向經(jīng)過熱處理的懸浮液中添加營養(yǎng)源,在37°C條件下培養(yǎng)2天后,可以獲得經(jīng)過富集的產(chǎn)芽孢細菌;
[0054](4)分離純化:將經(jīng)過富集培養(yǎng)的微生物培養(yǎng)液進行梯度稀釋,選取稀釋倍數(shù)為10_5、10_6和10_7的三個梯度在固體培養(yǎng)基上進行平板劃線,37°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基內(nèi),37°C、震蕩培養(yǎng)I天,成為種子液;
[0055](5)將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,37°C、培養(yǎng)3天,選取最大限度能夠利用瓜爾膠生長的單菌株,命名為菌株0PUS-001。
[0056]2.菌株 0PUS-001 的鑒定
[0057](I)菌體特征:單個細胞(0.7-0.8) X (2.0_3.0) μ m,著色均勻。無莢膜,周生鞭毛,能運動。芽孢(0.6-0.9)X (1.0-1.5) μπι,橢圓到柱狀,位于菌體中央或稍偏,芽孢形成后菌體不膨大。在液體培養(yǎng)基中生長時,常形成皺醭。
[0058](2)菌落特征:菌落表面粗糙不透明,污白色或微黃色。
[0059](3)理化性質(zhì):革蘭氏陽性菌,需氧菌。可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉,分解色氨酸形成吲哚。
[0060](4) 16S rDNA分析,表明其屬于枯草芽孢桿菌屬(Bacillus subtilis)相似但又有區(qū)別的類群,定名為0PUS-001,被分類于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,其保藏號為CGMCC N0.7361,保藏日期:2013年3月22日。
[0061]實施例20PUS-001`菌株的發(fā)酵
[0062]將0PUS-001菌種接種于瓜爾膠固體培養(yǎng)基上,在37°C培養(yǎng)2天;將固體培養(yǎng)基單菌落接于盛有1/5-1/4體積比的種子培養(yǎng)基內(nèi),于37°C下以150rpm震蕩培養(yǎng)I天,成為種子液;將種子液按1/50體積比加入發(fā)酵培養(yǎng)基中,37°C下培養(yǎng)3天,獲得發(fā)酵液。
[0063]實施例3 β -甘露聚糖酶的分離純化
[0064]用如下方法進行分離純化0PUS-001菌株發(fā)酵液中的β -甘露聚糖酶:
[0065](I)將實施例1的發(fā)酵液在3000rpm、4°C離心15min,取上清,過濾得粗提液;
[0066](2)粗提液中加入10倍量的45-65%的飽和硫酸銨,將溶液放在磁力攪拌器上4°C過夜;20,000rpm、4°C離心30min,保留上清液;上清液再加飽和硫酸銨到0.5:1 (v/v),再次離心得到沉淀;將沉淀溶于PBS,用PBS溶液透析除去硫酸氨,得透析酶液;
[0067](3)步驟(2)的透析酶液用S印harose G-75柱層析分離,上樣后用0.1M NaCl水溶液洗脫,收集洗脫液,每餾分1.5mL,共收集30個餾分,經(jīng)280nm檢測,收集β -甘露聚糖酶的洗脫峰組份(如圖1中峰2),用PBS溶液透析除鹽后,用超濾濃縮的方法,在4°C下,15000rpm離心lOmin,得液狀β -甘露聚糖酶;
[0068](4)步驟(3)得到的液態(tài)甘露聚糖酶,冷凍干燥,得凍干甘露聚糖酶粉劑。
[0069]圖2為步驟(3)得到的液態(tài)β -甘露聚糖酶的SDS-PAGE電泳圖,分子量大小約為38KD。
[0070]實施例4 β -甘露聚糖酶活力的測定
[0071]1.酶活檢測所需試劑:1)0.38%瓜膠溶液,用pH4.8-5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制;2) 1%甘露糖標準溶液;3) DNS試劑,取酒石酸鉀鈉182g,溶于500mL蒸餾水中加熱,于熱溶液中依次加入3,5- 二硝基水楊酸6.3g, NaOH 21g,苯酹5g,亞硫酸鈉5g,攪拌至溶,冷卻后用蒸餾水定容至1000mL,貯于棕色試劑瓶中,室溫下放置15天以后使用,使用有效期一個半月;4)酶標準樣品,取2mL純化后的液態(tài)β-甘露聚糖酶加入蒸餾水溶解均勻后,定容至IOOmL ;凍干凍干β -甘露聚糖酶粉劑以蒸餾水逐級稀釋,控制OD28tl值在0.5-1.0之間;
[0072]2.分別吸取1%甘露糖標準溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL于50mL容量瓶中,用蒸餾水制成每HiL分別含甘露糖200,400,600,800,1000,1200 Ug的標準液。各取不同濃度標準液0.5mL于試管中,加2mL pH4.8-5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,加2.5mL DNS試劑煮沸5分鐘。冷后加水5mL,搖勻,520nm處測定光密度,以0.5mL水代替標準液來作空白。以所得的光密度值為橫坐標,以對應的標準甘露糖液濃度的二分之一的值(即:0.100,
0.200,0.300,0.400,0.500,0.600,此為每管中甘露糖的mg數(shù))為縱坐標,繪制標準曲線,并計算出回歸方程;
[0073]3.于試管A和B中加底物溶液2mL,50°C預熱5分鐘后在A管中加0.5mL酶液,50°C精確反應10分鐘,取出各加2.5mL DNS試劑,B管中補加0.5mL酶液,立即煮沸5分鐘,冷后各加水5mL,搖勻,520nm處測定光密度(B管為空白對照),并從標準曲線上查出相應的還原糖含量并折算成酶單位;
[0074]4.酶活定義:在特定溫度及pH下(50°C、pH4.8-5.0), Imin內(nèi)分解瓜膠中β -甘露聚糖產(chǎn)生相當于Iymol甘露糖的還原集團所需的酶量,規(guī)定為I個酶活單位(實為國際單位IU),以μ mol/min表示;
[0075]5.酶活力計算
[0076]按式(I)計算酶活力:
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)β -甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 0PUS-001,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏號為CGMCCN0.7361。
2.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌OPUS-OOl在中低溫井水力壓裂破膠中的應用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的應用,其特征在于,所述枯草芽孢桿菌0PUS-001用于發(fā)酵制備中低溫井水力壓裂破膠用甘露聚糖酶。
4.一種β_甘露聚糖酶的生產(chǎn)方法,其特征在于,包括如下步驟: Cl)將枯草芽孢桿菌0PUS-001菌種接種于瓜爾膠固體培養(yǎng)基上,30-37°C、培養(yǎng)1_2天; (2)將固體培養(yǎng)基單菌落接于種子培養(yǎng)基內(nèi),30-37°C、震蕩培養(yǎng)1-2天,成為種子液; (3)將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,30-37°C、培養(yǎng)2-5天,離心,得發(fā)酵液; (4)發(fā)酵液經(jīng)分離純化,得β-甘露聚糖酶; 其中所述瓜爾膠固體培養(yǎng)基為:瓊脂粉20g/L,瓜爾膠2-4g/L,酵母浸粉5g/L,K2HPO45g/L,MgSO4.7H20 0.2g/L,補水至 1L,ρΗ7.0-8.0 ;所述種子培養(yǎng)基為:瓜爾膠 2_4g/L,酵母浸粉 5g/L, K2HPO4 5g/L,MgS04.7H20 0.2g/L, L-谷氨酸 5.0g/L, KCl 0.5g/L,MnSO45X l(T5g/L,F(xiàn)eSO4.7H20 1.5X l(T6g/L,CuSO4.5H20 1.6 X l(T8g/L,補水至 1L, pH7.0-8.0 ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:瓜爾 膠2-4g/L,酵母浸粉5g/L,NaNO3 5g/L,K2HPO4 5g/L,MgSO4.7H200.2g/L, MnSO4 5X l(T5g/L,F(xiàn)eSO4.7H20 1.5X l(T6g/L,CuSO4.5H20 1.6 X l(T8g/L,補水至1L, pH7.0-8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法,其特征在于,步驟(2)中所述震蕩速率為150-200rpm/mino
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法,其特征在于,步驟(3)中種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:20-50。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法,其特征在于,步驟(4)所述的分離純化包括如下步驟: ①將發(fā)酵液離心,取上清液濾去殘渣得粗提液; ②粗提液中加入的飽和硫酸銨,經(jīng)放置沉淀后離心,取上清液;上清液加入飽和硫酸銨,經(jīng)放置沉淀后離心,得沉淀;沉淀溶于PBS,透析得到透析酶液; ③步驟(2)的透析酶液經(jīng)SepharoseG-75柱層析分離,獲得β -甘露聚糖酶洗脫峰組份,超濾膜濃縮,得液狀甘露聚糖酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)方法,其特征在于,在步驟③得到的液狀β-甘露聚糖酶冷凍干燥,得粉狀β -甘露聚糖酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)方法,其特征在于,步驟②中所述的飽和硫酸銨濃度為45-65% ;粗提液與飽和硫酸銨的體積比為1:10,上清液與飽和硫酸銨的體積比為0.5:1。
【文檔編號】C12N9/42GK103555629SQ201310539350
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】趙靜 申請人:趙靜