一種能夠緩解銅毒性的植物乳桿菌及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種植物乳桿菌（Lactobacillus?plantarum），于2013年9月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC?NO.8246，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明的植物乳桿菌具有耐酸性，在體外對(duì)銅離子有良好的耐受能力，能夠耐受起始濃度為50mg/L的銅離子溶液，并且對(duì)銅離子有較強(qiáng)的吸附作用，能降低銅暴露小鼠肝臟、腎臟、腦中的銅含量，減輕銅暴露小鼠的病理癥狀與緩解小鼠肝損傷降低血清中AST、ALT含量的作用。所述的植物乳桿菌用于制備緩解銅毒性的藥物組合物與發(fā)酵食品，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種能夠緩解銅毒性的植物乳桿菌及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌及其用途，特別是一種能夠緩解銅毒性的植物乳桿菌及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]銅是人體必需微量元素之一，廣泛分布于生物組織中，大部分以有機(jī)復(fù)合物存在，很多是金屬蛋白，以酶的形式起著功能作用；但是過(guò)量的銅會(huì)在人體內(nèi)積累引起銅中毒，影響內(nèi)臟器官和神經(jīng)系統(tǒng)。隨著工業(yè)的發(fā)展，銅鋅礦的開(kāi)采和冶煉、金屬加工等愈加頻繁，銅在水體和土壤中的含量逐年增加，造成植物的污染(如水稻和大麥生長(zhǎng)不良，并污染糧食籽粒)和動(dòng)物體內(nèi)蓄積(如肝腎臟腦等)，最終通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)蓄積。銅污染事件層出不窮，2010年7月3日，福建省杭紫金礦業(yè)紫金山銅礦濕法廠發(fā)生污水滲漏事故，約9100立方米的含銅酸水外滲引發(fā)汀江流域污染，僅棉花灘庫(kù)區(qū)死魚和魚中毒約達(dá)378萬(wàn)斤，福建有關(guān)部門已認(rèn)定此次污染屬重大突發(fā)環(huán)境事件。2012年09月國(guó)家質(zhì)檢總局進(jìn)出口食品安全局公布的進(jìn)境不合格食品、化妝品信息中，福州世紀(jì)金花進(jìn)出口有限公司進(jìn)口的2.2噸赫伯望2008瑞帕設(shè)拉子干紅葡萄酒在檢測(cè)時(shí)銅含量嚴(yán)重超標(biāo)，已被銷毀，擋在國(guó)門之外。除此之外，也有相關(guān)報(bào)道提及科研人員通過(guò)定點(diǎn)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，華南礦區(qū)周邊魚類重金屬污染嚴(yán)重，其中鰱魚的肝臟能積累銅超過(guò)lOOOppm，也就是1000毫克/千克。而國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)則規(guī)定魚肉的食用標(biāo)準(zhǔn)是50毫克/千克。
[0003]過(guò)量的銅在人體內(nèi)和蛋白質(zhì)及酶等發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使它們失去活性，也可能在人體的某些器官中累積，造成慢性中毒。當(dāng)銅含量超過(guò)人體需要量的100~150倍時(shí)易引起中毒反應(yīng)。銅中毒的臨床表現(xiàn)為急性胃腸炎，中毒者口中有金屬味，流涎、惡心、嘔吐、上腹痛、腹瀉，有時(shí)可有嘔血和黑便；慢性者記憶力減退、注意力不集中、易激動(dòng)，多發(fā)性神經(jīng)炎、神經(jīng)衰弱綜合癥、食欲不振、惡心嘔吐、腹痛腹瀉黃疸、肝腫大、肝功能異常等，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟的損害最為顯著。
[0004]針對(duì)銅蓄積和銅中毒，尋找一種新的有效的干預(yù)或治療方法顯得十分必要。乳酸菌是一類能夠使碳水化合物發(fā)酵并產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱，廣泛存在于自然發(fā)酵乳制品、發(fā)酵植物食品，如泡菜、酸菜、青貯飼料以及人腸道中。長(zhǎng)期科學(xué)研究結(jié)果表明，以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有:防治乳糖不耐癥、恢復(fù)人體腸道內(nèi)菌群平衡維護(hù)人體健康、抗腫瘤和預(yù)防癌癥作用、控制人體內(nèi)毒素水平、保護(hù)肝臟并增強(qiáng)肝臟的解毒等功能。乳酸菌作為一種食品級(jí)的微生物，不像金屬螯合劑有嚴(yán)重的毒副作用，因此很有潛力成為具有緩解銅毒性功能的新型保健食品或藥物。
[0005]目前涉及具有緩解銅中毒效應(yīng)的乳酸菌專利申請(qǐng)文件不多，CN101252943A公開(kāi)了一些植物乳桿菌，它用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物吸收鐵、鋅、鈣、鎂離子。
[0006]因此，篩選出一種具有緩解銅毒性功能的乳酸菌，并且證明它們?cè)趧?dòng)物模型中具有良好的緩解銅中毒作用，同時(shí)研制這些乳酸菌實(shí)際的用途就顯得十分必要。探索乳酸菌在緩解銅毒性效應(yīng)中的效果就可以進(jìn)一步地挖掘益生菌的功能，開(kāi)發(fā)具有更高保健價(jià)值的乳酸菌，為利用膳食策略緩解銅毒性效應(yīng)開(kāi)辟出新的途徑和解決方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),于2013年9月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCCN0.8246，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0008]所述的植物乳桿菌CGMCC N0.8246具有下述性質(zhì):
[0009]⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2.5環(huán)境下存活良好；
[0010]⑵在體外含銅培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)銅離子有良好的耐受能力；
[0011]⑶在體外含銅水溶液中孵育，對(duì)銅離子有良好的吸附能力；
[0012]⑷具有降低銅暴露小鼠體內(nèi)銅含量與緩解銅暴露小鼠銅毒性的作用。
[0013]所述植物乳桿菌CGMCC N0.8246在制備緩解銅毒性的藥物組合物與發(fā)酵食品中的應(yīng)用也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0014]所述藥物組合物是由植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌劑及其它在藥學(xué)上可接受的載體及輔料組成，植物乳桿菌CGMCC N0.8246中活性植物乳桿菌CGMCC N0.8246大于IO6CFU/g°`
[0015]其中，在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自在藥學(xué)上通常使用的填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑的載體。
[0016]所述藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液劑型。
[0017]在發(fā)酵食品是使用含有植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌種也屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，發(fā)酵食品包括但不限于乳制品、豆制品與果蔬制品。
[0018]所述乳制品是牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆醬；所述的果蔬制品是黃瓜、胡蘿卜、甜菜、芹菜或圓白菜制品。
[0019]上述的發(fā)酵劑可以通過(guò)下述制備步驟得到的:
[0020]A、培養(yǎng)基的制備:使用以所述培養(yǎng)基總重量計(jì)87.7%水將10%酶水解脫脂乳、0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨與0.3%酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其pH為6.8，這樣得到所述的培養(yǎng)基;
[0021]B、保護(hù)劑的制備:使用水與保護(hù)劑原料混合制備得到含有100g/L脫脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸鈉的保護(hù)劑；
[0022]C、將植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌種按照以所述培養(yǎng)基的重量計(jì)2_4%接種量接種到在溫度110-120°C下滅菌8-12min的所述培養(yǎng)基中，在溫度37°C下培養(yǎng)18h，用pH7.2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述保護(hù)劑重懸達(dá)到濃度101(lCFU/mL ;接著，讓該懸浮液在溫度37°C下預(yù)培養(yǎng)60min，再進(jìn)行冷凍干燥得到所述的發(fā)酵劑。
[0023]下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0024]本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),該菌菌株已于2013年9月23日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏，其保藏號(hào)為8246。本發(fā)明人根據(jù)下述篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)大量篩選實(shí)驗(yàn)與分析驗(yàn)證，從我國(guó)傳統(tǒng)食品，例如泡菜，發(fā)酵奶酒中篩選出的植物乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum) CGMCC N0.8246具有下述性質(zhì):
[0025]⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2.5環(huán)境下存活良好；
[0026]⑵在體外含銅培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)銅離子有較好的耐受能力；
[0027]⑶在體外含銅水溶液中孵育，對(duì)銅離子有良好的吸附能力；
[0028]⑷具有降低銅暴露小鼠體內(nèi)銅含量與緩解銅暴露小鼠銅毒性的作用。下面將詳細(xì)描述這些實(shí)驗(yàn)與分析認(rèn)證結(jié)果。
[0029]1、具有耐酸性，在pH3.0-9.0環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2.5環(huán)境下存活良好
[0030]將冷凍保存的本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC N0.8246分別接種于MRS培養(yǎng)基(例如青島海博生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品)中，在溫度37°C下培養(yǎng)24h，再經(jīng)MRS培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)2~3次后，取ImL植物乳桿菌CGMCC N0.8246培養(yǎng)液，分別接種于19mL不同pH值(3.0-9.0)的MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37°C下培養(yǎng)24h，測(cè)定初始和培養(yǎng)結(jié)束后的0D600值，利用這個(gè)值測(cè)量在細(xì)菌培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度，從而估計(jì)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。0D600值是采用分光光度法在波長(zhǎng)600nm處測(cè)定的細(xì)菌培養(yǎng)液的吸光值，它通常用于表示在細(xì)菌培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度，以確定液體培養(yǎng)物中細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。
[0031]實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明植物乳桿菌CGMCC N0.8246在pH3.0-9.0的環(huán)境中生長(zhǎng)良好，因此得以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用與前面所述的同樣培養(yǎng)方式，用1.0mL pH7.2PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗菌體兩次，再用1.0mL pH7.2磷酸鹽緩沖液重懸，其重懸乳桿菌菌體與9.0mL pH2.5人工胃液混合，然后在溫度37°C下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在開(kāi)始(Oh)和3h時(shí)取樣，用MRS瓊脂培養(yǎng)基澆注培養(yǎng)進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定活菌數(shù)并計(jì)算其存活率。存活率是在該培養(yǎng)液中在第3h時(shí)的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值與在第Oh時(shí)活菌數(shù)對(duì)數(shù)值之比，以％表示。本發(fā)明篩選存活率在80%以上的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。
[0032]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌CGMCC N0.8246在pH2.5的人工胃液環(huán)境中的存活率在90%以上。由此可見(jiàn)，植物乳桿菌CGMCC N0.8246具有耐酸性，在pH2.5的環(huán)境下存活良好。
[0033]2、在體外含銅培養(yǎng)基中培養(yǎng),對(duì)銅離子有良好的耐受能力
[0034]通過(guò)植物乳桿菌CGMCC N0.8246在不同銅含量培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線可以研究其在體外對(duì)銅離子的耐受能力。在無(wú)菌條件下，向IL水中加入0.1965gCuS04.5Η20，即得到濃度為50mg/L的銅離子水溶液。使用這種銅離子水溶液溶解MRS固體培養(yǎng)基干粉得到含50mg/L銅離子的MRS液體培養(yǎng)基。同樣地，分別配制150mg/L、500mg/L銅離子濃度的MRS液體培養(yǎng)基。按照以含銅離子的MRS液體培養(yǎng)基重量計(jì)2%接種量將進(jìn)入穩(wěn)定期的植物乳桿菌CGMCCN0.8246菌液接入所述含銅離子的MRS液體培養(yǎng)基中。采用96孔板法，在其培養(yǎng)24h過(guò)程中，每20min測(cè)一次OD值，從而得到如附圖1所示的植物乳桿菌CGMCC N0.8246生長(zhǎng)曲線。
[0035]附圖1的結(jié)果表明，本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC N0.8246對(duì)銅離子的具有良好的耐受能力。
[0036]3、在體外含銅水溶液中孵育，對(duì)銅離子有良好的吸附能力
[0037]在無(wú)菌條件下，按照耐酸性(在pH3.0能夠生長(zhǎng))的篩選標(biāo)準(zhǔn)，從我國(guó)傳統(tǒng)食品，例如泡菜，發(fā)酵奶酒中篩選出16株乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行了純化和活化培養(yǎng)。將上述菌株轉(zhuǎn)移至50mg/L銅溶液中，使菌體最終濃度達(dá)到lg/L。將含有上述菌株的樣品在37°C下培養(yǎng)lh，使用Beckman離心機(jī)以6000r/min離心20min,再用無(wú)菌水洗漆、離心一次。分離除去上清液，向得到的菌體中加入純硝酸，放入微波消解爐中消解20min，得到的消解液使用原子吸收光譜分析儀(Spectr AA220, Varian, USA)測(cè)定銅離子含量，以確定各菌株對(duì)銅離子的吸附能力。這些測(cè)定結(jié)果列于附圖2中。
[0038]附圖2清楚地表明，與其它試驗(yàn)菌株和對(duì)照菌株相比，本發(fā)明植物乳桿菌CGMCCN0.8246對(duì)銅離子的吸附量最大，因此，對(duì)銅離子具有良好的吸附能力。
[0039]4、對(duì)銅暴露小鼠具有緩解銅毒性的效應(yīng)
[0040]取20_25g健康雄性C57小鼠60只，隨機(jī)分為3組，每組含小鼠20只:陰性對(duì)照組，硫酸銅暴露模型對(duì)照組，植物乳桿菌CGMCC N0.8246干預(yù)組。實(shí)驗(yàn)0_4周，陰性空白對(duì)照組灌胃0.2mL脫脂乳；其余2組灌胃0.2mL銅濃度為10g/L硫酸銅。第一次灌胃結(jié)束I小時(shí)后，植物乳桿菌CGMCC N0.8246干預(yù)組灌喂0.2mL按本說(shuō)明書實(shí)施例3制備的濃度2.0X109CFU/mLCGMCC N0.8246脫脂乳懸液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血并處死小鼠，分別取肝、腎，腦在按照與前面所述的相同消化處理后，采用原子吸收分光光度法測(cè)定銅含量。這些測(cè)定結(jié)果列于附圖3中。
[0041]通過(guò)對(duì)銅暴露染毒模型組及共同喂食銅及植物乳桿菌CGMCC N0.8246組小鼠體內(nèi)肝臟、腎臟、腦中的銅含量，以及血清中AST、ALT的比較，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明植物乳桿菌CGMCCN0.8246能夠降低小鼠腦、肝臟、腎臟中的銅含量，緩解銅暴露小鼠銅毒性的作用。
[0042]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“緩解銅毒性”應(yīng)該理解是能夠使機(jī)體內(nèi)的銅中毒現(xiàn)象減輕或消失的過(guò)程，即使用含有本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌劑的藥物組合物能夠降低銅中毒小鼠的腦、肝臟、腎組織中的銅含量，減輕銅中毒小鼠的病理癥狀，降低小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量。
[0043]本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC N0.8246具有下述生物學(xué)特性:
[0044]菌體特征:呈革蘭氏染色陽(yáng)性，細(xì)胞桿狀，菌體約0.5-1.0 μ m寬，2-4 μ m長(zhǎng)，成單、成對(duì)或者成鏈，不形成芽孢，兩端圓形。
[0045]菌落特征:在MRS培養(yǎng)基上形成明顯的菌落，直徑在0.3-2.0mm之間，圓形，邊緣整齊，乳白色，不透明，表面濕潤(rùn)光滑，不產(chǎn)生色素。
[0046]生長(zhǎng)特性:該菌株的最低生長(zhǎng)溫度為20°C，最高生長(zhǎng)溫度為40°C，在溫度30_37°C下生長(zhǎng)最佳，最高和最低初始生長(zhǎng)pH為9.0和2.5，最適生長(zhǎng)初始pH為6.0 ;本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌株的延遲期相對(duì)較短，4h左右開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12h就達(dá)到穩(wěn)定期。
[0047]16s rDNA分析:后發(fā)現(xiàn)與植物乳桿菌有97%同源性，命名為植物乳桿菌。
[0048]本發(fā)明還涉及所述的植物乳桿菌CGMCC N0.8246在制備緩解銅毒性的藥物組合物與發(fā)酵食品中的用途。
[0049]所述的藥物組合物 是植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌劑與在藥學(xué)上可接受的載體組成的。
[0050]根據(jù)本發(fā)明，所述的植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌劑是采用通常的冷凍干燥制備技術(shù)將含有所述的植物乳桿菌CGMCC N0.8246的菌液制成的凍干粉劑，或是采用其它方法如噴霧干燥法制備得到的粉劑。[0051]所述的植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌劑含有106CFU/g以上的活性植物乳桿菌CGMCCN0.8246。
[0052]植物乳桿菌CGMCC N0.8246含量測(cè)定方法是本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員熟知的MRS平板菌落計(jì)數(shù)法。
[0053]在所述的藥物組合物中，所述植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌劑的量是所述藥物組合物重量的15-35%，優(yōu)選地是18-32%，更優(yōu)選地是20_30%。
[0054]根據(jù)本發(fā)明，在藥學(xué)上可接受的載體應(yīng)該是指在藥學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)藥物載體，例如是一種或多種選自在藥學(xué)上通常使用的填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑的載體。
[0055]根據(jù)本發(fā)明，所述的填充劑應(yīng)該理解是用來(lái)增加片劑重量和體積而便于壓片的輔料稀釋劑；或者應(yīng)該理解是用以吸收原料中多余液體成分的輔料吸收劑。
[0056]所述的填充劑選自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸鈣或微晶纖維素。
[0057]優(yōu)選地，所述的填充劑選自淀粉、蔗糖或微晶纖維素。
[0058]更優(yōu)選地，所述的填充劑選自淀粉或微晶纖維素。
[0059]根據(jù)本發(fā)明，所述的潤(rùn)濕劑應(yīng)該理解是藥物本身無(wú)粘性，但可潤(rùn)濕其藥物原輔料并誘發(fā)其粘性而制成顆粒的液體。 [0060]所述的潤(rùn)濕劑選自水、乙醇、淀粉或糖漿。
[0061]優(yōu)選地，所述的潤(rùn)濕劑選自水、乙醇或淀粉。
[0062]本發(fā)明使用潤(rùn)濕劑的量是以所述藥物組合物總重量計(jì)0.1-3.0%。
[0063]根據(jù)本發(fā)明，所述的粘合劑應(yīng)該理解是當(dāng)原料藥物本身無(wú)粘性或粘性不足時(shí)，需加入粘性物質(zhì)以便于制粒，這種粘性物質(zhì)稱為粘合劑。
[0064]所述的粘合劑選自纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮。
[0065]優(yōu)選地，所述的粘合劑選自纖維素衍生物、明膠或聚乙烯吡咯烷酮。
[0066]更優(yōu)選地，所述的粘合劑選自明膠或聚乙烯吡咯烷酮。
[0067]本發(fā)明使用粘合劑的量是以所述藥物組合物總重量計(jì)0.5-5.0%。
[0068]根據(jù)本發(fā)明，所述的崩解劑應(yīng)該理解是一種能夠加入片劑中而促進(jìn)其片劑在胃腸液中快速崩解成細(xì)小粒子的輔料。人們知道，片劑經(jīng)過(guò)壓縮后的硬度大，如果其中不含有可以促進(jìn)崩解作用的輔料，它在胃腸道中崩解很慢，影響療效。
[0069]所述的崩解劑選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉。
[0070]優(yōu)選地，所述的崩解劑選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂或碳酸氫鈉。
[0071]更優(yōu)選地，所述的崩解劑選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素或碳酸氫鈉。
[0072]本發(fā)明使用崩解劑的量是以所述藥物組合物總重量計(jì)5.0-15.0%。
[0073]根據(jù)本發(fā)明，所述的潤(rùn)滑劑應(yīng)該理解是一種有利于提高片劑在制粒過(guò)程中的流動(dòng)性，防止片劑材料粘附在制片機(jī)模子上，有利于片劑脫模的化學(xué)物質(zhì)。
[0074]所述的潤(rùn)滑劑選自滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇。
[0075]優(yōu)選地，所述的潤(rùn)滑劑選自滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂或聚乙二醇。[0076]更優(yōu)選地，所述的潤(rùn)滑劑選自滑石粉或硬脂酸鈣。
[0077]本發(fā)明使用潤(rùn)滑劑的量是以所述藥物組合物總重量計(jì)0.5-3.0%。
[0078]根據(jù)本發(fā)明，所述的矯味劑應(yīng)該理解是在藥品中用以改善或屏蔽藥物不良?xì)馕逗臀兜?，使病人難以覺(jué)察藥物強(qiáng)烈苦味或其它異味，例如辛辣、刺激等的藥用輔料。
[0079]所述的矯味劑例如選自單糖漿、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖漿或櫻桃糖漿的甜味劑；檸檬、茴香或薄荷油的芳香劑；海藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉的膠漿劑；檸檬酸、酒石酸與碳酸氫鈉混合物的泡騰劑。
[0080]優(yōu)選地，所述的矯味劑選自單糖漿、蔗糖、橙皮糖漿或櫻桃糖漿的甜味劑；檸檬或薄荷油的芳香劑；海藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠或羧甲基纖維素鈉的膠漿劑；酒石酸與碳酸氫鈉混合物的泡騰劑。
[0081]更優(yōu)選地，所述的矯味劑選自蔗糖、橙皮糖漿或櫻桃糖漿的甜味劑；檸檬油芳香劑；海藻酸鈉或阿拉伯膠的膠漿劑；酒石酸與碳酸氫鈉混合物的泡騰劑。
[0082]本發(fā)明使用矯味劑的量是以所述藥物組合物總重量計(jì)0.5%-2.0%。
[0083]本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌劑可以與在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合制成各種劑型，例如顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液，其中在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可以根據(jù)不同劑型進(jìn)行選擇，所使用的這些載體或賦形劑及其用量對(duì)于制藥【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員都是容 易確定的，也是顯而易見(jiàn)的。
[0084]在本發(fā)明中，采用制藥【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員熟知的普遍使用的方法和設(shè)備制備本發(fā)明藥物顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液。
[0085]所述的“劑型”一般應(yīng)該理解是適用于人的單劑量藥物形式，單個(gè)劑型含有為達(dá)到所需藥量的預(yù)定活性物質(zhì)，例如本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌劑。
[0086]在本發(fā)明中，所述的發(fā)酵食品是使用含有植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌種的發(fā)酵劑生產(chǎn)的乳制品、豆制品與果蔬制品。。
[0087]所述發(fā)酵劑的制備方法如下:
[0088]A、培養(yǎng)基的制備:使用以所述培養(yǎng)基總重量計(jì)87.7%水將10%酶水解脫脂乳、0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨與0.3%酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其pH為6.8，這樣得到所述的培養(yǎng)基;
[0089]B、保護(hù)劑的制備:使用水與保護(hù)劑原料制備得到含有100g/L脫脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸鈉的保護(hù)劑；
[0090]C、植物乳桿菌CGMCC N0.8246按照以所述培養(yǎng)基的重量計(jì)2_4%接種量接種到在溫度110-120°C下滅菌8-12min的所述培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C下培養(yǎng)18h，用pH7.2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述保護(hù)劑重懸達(dá)到濃度101(lCFU/mL ;接著，讓該懸浮液在溫度37°C下預(yù)培養(yǎng)60min，再采用凍干法制成所述的發(fā)酵劑。
[0091]所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪。
[0092]在本發(fā)明中，所述的牛奶應(yīng)該理解是牛乳、馬乳或還原乳。所述的還原乳是用以還原乳總重量計(jì)10-15%奶粉與85-90%軟化水配制的。所述的奶粉是目前市場(chǎng)上廣泛銷售的
女口
廣叩ο
[0093]所述的酸奶油是稀奶油經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成的奶油。酸奶油比甜奶油有更多的優(yōu)越性，香味更濃郁，奶油產(chǎn)量也更高；另外由于乳酸菌的代謝活動(dòng)抑制了有害微生物，所以消皇殺菌后再次污染微生物的風(fēng)險(xiǎn)也較低。
[0094]所述的干酪是由牛奶經(jīng)發(fā)酵制成的一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的食品。
[0095]所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆醬。它們都是我國(guó)的傳統(tǒng)食品或調(diào)味品。
[0096]所述的果蔬制品是黃瓜、胡蘿卜、甜菜、芹菜或圓白菜制品。
[0097]在生產(chǎn)乳制品、豆制品與果蔬制品時(shí)，按照下述方法使用本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌劑發(fā)酵劑:
[0098]通常，在生產(chǎn)乳制品、豆制品和果蔬制品的常規(guī)生產(chǎn)過(guò)程中，把本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC N0.8246菌劑發(fā)酵劑按照常規(guī)使用量接種到待處理的原料中，在能夠使所述植物乳桿菌CGMCC N0.8246繁殖的溫度、壓力下進(jìn)行發(fā)酵或存活，其代謝產(chǎn)物使發(fā)酵制品具有一定的酸度、香味等優(yōu)異特性，同時(shí)使產(chǎn)品延長(zhǎng)了保藏時(shí)間，改善了產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化性。
[0099]本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC N0.8246具有耐酸性，在體外對(duì)銅離子有良好的耐受能力，能夠耐受起始濃度為500mg/L的銅離子溶液。并且對(duì)銅離子有較強(qiáng)的吸附作用，可降低小鼠肝臟、腎臟、腦中的銅含量，并能顯著改善小鼠損傷指標(biāo)，緩解銅中毒小鼠的病理癥狀。所述的植物乳桿菌CGMCC N0.8246用于制備緩解銅中毒的藥物組合物與發(fā)酵食品，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0100]圖1是植物乳桿菌CGMCC N0.8246于含起始濃度為50mg/L，150mg/L, 500mg/L的銅離子培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線；
[0101]圖2是植物乳桿菌CGMCC N0.8246對(duì)銅離子的吸附情況。
`[0102]其中:菌株18即為本專利菌株CGMCC N0.8246，它與菌株14、ST_3為植物乳桿菌；NFM4為保加利亞乳桿菌；24為干酪乳桿菌'Tl、LGG、LR為鼠李糖乳桿菌；雙歧為兩歧雙歧桿菌；L.hel、13為瑞氏乳桿菌；2-3為德氏乳桿菌；La為嗜酸乳桿菌；N39、N38、N32均為分離自發(fā)酵奶酒的乳酸菌。
[0103]圖3是植物乳桿菌CGMCC N0.8246對(duì)銅暴露小鼠肝臟，腎臟，腦中銅水平的降低作用。
【具體實(shí)施方式】
[0104]實(shí)施例1:植物乳桿菌CGMCC N0.8246對(duì)銅離子的耐受能力實(shí)驗(yàn)
[0105]在無(wú)菌條件下，向IL水中加入0.1965gCuS04.5Η20，得到50mg/L的銅離子水溶液。使用這種銅離子水溶液溶解MRS培養(yǎng)基固體配料，得到含50mg/L銅離子的MRS液體培養(yǎng)基。MRS培養(yǎng)基是本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)基，它含有蛋白胨魚粉、酵母浸膏、葡萄糖、醋酸鈉、檸檬酸二銨、吐溫80、硫酸鎂、硫酸錳，pH6.2~6.4。
[0106]以與前面描述的同樣方式配制含有50mg/L、150mg/L與500mg/L銅離子濃度的MRS液體培養(yǎng)基。將進(jìn)入穩(wěn)定期的植物乳桿菌CGMCC N0.8246按照以含銅的MRS液體培養(yǎng)基重量計(jì)2%接種量接種于所述的含銅MRS液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用96孔板法每20min測(cè)一次OD值，持續(xù)24h，得到如附圖1所示的植物乳桿菌CGMCC N0.8246生長(zhǎng)曲線。另外，將ImL所述的菌液接入不含銅的MRS液體培養(yǎng)基中，在同樣條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其結(jié)果作為空白對(duì)照結(jié)果，這些試驗(yàn)結(jié)果也列于附圖1中。[0107]由附圖1可以看出，在50mg/L、150mg/L與500mg/L銅離子濃度下，植物乳桿菌CGMCCN0.8246在24h內(nèi)生長(zhǎng)量與空白對(duì)照組接近吻合，因此，其結(jié)果表明植物乳桿菌CGMCCN0.8246對(duì)銅離子具有良好的耐受能力。
[0108]實(shí)施例2:植物乳桿菌CGMCC N0.8246對(duì)銅離子的吸附能力實(shí)驗(yàn)
[0109]按照耐酸性(在P H 3.0環(huán)境中能夠生長(zhǎng))的篩選標(biāo)準(zhǔn)，從我國(guó)傳統(tǒng)食品，例如泡菜，發(fā)酵奶酒中篩選出16株乳酸菌，將這16株乳酸菌在無(wú)菌條件下進(jìn)行純化和活化，純化和活化時(shí)乳酸菌使用MRS培養(yǎng)基。得到的菌體轉(zhuǎn)移到裝有50mg/L銅離子濃度溶液的容器中，而空白組則轉(zhuǎn)移到去離子水中。根據(jù)菌體質(zhì)量確定藍(lán)蓋瓶中液體的體積,使菌體的最終濃度達(dá)到lg/L。將以上樣品于溫度37°C下培養(yǎng)2h。使用Beckman離心機(jī)以轉(zhuǎn)速6000r/min離心20min,再用無(wú)菌水洗漆、離心一次。分離除去上清液，向得到的菌體中加入純硝酸，放入微波消解爐中消解20min,得到的消解液使用原子吸收光譜分析儀(SpectrAA220, Varian, USA)測(cè)定銅離子含量，以確定不同菌株吸附銅離子的能力。
[0110]其試驗(yàn)結(jié)果如附圖2所示。由附圖2可以看出，不同的菌種對(duì)銅離子的吸附能力差異較大。其中植物乳桿菌CGMCC N0.8246的吸附能力最強(qiáng)，可吸附19700 μ g/g銅離子。
[0111]實(shí)施例3:植物乳桿菌CGMCC N0.8246灌喂小鼠的耐受劑量實(shí)驗(yàn)
[0112]將植物乳桿菌CGMCC N0.8246凍干菌粉重懸于脫脂乳粉中，制成濃度為
2.0X 109CFU/mL的懸液。取約20g健康雄性C57小鼠10只，每日給予該濃度懸液灌胃一次，觀察一周，記錄死亡和體重情況。
[0113]這些試驗(yàn)結(jié)果列于表1中。這些結(jié)果表明，喂食濃度2.0X 109CFU/mL的植物乳桿菌CGMCC N0.8246未對(duì)小鼠造成明顯影響，體重明顯上升，無(wú)死亡現(xiàn)象產(chǎn)生。小鼠外觀無(wú)明顯病理癥狀。
[0114]表1:喂食濃度2.0 X 109`CFU/mL的植物乳桿菌CGMCC N0.8246對(duì)小鼠體重的變化情況
時(shí)間(周) I_2_3_4
[0115]休1R (g) 19 1±0 9 20_2土 1.7 21.6土 1.5 22.7土2.1
死亡情況 -_-_-_-
[0116]注:_:小鼠無(wú)死亡
[0117]實(shí)施例4:植物乳桿菌CGMCC N0.8246對(duì)銅暴露小鼠體內(nèi)銅水平的降低作用
[0118]取20_25g健康雄性C57小鼠60只，隨機(jī)分為3組，每組含小鼠20只:陰性對(duì)照組，硫酸銅暴露模型對(duì)照組，植物乳桿菌CGMCC N0.8246干預(yù)組。實(shí)驗(yàn)0_4周，陰性空白對(duì)照組灌胃0.2mL脫脂乳；其余2組灌胃0.2mL銅濃度為10g/L硫酸銅。第一次灌胃結(jié)束I小時(shí)后，植物乳桿菌CGMCC N0.8246干預(yù)組灌喂0.2mL按本說(shuō)明書實(shí)施例3制備的濃度2.0X109CFU/mLCGMCC N0.8246脫脂乳懸液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血并處死小鼠，分別取肝、腎，腦在按照與前面所述的相同消化處理后，采用如前所述的原子吸收分光光度法測(cè)定銅含量。
[0119]這些測(cè)定結(jié)果列于附圖3中。由附圖3可以看出，本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCCN0.8246干預(yù)組中小鼠肝臟、腎臟、腦中的銅含量均比陰性對(duì)照組高，但均低于銅模型對(duì)照組。這說(shuō)明植物乳桿菌CGMCC N0.8246干預(yù)確實(shí)具有降低銅暴露小鼠體內(nèi)銅含量的作用。[0120]實(shí)施例5:棺物乳桿菌CGMCC N0.8246對(duì)銅中毒導(dǎo)致血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量升高的的緩解作用
[0121]取20_25g健康雄性C57小鼠60只，隨機(jī)分為3組，每組含小鼠20只:陰性對(duì)照組，硫酸銅暴露模型對(duì)照組，植物乳桿菌CGMCC N0.8246干預(yù)組。實(shí)驗(yàn)0_4周，陰性空白對(duì)照組灌胃0.2mL脫脂乳；其余2組灌胃0.2mL銅濃度為10g/L硫酸銅。第一次灌胃結(jié)束I小時(shí)后，植物乳桿菌CGMCC N0.8246干預(yù)組灌喂0.2mL按本說(shuō)明書實(shí)施例3制備的濃度2.0X109CFU/mL脫脂乳懸液。
[0122]實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用摘除眼球法處死小鼠,取血清,采用Ellmam的傳統(tǒng)方法(Tissuesu Ifhydry I groups."Archives of biochemistry and biophysics82 (I):70-77.)及南京建成試劑盒來(lái)測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量。
[0123]其試驗(yàn)結(jié)果列于下表2。
[0124]表2:本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC N0.8246對(duì)銅中毒導(dǎo)致血清中AST、ALT含量升高
的的緩解作用
[0125]
【權(quán)利要求】
1.一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),于2013年9月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.8246，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
2.權(quán)利要求1所述植物乳桿菌CGMCCN0.8246在制備緩解銅毒性的藥物組合物與發(fā)酵食品中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述藥物組合物是由植物乳桿菌CGMCCN0.8246菌劑及其它在藥學(xué)上可接受的載體及輔料組成。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述植物乳桿菌CGMCCN0.8246中活性植物乳桿菌 CGMCC N0.8246 大于 106CFU/g。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述植物乳桿菌CGMCCN0.8246菌劑的制備方法是將含有所述植物乳桿菌CGMCC N0.8246的菌液通過(guò)常規(guī)冷凍干燥工藝制備或其它工藝制備所得到的粉劑，它含有106CFU/g以上的活性植物乳桿菌CGMCC N0.8246。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的方法,其特征在于在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自在藥學(xué)上通常使用的填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的方法，其特征在于所述的藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液劑型。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵食品是使用含有植物乳桿菌CGMCCN0.8246的發(fā)酵劑生產(chǎn)的乳制品、豆制品或果蔬制品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其`特征在于所述的發(fā)酵劑是通過(guò)下述制備步驟得到的: A、培養(yǎng)基的制備:使用以所述培養(yǎng)基總重量計(jì)87.7%的水將10%酶水解脫脂乳、0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨與0.3%酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其pH為6.8，這樣得到所述的培養(yǎng)基; B、保護(hù)劑的制備:使用水與保護(hù)劑原料混合制備得到含有100g/L脫脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸鈉的保護(hù)劑； C、植物乳桿菌CGMCCN0.8246菌種按照以所述培養(yǎng)基的重量計(jì)2_4%接種量接種到在溫度110-120°C下滅菌8-12min的所述培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C下培養(yǎng)18h，用pH7.2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述的保護(hù)劑重懸達(dá)到濃度101(lCFU/mL ;接著，讓該懸浮液在溫度37°C下預(yù)培養(yǎng)60min，再進(jìn)行冷凍干燥得到所述的發(fā)酵劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆醬；所述的果蔬制品是黃瓜、胡蘿卜、甜菜、芹菜或圓白菜制品O
【文檔編號(hào)】A23C19/032GK103756926SQ201310541333
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】陳衛(wèi), 翟齊嘯, 田豐偉, 王剛, 張秋香, 范大明, 劉小鳴, 趙建新, 張灝, 李肖肖 申請(qǐng)人:江南大學(xué)