一種采用巢式pcr檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的方法及其專(zhuān)用引物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種采用巢式PCR檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的方法及其專(zhuān)用引物，其中兩對(duì)引物為以SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2為上游引物，以SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4為下游引物；本發(fā)明還提供一種采用巢式PCR輔助檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的引物對(duì)組來(lái)檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的方法，其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性10s；95℃變性30s；55℃退火,1min；72℃延伸1min；40cycles。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種采用巢式PCR檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的方法及其專(zhuān)用引物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病原微生物的檢測(cè)方法及其專(zhuān)用引物，具體來(lái)說(shuō)就是一種采用巢式PCR檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的方法及其專(zhuān)用引物。

【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界現(xiàn)有結(jié)核病人2000萬(wàn)，每年新發(fā)生約800萬(wàn)例，全世界平均每15秒就有一人死于結(jié)核病，每天有5000人因此喪生，僅2006年，就有200萬(wàn)人死于該病，約1/3人群有潛伏性結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)感染。在發(fā)展中國(guó)家，由于耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)，人口劇增、移民增加、旅游業(yè)發(fā)展、酗酒與貧困、吸毒、合并獲得性免疫缺陷病毒(HIV)感染、以及治療性免疫抑制癥導(dǎo)致的傳染性結(jié)核病發(fā)病率逐年上升，從而使結(jié)核病控制趨勢(shì)更加嚴(yán)峻。結(jié)核是成年人最主要的傳染病殺手，也是HIV攜帶人群死亡的最主要感染原因。全球每年在結(jié)核方面的經(jīng)濟(jì)支出至少在120億美兀以上。
[0003]骨關(guān)節(jié)結(jié)核是最常見(jiàn)的繼發(fā)肺外結(jié)核，約占肺外結(jié)核發(fā)病率的10%，脊柱結(jié)核俗稱(chēng)脊柱癆、龜背痰，在骨結(jié)核中最為常見(jiàn)，發(fā)病率約為50%，而45%脊柱結(jié)核病人常常因?yàn)樽刁w逐漸破壞、塌陷，后凸畸形進(jìn)行性加重，最后導(dǎo)致脊髓或神經(jīng)根損害，嚴(yán)重者發(fā)生遲發(fā)性麻痹，甚至截癱。
[0004]因此對(duì)結(jié)核病的檢測(cè)變得尤為重要，目前對(duì)脊柱結(jié)核的臨床診斷主要依靠臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查。影像學(xué)檢查包括X片、CT和MRI等，特別是重建CT的應(yīng)用，可獲得椎體隱匿病變的立體印象；平片在脊柱結(jié)核的診斷是首選的，但是其敏感性不高，在許多脊柱結(jié)核患者，臨床癥狀很明顯時(shí)，X平片可無(wú)表現(xiàn)，而在平片中被發(fā)現(xiàn)時(shí)，椎體50%的骨礦已丟失，MRI作為較好的診斷技術(shù)之一，但做為普查及初篩時(shí)的檢查，因其價(jià)格高而不能廣泛使用。許多脊柱結(jié)核的臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)多在疾病的中晚期出現(xiàn)，有的甚至不典型，故其診斷的及時(shí)性有限。結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室檢查包括涂片，菌培養(yǎng)及免疫學(xué)檢查。結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)檢查，是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)，但由于MTB的生長(zhǎng)緩慢，脊柱結(jié)核患者排菌量少，致使作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的結(jié)核細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)存在著靈敏度低，操作復(fù)雜，需時(shí)較長(zhǎng)，影響因素多，不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)；另外，由于脊柱、脊髓的解剖特性，脊柱結(jié)核起病隱匿，對(duì)脊柱結(jié)核，病灶取材多為有創(chuàng)檢查，且椎體或深部膿腫的穿刺需要一定的技術(shù)要求，從而限制了其廣泛應(yīng)用；免疫學(xué)中的純化蛋白衍生物(pro)試驗(yàn)陽(yáng)性率低，特異性差。因此，一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的早期脊柱結(jié)核診斷方法顯得十分重要的意義。
[0005]自1985年美國(guó)PE Cetus公司的Kary Mullis建立聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechain react1n, PCR)技術(shù)以來(lái)，PCR技術(shù)因其靈敏、特異、快速，已被廣泛應(yīng)用于遺傳診斷、基因研究及病原體的檢測(cè)等各方面，極大推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。而PCR自1989年引入結(jié)核病的檢測(cè)以來(lái)，該技術(shù)對(duì)于難以培養(yǎng)、生長(zhǎng)緩慢的結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)研究有著獨(dú)特的意義，近年來(lái)，以PCR為基礎(chǔ)的新型基因診斷技術(shù)發(fā)展很快，目前，不少學(xué)者正在探索如將特異性強(qiáng)的DNA探針與敏感性高的PCR技術(shù)相結(jié)合，并已成功用于臨床標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)。PCR技術(shù)目前在檢測(cè)肺結(jié)核患者的痰液及其外周血中結(jié)核分枝菌DNA含量方面已較成熟，在脊柱結(jié)核患者膿液中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA含量方面也有很多研究，但用巢式PCR探討快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA及其含量的研究及臨床應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種采用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡(jiǎn)稱(chēng)巢式PCR)來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA的方法及其專(zhuān)用引物。
[0007]其中兩對(duì)引物為以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2為上游引物，以SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4為下游引物；所述引物對(duì)組的核苷酸序列分別為:
上游引物 A: TB (5，-GGCGGGACAACGCCAATTGCG-3,)
上游引物 B: TB (5，-ACGACCACATCAACC-3,)
下游引物 C:TB(5, -AGTTTGGTGTCATCAGCC-3,)
下游引物 D:TB(5, -CGAGCTAGGCGTCGGTGACAAAG-3,)。
[0008]上述引物的含量分別為:
上游引物 A: 290bp (SEQ ID N0.1)
上游引物 B: 856bp (SEQ ID N0.2)
下游引物 C: 505bp (SEQ ID N0.3)
下游引物 D: 670bp (SEQ ID N0.4)。
[0009]本發(fā)明還提供一種采用巢式PCR輔助檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的引物對(duì)組來(lái)檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的方法，其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性10s;95°C變性30s ；55°C 退火，Imin ；72°C 延伸 Imin ；40 cycles。
[0010]圖一為一張結(jié)核分枝桿菌DNA的電泳圖，從圖中可見(jiàn)DNA條帶清晰且均勻一致，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明提取成功，方法及操作可行；同時(shí)兩條帶明暗不一，表明它們DNA含量不同，符合本實(shí)驗(yàn)的要求。
[0011]采用本發(fā)明所述的采用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡(jiǎn)稱(chēng)巢式PCR)來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA的引物對(duì)以及利用該引物對(duì)來(lái)檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的方法，具有如下優(yōu)點(diǎn):
1、耗時(shí)短，相對(duì)與常規(guī)的方法需要幾周的時(shí)間，本發(fā)明僅需一天，或者幾個(gè)小時(shí)。
[0012]2、特異性強(qiáng)，由于采用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中引物的正確設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的IS6110，其特異性程度就更高。
[0013]3、靈敏度高;本發(fā)明的的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為結(jié)核分枝桿菌DNA電泳圖；圖2為25例脊柱結(jié)核患者圍的外周血標(biāo)本中的MTB-DNA擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)值圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明的目的是采用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡(jiǎn)稱(chēng)巢式PCR)來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA。其中結(jié)核桿菌的插入序列IS6110采用巢式PCR試劑盒，其采用的兩對(duì)引物為以SEQID N0.1 和 SEQ ID N0.2 為內(nèi)引物，以 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 為外引物。
[0016]擴(kuò)增體系采用10PL擴(kuò)增體系，包括引物ΤΒ294和ΤΒ294各0.25μL, ΤΒ505和ΤΒ670 各 1.5KL ;dNTP 2M-L ；5XBuffer20M-L ；Polymerase IM-L ；Template IML ;去離子水補(bǔ)齊到100μL。
[0017]采用的試劑:
1.結(jié)核分枝桿菌DNA提取試劑盒。
[0018]2.結(jié)核分支桿菌核酸擴(kuò)增(PCR)試劑盒。
[0019]3.結(jié)核分枝桿菌DNA引物序列:
上游引物 A: TB (5，-GGCGGGACAACGCCAATTGCG-3,) 290bp
上游引物 B: TB (5，-ACGACCACATCAACC-3,) 856bp
下游引物 C:TB(5, -AGTTTGGTGTCATCAGCC-3,) 505bp
下游引物 D:TB(5, -CGAGCTAGGCGTCGGTGACAAAG-3,) 670bp
4.瓊脂糖電泳試劑
(I)瓊脂糖(Agarose) (2)溴化乙啶(EB) (3) Tris (4) 二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)
(5)DNA Marker:上海生工生物工程有限公司
5.其他:由南華大學(xué)附一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所楊慧齡博士根據(jù)其《一種可消除非特異性條帶的PCR方法》發(fā)明專(zhuān)利(中國(guó)專(zhuān)利證書(shū)號(hào)ZL200410045031.5)免費(fèi)提供引物硫化修飾和高效保真酶。
[0020]具體方法與步驟:
(一)常用試劑配制:
(1)0.5mol/L EDTA(PH8.0): 18.61gEDTA加入去離子水90mL，劇烈攪拌，用NaOH(約9g)調(diào)節(jié)PH值至8.0，去離子水定容至10mL,高壓滅菌備用。
[0021](2)5XTris-硼酸(TBE)緩沖液:5.4gTris, 2.75g硼酸，加入0.5mol/L EDTA 2mL,去離子水定容至10mL,使用時(shí)稀釋10倍。
[0022]( 二 )標(biāo)本處理:
枸櫞酸鈉抗凝，_20°C保存 (三)檢測(cè)質(zhì)控設(shè)置:
(I)每次檢測(cè)均設(shè)置Mark帶以標(biāo)示產(chǎn)物的大小，根據(jù)人標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌特異引物大小判定結(jié)果為陰性或陽(yáng)性。
[0023](2)設(shè)定陰性及陽(yáng)性對(duì)照組。
[0024](四)具體操作:
嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明及無(wú)菌操作要求操作。
[0025]1.標(biāo)本的DNA提取:
(I)結(jié)核分枝桿菌DNA提取樣本的收集、儲(chǔ)存和準(zhǔn)備:靜脈抽血；枸櫞酸鈉抗凝，_20°C保存?zhèn)錂z;12000rpm離心15min,棄去上清；
(2)加入600M-LTBP Buffer 洗 2 遍，12000rpm 離心 5min,棄去上清；
(3)加入δΟΟμLΤΒΜ Buffer，3PLProteinase K，55O水浴 1.5-2h ；
(4)將上清液移至EZ-1OCOlum中，加入260μL無(wú)水乙醇，12000rpm離心3min,棄去collect1n tube 中液體；
(5)加入500M-lffash Solut1n 洗 2 遍，12000rpm 離心 Imin,棄去 collect1n tube 中液體(為盡可能去除Wash Solut1n,可空柱后離心Imin)；
(6)將EZ-1OCOlum放入另一干凈的1.5mL離心管內(nèi)，凈化工作臺(tái)通風(fēng)15min (去除殘留乙醇對(duì)DNA提取的影響)；
(7)EZ-1OCOlum 內(nèi)加入 45KLElut1n Buffer,室溫放置 5min, 12000rpm離心 lmin,棄去EZ-10C01um。
[0026]2.PCR擴(kuò)增體系:

【權(quán)利要求】
1.一種采用巢式PCR輔助檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的引物對(duì)組:包含由SEQ ID NO:1及SEQ ID N0:2組成的內(nèi)引物對(duì)，和由SEQ ID N0:3及SEQ ID NO:4組成的外引物對(duì)；所述引物對(duì)組的核苷酸序列分別為:
上游引物 A: TB (5，-GGCGGGACAACGCCAATTGCG-3’)
上游引物 B: TB (5，-ACGACCACATCAACC-3’)
下游引物 C: TB (5，-AGTTTGGTGTCATCAGCC-3.)
下游引物 D: TB (5，-CGAGCTAGGCGTCGGTGACAAAG-3’)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用巢式PCR輔助檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的引物對(duì)組，其特征在于“其采用的兩隊(duì)引物的含量分別為: 上游引物 A: 290bp (SEQ ID N0.1) 上游引物 B: 856bp (SEQ ID N0.2) 下游引物 C: 505bp (SEQ ID N0.3) 下游引物 D: 670bp (SEQ ID N0.4)。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用巢式PCR輔助檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的引物對(duì)組來(lái)檢測(cè)脊柱結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于:其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性 1s ；95°C 變 性 30s ；55°C 退火，Imin ；72°C 延伸 Imin ；40 cycles。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104131068SQ201310541387
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】王文軍, 左建宏, 宋西正 申請(qǐng)人:王文軍, 左建宏, 宋西正