一種低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的釀酒酵母工程菌，通過基因工程對釀酒酵母中調(diào)控因子Gln3p進(jìn)行改造，具體策略是對Gln3p核定位序列上的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變，突變?yōu)镚ln3p核定位序列上3個磷酸化位點(diǎn)，分別為第344、347和355位的絲氨酸。為了獲得更好的技術(shù)效果，可進(jìn)一步去除Gln3p與上游調(diào)控因子相結(jié)合的核定位調(diào)控區(qū)域，通過截短表達(dá)去除C末端調(diào)控序列的Gln3p，表達(dá)序列為1-653。在黃酒模擬體系檢測本發(fā)明提供的工程菌其EC產(chǎn)生量下降了62%。此外，發(fā)酵結(jié)束后檢測發(fā)酵液中其他成分的含量發(fā)現(xiàn)，主要成分含量均未發(fā)生顯著的變化，不會對菌株發(fā)酵特性及生長特性產(chǎn)生影響。
【專利說明】一種低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的酵母代謝工程菌及其構(gòu)建方法，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]我國傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)歷史悠久，影響深遠(yuǎn)。傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品復(fù)雜多樣，覆蓋面廣，如食醋，醬油，豆豉、腐乳、白酒、黃酒等已形成較大規(guī)模，滲透在人們飲食生活的方方面面。尤其是享有酒中瑰寶，液體蛋糕之稱的黃酒消費(fèi)市場日益擴(kuò)大，逐漸流行于世界各國，被國家列為重點(diǎn)扶植和發(fā)展的飲料酒之一。然而研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中含氮化合物的不完全代謝會產(chǎn)生氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,簡稱EC)等危害人們健康的胺(氨)類物質(zhì)，嚴(yán)重影響了我國的人民健康、出口貿(mào)易和國際形象。
[0003]EC是發(fā)酵食品中影響最為廣泛的一類有害胺(氨)類物質(zhì)。20世紀(jì)早期，人們發(fā)現(xiàn)EC可以在體外抑制細(xì)菌、植物組織，和鼠的癌細(xì)胞的生長，因此其在一段時間內(nèi)被用作抗腫瘤藥。但在隨后的研究中，EC被發(fā)現(xiàn)有潛在的致癌性。研究結(jié)果表明在EC刺激下，小鼠、大鼠、倉鼠、猴子等測試動物都會被誘發(fā)良性或惡性腫瘤。在2007年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)提出將EC列入2A級致癌物質(zhì)，與甲醛在同一級別。目前EC只可以用于科學(xué)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的釀酒酵母工程菌，通過基因工程對釀酒酵母中調(diào)控因子Gln3p進(jìn)行改造，具體策略是對Gln3p核定位序列上的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變。
[0005]所述突變?yōu)镚ln3p核定位序列上3個磷酸化位點(diǎn)，分別為第344、347和355位的
絲氨酸。
[0006]為了進(jìn)一步降低EC產(chǎn)量，在對Gln3p核定位序列上的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變的基礎(chǔ)上，去除Gln3p與上游調(diào)控因子相結(jié)合的核定位調(diào)控區(qū)域，通過截短表達(dá)去除C末端調(diào)控序列的Gln3p,表達(dá)序列為1-653。
[0007]獲得上述酵母工程菌的方法，其特征在于具體步驟如下:
[0008]I)從酵母基因組中克隆獲得長度1959bp的去除C末端調(diào)控序列的GLN3基因片段；連接到T載體構(gòu)建質(zhì)粒T-GLN3，并轉(zhuǎn)化至E.coli JM109菌株中；
[0009]2)使用突變試劑盒對步驟I中質(zhì)粒T-GLN3上的GLN3基因的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變，將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli JM109菌株中，保藏菌株；
[0010]3)對步驟2)改造后的T-GLN3質(zhì)粒，克隆到質(zhì)粒pYX212，構(gòu)建質(zhì)粒pYX212_GLN3 ；
[0011]4)將步驟3)獲得的pYX212-GLN3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至S.cerevisiae CEN PK2中，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，得到構(gòu)建好的基因工程菌株。
[0012]本發(fā)明提供的改造后釀酒酵母工程菌，尿素利用能力大幅提升。在黃酒模擬體系中，與野生菌株相比，工程菌發(fā)酵液中尿素和EC的含量分別下降了 70%和62%，實(shí)現(xiàn)了降低黃酒中EC形成的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]表1本發(fā)明中的所有弓丨物
[0014]表2基因工程菌與野生菌黃酒模擬體系中主要成分含量檢測結(jié)果
[0015]圖1擴(kuò)增GLN3和GLN3H基因的電泳檢測圖
[0016]圖2Gln3p核定位序列突變和核定位調(diào)控序列缺失對尿素代謝基因影響定量PCR檢測結(jié)果
[0017]圖3基因工程菌與野生菌尿素代謝基因定量PCR檢測結(jié)果
[0018]圖4基因工程菌與野生菌搖瓶發(fā)酵尿素利用情況檢測結(jié)果
[0019]圖5基因工程菌與野生菌黃酒模擬體系中EC含量檢測結(jié)果
[0020]具體實(shí)施方法
[0021]實(shí)施例1調(diào)控因子Gln3p核定位序列突變對菌株尿素代謝基因表達(dá)量的影響
[0022]構(gòu)建方法如下:
[0023]1)以GLN3-F和GLN3_R(詳見表1)引物從釀酒酵母的基因組中擴(kuò)增得到獲得長度2193bp的GLN3基因片段(圖1)。將PCR擴(kuò)增得到的GLN3基因經(jīng)膠回收純化后，與pMD19_TVector(Takara)連接,并轉(zhuǎn)化至E.coli JM109中。在氨節(jié)青霉素抗性平板上經(jīng)菌落PCR挑選轉(zhuǎn)化的陽性克隆T-GLN3，送至上海生工測序驗(yàn)證。將經(jīng)測序驗(yàn)證序列正確的菌株，甘油管-20°C保存；
[0024]2)將上一步保存的菌株經(jīng)活化后，提取T-GLN3質(zhì)粒。以T-GLN3質(zhì)粒為模板，表1中的突變引物為引物，按照寶生物公司的MutanBEST點(diǎn)突變試劑盒說明書操作，將Gln3p上的344位，347位和355位Ser位點(diǎn)均突變?yōu)楸彼?。將所得T-GLN3
S344A, S347A, S355A 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至
E.coli JM109中，并送至上海生工測序驗(yàn)證。將經(jīng)測序驗(yàn)證序列正確的菌株，甘油管_20°C保存；
[0025]3)提取構(gòu)建好的 T_GLN3S344A，S347A，S355A 和保存的 pYX212 質(zhì)粒，經(jīng) Nco I 及 Sac I 雙酶切后分別膠回收。將回收得到的GLN3S344A，S347A，S355A片段與線性化的PYX212質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化至E.coli JM109中。經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)后提取構(gòu)建好的PYX212-GLN3
1-653，S344A, S347A, S355A 質(zhì)粒
轉(zhuǎn)化至S.cerevisiae CEN PK2菌株。經(jīng)酵母菌落PCR篩選得到陽性克隆后，甘油管_20°C保存。
[0026]為了檢驗(yàn)Gln3p核定位序列突變的效果，用實(shí)時定量PCR的方法在轉(zhuǎn)錄水平檢測了釀酒酵母尿素代謝基因(DUR1，2和DUR3)表達(dá)量的變化情況。實(shí)驗(yàn)以野生菌株為對照，結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在谷氨酰胺存在的情況下，在表達(dá)了 pYX212-GLN3，
S344A, S347A,S355A
質(zhì)粒的菌株中，DURl, 2和DUR3的表達(dá)量分別提高了 2.4和1.8倍。說明對Gln3p核定位序列的突變可以提聞尿素代謝相關(guān)基因的表達(dá)量。
[0027]實(shí)施例2調(diào)控因子Gln3p核定位調(diào)控序列缺失對菌株尿素代謝的影響
[0028]構(gòu)建方法如下:
[0029]1)以GLN3-F’和GLN3-R’ (詳見表1)引物從釀酒酵母的基因組中擴(kuò)增得到獲得長度1959bp的GLra1.基因片段(圖1)。將PCR擴(kuò)增得到的GIi^V653基因經(jīng)膠回收純化后，與pMD19-TVector (Takara)連接，并轉(zhuǎn)化至E.coli JM109中。在氨節(jié)青霉素抗性平板上經(jīng)菌落PCR挑選轉(zhuǎn)化的陽性克隆T-GIi^V653,送至上海生工測序驗(yàn)證。將經(jīng)測序驗(yàn)證序列正確的菌株，甘油管_20°C保存；
[0030]2)提取構(gòu)建好的T-GIi^V653和保存的PYX212質(zhì)粒，經(jīng)Nco I及Sac I雙酶切后分別膠回收。將回收得到的GIi^V653片段與線性化的PYX212質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化至E.coliJM109中。經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)后提取構(gòu)建好的PYX212-GLN3H質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至S.cerevisiae CENPK2菌株。經(jīng)酵母菌落PCR篩選得到陽性克隆后，甘油管_20°C保存。 [0031]為了檢驗(yàn)Gln3p核定位調(diào)控序列缺失的效果，用實(shí)時定量PCR的方法在轉(zhuǎn)錄水平檢測了釀酒酵母尿素代謝基因(DUR1，2和DUR3)表達(dá)量的變化情況。實(shí)驗(yàn)以野生菌株為對照，結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在谷氨酰胺存在的情況下，在表達(dá)了 PYXZ^-GLNSh653質(zhì)粒的菌株中，DURl, 2和DUR3的表達(dá)量分別提高了 3.3和2.6倍。說明Gln3p核定位調(diào)控序列的缺失也可以提高尿素代謝相關(guān)基因的表達(dá)量，而且效果比對Gln3p核定位序列進(jìn)行突變還要好。
[0032]實(shí)施例3更優(yōu)低產(chǎn)EC酵母工程菌的構(gòu)建
[0033]在對Gln3p核定位序列進(jìn)行突變和核定位調(diào)控序列進(jìn)行均取得正向結(jié)果的基礎(chǔ)上，將兩種方法結(jié)合構(gòu)建更優(yōu)低產(chǎn)EC的酵母工程菌。構(gòu)建方法如下:
[0034]以實(shí)施例2中構(gòu)建的T-GIi^V653質(zhì)粒為模板，表1中的突變引物為引物，按照寶生物公司的MutanBEST點(diǎn)突變試劑盒說明書操作，將Gln3Pl_653上的344位，347位和355位Ser位點(diǎn)均突變?yōu)楸彼帷⑺肨-GLNSls344aJ347aJ355a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli JM109中，并送至上海生工測序驗(yàn)證。將經(jīng)測序驗(yàn)證序列正確的菌株，甘油管_20°C保存。
[0035]為了檢驗(yàn)Gln3p核定位調(diào)控序列缺失的效果，用實(shí)時定量PCR的方法在轉(zhuǎn)錄水平檢測了釀酒酵母尿素代謝基因(DUR1，2和DUR3)表達(dá)量的變化情況。實(shí)驗(yàn)以野生菌株為對照，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在谷氨酰胺存在的情況下，在表達(dá)了 PYX212-GLN3H&S344A,S347A,S355A質(zhì)粒的菌株中，DURl, 2和DUR3的表達(dá)量分別提高了 4.3和3.2倍。尿素代謝相關(guān)基因表達(dá)量的大幅提高，說明對Gln3p的改造的確可以解除NCR效應(yīng)對尿素代謝基因表達(dá)的抑制，證實(shí)了這種針對調(diào)控因子特異性改造的方法是可行的。
[0036]實(shí)施例4基因工程菌與野生菌株搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0037]在48小時的搖瓶發(fā)酵中，進(jìn)一步檢測基因工程菌對尿素的利用情況，結(jié)果如圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過改造的基因工程菌與野生菌株相比，尿素利用率大幅提高。表達(dá)了 Pyxzu-GII^V6As344aJ34As355a質(zhì)粒菌株的尿素積累量下降了 54.5%。說明通過對Gln3p的改造，在DUR1，2和DUR3的表達(dá)量提高之后，菌株對尿素的利用率也得到了提高。酵母胞內(nèi)的尿素被快速的降解，因此無法積累。對基因工程菌及野生菌做生物量檢測，兩者之間差異不顯著。
[0038]實(shí)施例5基因工程菌與野生菌株在黃酒模擬體系中的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0039]因?yàn)楸緦＠饕哪康氖抢么x工程改造的方法降低黃酒中EC的含量，因此在定量PCR和搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，很有必要利用改造得到的基因工程菌株在黃酒模擬體系中實(shí)際發(fā)酵檢測EC的產(chǎn)生量，以檢測基因工程菌株能否應(yīng)用于工業(yè)化的生產(chǎn)中。在標(biāo)準(zhǔn)的黃酒模擬體系中進(jìn)行了 25天的搖瓶發(fā)酵，每隔5天取樣一次分別檢測不同樣品中的EC含量，實(shí)驗(yàn)仍以未經(jīng)改造的野生菌株為對照，結(jié)果如圖5所示。黃酒模擬體系檢測的結(jié)果與之前實(shí)驗(yàn)的結(jié)果較為吻合。基因工程菌株在黃酒模擬體系的發(fā)酵過程中EC產(chǎn)生量與未改造的野生菌株相比有了下降了 62%。此外，發(fā)酵結(jié)束后檢測發(fā)酵液中其他成分的含量發(fā)現(xiàn)，主要成分含量均未發(fā)生顯著的變化(表2)。表明改造后的菌株不僅可以使發(fā)酵液中EC的含量大幅下降，而且不會對菌株的發(fā)酵特性造成影響。這些結(jié)果說明了通過代謝工程改造Gln3p的方法獲得的菌株有應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的潛力。
[0040]表1
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種低產(chǎn)氨基甲酸乙酯的釀酒酵母工程菌，其特征在于通過基因工程對釀酒酵母中調(diào)控因子Gln3p進(jìn)行改造，具體策略是對Gln3p核定位序列上的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變。
2.如權(quán)利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于所述突變?yōu)镚ln3p核定位序列上3個磷酸化位點(diǎn)，分別為第344、347和355位的絲氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于進(jìn)一步去除Gln3p與上游調(diào)控因子相結(jié)合的核定位調(diào)控區(qū)域，通過截短表達(dá)去除C末端調(diào)控序列的Gln3p，表達(dá)序列為1-653。
4.獲得權(quán)利要求3所述釀酒酵母工程菌的方法，其特征在于具體步驟如下: 1)從酵母基因組中克隆獲得長度1959bp的去除C末端調(diào)控序列的GLN3基因片段；連接到T載體構(gòu)建質(zhì)粒T-GLN3，并轉(zhuǎn)化至E.coli JM109菌株中； 2)使用突變試劑盒對步驟I中質(zhì)粒T-GLN3上的GLN3基因的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變，將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli JM109菌株中，保藏菌株； 3)對步驟2)改造后的T-GLN3質(zhì)粒，克隆到質(zhì)粒pYX212，構(gòu)建質(zhì)粒pYX212_GLN3； 4)將步驟3)獲得的pYX212-GLN3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至S.cerevisiae CEN PK2中，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，得到構(gòu)建好的基因工程菌株。`
【文檔編號】C12N1/19GK103571765SQ201310541464
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 周景文, 趙鑫銳, 堵國成 申請人:江南大學(xué)