一種產(chǎn)5-酮基米爾貝霉素的鏈霉菌及生產(chǎn)5-酮基米爾貝霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因重組【技術(shù)領(lǐng)域】,尤其涉及一種產(chǎn)5-酮基米爾貝霉素的鏈霉菌及生產(chǎn)5-酮基米爾貝霉素的方法。本發(fā)明提供了一種用于敲除鏈霉菌milF基因的重組載體,包括milF基因同源片段,該片段的序列為在如SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列中第158~924位核苷酸間缺失105~767個(gè)核苷酸。并提供了該重組載體的構(gòu)建方法,以及采用該重組載體敲除鏈霉菌中milF基因的方法,及milF基因被敲除的鏈霉菌。該鏈霉菌可以直接發(fā)酵產(chǎn)生5-酮基米爾貝霉素,簡(jiǎn)化了米爾貝肟的合成工藝,并避免了傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法帶來(lái)的污染。
【專利說(shuō)明】—種產(chǎn)5-酮基米爾貝霉素的鏈霉菌及生產(chǎn)5-酮基米爾貝霉素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因重組【技術(shù)領(lǐng)域】,尤其涉及一種產(chǎn)5-酮基米爾貝霉素的鏈霉菌及生產(chǎn)5-酮基米爾貝霉素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]米爾貝霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類驅(qū)蟲(chóng)藥物,日本三共株式會(huì)社于1967年發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)多年的改良于1986年正式以商品名米爾貝廂(milbemycin oxime)上市。米爾貝廂是米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4的肟衍生物,米爾貝肟對(duì)控制和預(yù)防大部分常見(jiàn)寄生蟲(chóng)疾病都有很好的效果。通常用來(lái)預(yù)防惡絲蟲(chóng)病,控制線蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)引發(fā)的犬、貓疾病及犬的鞭蟲(chóng)病。由于米爾貝肟殺蟲(chóng)活性高、毒性小,LD5tl是臨床推薦用量的2000倍以上,同時(shí)對(duì)阿維菌素類藥物敏感的犬毒性較小,所以具有很好的市場(chǎng)前景。
[0003]目前,米爾貝肟是通過(guò)半合成的方法生產(chǎn)。首先,產(chǎn)米爾貝霉素的鏈霉菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵,從發(fā)酵產(chǎn)物中提取得到米爾貝霉素A3和A4。然后米爾貝霉素A3或A4的C-5羥基被氧化成酮。這種5-酮基米爾貝霉素與鹽酸羥胺在二噁烷-甲醇-水中發(fā)生反應(yīng),得到米爾貝月虧。
[0004]其中,米貝爾霉素A3具有式I所示結(jié)構(gòu),米貝爾霉素A4具有式II所示結(jié)構(gòu),5-酮基米爾貝霉素A3的結(jié)構(gòu)如式III所示,5-酮基米爾貝霉素A4的結(jié)構(gòu)如式IV所示。
[0005]`
【權(quán)利要求】
1.用于敲除產(chǎn)米爾貝霉素A3和/或米爾貝霉素A4的原始鏈霉菌milF基因的基因敲除質(zhì)粒,其特征在于,其包含milF基因同源片段,該片段與SEQ ID NO:2相比,缺失了 SEQID N0:2所示核苷酸序列中第158~924位核苷酸間的105~767個(gè)核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因敲除質(zhì)粒,其特征在于,包含抗性標(biāo)記基因,還包含順序連接的以下核苷酸片段:上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段; 其中,所述上游核苷酸片段為如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第η~2467個(gè)核苷酸,I≤η≤2178,η為整數(shù); 所述milF基因同源片段為在如SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列中第158~924位核苷酸間缺失105~767個(gè)核苷酸的序列; 所述下游核苷酸片段為如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第I~m個(gè)核苷酸,997≤m≤3108,m為整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因敲除質(zhì)粒,其特征在于,所述milF基因同源片段的序列如 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO:9 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因敲除質(zhì)粒,其特征在于,所述上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段共同形成SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16所示核苷酸片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因敲除質(zhì)粒,其特征在于,所述抗性標(biāo)記基因?yàn)閴延^霉素抗性基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因敲除質(zhì)粒,其特征在于,所述基因敲除質(zhì)粒的骨架為:pMD19 (Simple)、pBlueScript SK(+)或 pSTV28。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因敲除質(zhì)粒,其特征在于,所述基因敲除質(zhì)粒的序列如SEQID NO:37、SEQ ID NO:38 或 SEQ ID NO:39 所示。
8.如權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述的基因敲除質(zhì)粒的制備方法,其特征在于,包括以下步驟: 步驟1:將抗性標(biāo)記基因連接入骨架質(zhì)粒,獲得第一載體; 步驟2:以鏈霉菌總DNA為模板,擴(kuò)增第一核苷酸片段,將所述第一核苷酸片段連接入所述第一載體,獲得第二載體; 步驟3:取所述第二載體,用限制性內(nèi)切酶切除所述第一核苷酸片段中milF基因第158~924位核苷酸間的105~767個(gè)核苷酸,制得所述基因敲除質(zhì)粒; 其中,所述第一核苷酸片段為順序連接的上游核苷酸片段、milF基因、下游核苷酸片段; 所述上游核苷酸片段為如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第η~2467個(gè)核苷酸,I≤η≤2178,η為整數(shù); 所述milF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示; 所述下游核苷酸片段為如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第I~m個(gè)核苷酸,997≤m≤3108,m為整數(shù)。
9.如權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述的基因敲除質(zhì)粒的制備方法,其特征在于,包括以下步驟: 步驟1:以鏈霉菌總DNA為模板,擴(kuò)增第二核苷酸片段,所述第二核苷酸片段連接入骨架質(zhì)粒,獲得第三載體; 步驟2:以鏈霉菌總DNA為模板,擴(kuò)增第三核苷酸片段,所述第三核苷酸片段連接入第三載體,獲得第四載體; 步驟3:將抗性標(biāo)記基因連接入第四載體,得基因敲除質(zhì)粒; 其中,所述第二核苷酸片段為順序連接的上游核苷酸片段和milF基因5’端片段; 所述第三核苷酸片段為順序連接的milF基因3’端片段和下游核苷酸片段; 所述上游核苷酸片段為如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第η~2467個(gè)核苷酸,.1≤η≤2178,η為整數(shù); 所述下游核苷酸片段為如SEQ ID Ν0:3所示核苷酸序列中的第I~m個(gè)核苷酸,.997≤m≤3108,m為整數(shù); 所述milF基因5’端片段的核苷酸序列為如SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列中的第I~χ個(gè)核苷酸,157 ≤ χ≤ 761,χ為整數(shù); 所述milF基因3’端片段的核苷酸序列為如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中的第y~.936個(gè)核苷酸,866 ≤ y ≤ 925,y為整數(shù);
.105 ≤y-x ≤767。
10.產(chǎn)5-酮基米爾貝霉素的重組鏈霉菌,其特征在于,其通過(guò)同源雙交換,將產(chǎn)米爾貝霉素A3或米爾貝霉素A4的原始鏈霉菌的milF基因敲除而制得。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組鏈霉菌,其特征在于,所述原始鏈霉菌為鏈霉菌(Streptomyces milbemycinicus)或冰城鏈霉菌(Streptomyces bingchengsis),優(yōu)選鏈霉菌(Streptomyces milbemycinicus) HS023CGMCC N0.7677、鏈霉菌(Streptomycesmilbemycinicus sp.nov) NRRL N0.5739 或冰城鏈霉菌(streptomyces bingchengsissp.nov)CGMCC N0.1734。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組鏈霉菌,其特征在于,所述敲除除掉的是:SEQIDN0:2所示核苷酸序列中第158~924位核苷酸間的105~767個(gè)核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求10、11或12所述的重組鏈霉菌,其特征在于,其制備方法包括以下步驟: 步驟1:取權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述的基因敲除質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌,獲得轉(zhuǎn)化子;步驟2:以原始鏈霉菌孢子或菌絲體為受體,與所述轉(zhuǎn)化子進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移,篩選出milF基因被敲除的菌株,即得產(chǎn)5-酮基米爾貝霉素的重組鏈霉菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的重組鏈霉菌,其特征在于,所述大腸桿菌為ET12567(pUZ8002)。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103789339SQ201310541829
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】黃雋, 徐賽珍, 周敏 申請(qǐng)人:浙江海正藥業(yè)股份有限公司