一種氣味沙雷氏菌及其生產(chǎn)組胺的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種保藏號(hào)為CGMCCNo.7781的氣味沙雷氏菌及其生產(chǎn)組胺的方法，將菌株活化后于培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)，再用離心機(jī)分離，所得上清液即為組胺液。本發(fā)明菌株產(chǎn)組胺能力強(qiáng)，所得組胺液濃度高，可以極大降低生產(chǎn)成本和節(jié)約能源。
【專利說(shuō)明】一種氣味沙雷氏菌及其生產(chǎn)組胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是一種氣味沙雷氏菌及其生產(chǎn)組胺的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組胺是一種活性胺化合物，化學(xué)式是仏H9M3，分子量是111.15。中文同名詞為IH-咪唑-4-乙胺、2-咪唑基乙胺、組織胺、B-氨基乙基咪唑、B-氨乙基甘噁啉、組氨、麥角胺，是合成藥物的重要中間體，也可以作為生化試劑，目前，我國(guó)組胺需求量大，多數(shù)從國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格昂貴。
[0003]傳統(tǒng)的組胺生產(chǎn)是采用人工合成，這種方法生產(chǎn)的組胺純度低，生產(chǎn)效率低，并且難以提純。通過(guò)微生物代謝產(chǎn)生組胺，獲得高濃度組胺液，然后提取組胺，確實(shí)能降低組胺的生產(chǎn)成本和能源消耗，也成為研究的主要方向。
[0004]氣味沙雷氏菌odor if era )是沙雷氏菌屬{SerratiaBizio) 一種。菌體直桿狀，直徑0.5~0.8 μ m,長(zhǎng)0.9~2.0 μπι,端圓。符合腸桿菌科的一般描述。通常周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。兼性厭氧。菌落大多數(shù)不透明，有些虹彩；白色、粉紅或紅色。在自然界分布很廣，是水和土壤中的常居菌群，是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌。可引起多種感染，如尿路感染、創(chuàng)傷感染、肺炎、膿胸、肺膿腫、腹膜炎、心內(nèi)膜炎及敗血癥等。
[0005]氣味沙雷氏菌與少數(shù)肺部感染及尿路感染有關(guān)。但已被證實(shí)的氣味沙雷氏菌中，未見(jiàn)高產(chǎn)組胺報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)目前人工合成`組胺純度低的問(wèn)題，提供一種氣味沙雷氏菌并通過(guò)該菌代謝產(chǎn)生高濃度組胺液。
[0007]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種氣味沙雷氏菌(ferraiia ot/ori/era),其特征在于:保藏號(hào)為 CGMCC N0.7781。
[0008]—種利用所述氣味沙雷氏菌生產(chǎn)組胺的方法，其特征在于:
1)將菌落接種于裝有A培養(yǎng)基的試管中活化，接種量為105cfu/ml，37°C靜置培養(yǎng)24小時(shí)，重復(fù)上述步驟五次；
2)將步驟I)的菌液接種到B培養(yǎng)基中，接種量為106cfu/ml，37°C靜止培養(yǎng)4天；
3)將步驟2)培養(yǎng)的菌液放入離心機(jī)中，10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液，即為組胺
液；
所述的A培養(yǎng)基為:改良MSA液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量比為0.1%組氨酸；
所述的B培養(yǎng)基為:改良MSA液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量比為0.005%的磷酸吡哆醛和質(zhì)量比為0.1%的組氨酸；
所述改良MSA液體培養(yǎng)基為:蛋白胨10g，牛肉膏l(xiāng)g，D-甘露醇10g，NaCl 40g，酚紅0.025g，蒸餾水 1000mL，pH 值 7.2~7.6，115°C滅菌 15 分鐘。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，由于保藏號(hào)為CGMCC N0.7781的氣味沙雷氏菌odoridera )產(chǎn)組胺能力強(qiáng),所得組胺液濃度高,可以極大降低生產(chǎn)成本和節(jié)約能源。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為氣味沙雷氏菌電子顯微鏡照片。
[0011]圖2為高效液相色譜檢測(cè)組胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0012]圖3檢測(cè)氣味沙雷氏菌產(chǎn)組胺高效液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
實(shí)施例1氣味沙雷氏菌ot/ori/era.的篩選和保藏
培養(yǎng)基配方 :
改良MSA液體培養(yǎng)基:蛋白胨10g，牛肉膏l(xiāng)g，D-甘露醇10g，NaCl 40g，酚紅0.025g，蒸餾水lOOOmL，pH值7.2~?.6，115°C滅菌15分鐘。
[0014]下層培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g，牛肉膏l(xiāng)g，D-甘露醇10g，NaCl 40g，磷酸吡哆醛
0.05g,組氨酸5g,瓊脂18g, 1000ml蒸懼水，pH值5.5,115°C高壓滅菌15分鐘。
[0015]上層培養(yǎng)基:溴甲酚紫0.06g，瓊脂15g，1000ml蒸餾水，pH值5.5，121°C滅菌10分鐘。
[0016]改良MSA固體培養(yǎng)基:在改良MSA液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量比為1.8%的瓊脂。
[0017]篩選方法:
在無(wú)菌條件下取20g新疆熏馬腸，剪碎后置于裝有180ml已滅菌生理鹽水的三角瓶中，室溫下230轉(zhuǎn)搖床搖10分鐘，取Iml接種于改良MSA液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，取Iml培養(yǎng)液用9ml生理鹽水逐級(jí)稀釋到10-100 cfu/ml，涂布于下層培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)72小時(shí)。緩慢傾入一薄層上層培養(yǎng)基，10分鐘開(kāi)始記錄結(jié)果，顯紫色的菌落為陽(yáng)性，顯黃色為陰性，其中，陽(yáng)性為產(chǎn)生組胺菌株，陰性為不產(chǎn)胺菌株。
[0018]挑取陽(yáng)性菌株，在改良MSA固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24小時(shí)，可以看到，菌落在改良的MSA液體培養(yǎng)基中富集，菌落呈白色，菌體直桿狀，分散生長(zhǎng)，或成簇生長(zhǎng)，革蘭氏陰性在普通顯微鏡下菌體呈短桿形的菌株。挑取單菌落在改良MSA固體培養(yǎng)基上劃線純化，重復(fù)純化至少三次，后接種于改良MSA液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)24小時(shí)至活菌量達(dá)到105cfu/ml，8000rmp下離心IOmin后獲得菌株，加入無(wú)菌甘油，-80°C冰箱保存。
[0019]將菌株送華大基因測(cè)序?yàn)镾EQ ID 1。
[0020]登陸NCBI (http//:www.ncb1.nlm.nih.gov),將所得序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)。得到:比對(duì)源為 Serratia odorifera strain FB504 16S ribosomal RNAgene, partial sequence, Max ident:99%, Max score:723, Accession: TX943856.1, Ien:434。
[0021]將該菌株命名為氣味沙雷氏菌Sorreitiei odor if era,于2013年6月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center, CGMCC)，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，菌種保藏號(hào)為CGMCC N0.7781，該菌保藏時(shí)， 申請(qǐng)人:自定義為001號(hào)菌株。其16S rDNA的Genbank登陸號(hào)為KC887968。[0022]實(shí)施例2制備組胺
改良的MSA液體培養(yǎng)基為:蛋白胨10g，牛肉膏l(xiāng)g，D-甘露醇10g，NaC140g，酚紅
0.025g，蒸餾水 1000mL, pH 值 7.2~7.6，115°C滅菌 15 分鐘。
[0023]A培養(yǎng)基為:改良MSA液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量比為0.1%組氨酸。
[0024]B培養(yǎng)基為:改良MSA液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量比為0.005%的磷酸吡哆醛和質(zhì)量比為0.1%的組氨酸。
[0025]取001號(hào)菌株接種于裝有A培養(yǎng)基的試管中，接種量為105cfu/ml，37°C靜置培養(yǎng)24小時(shí)；重復(fù)上述步驟五次后；將最后活化后的菌液接種到B培養(yǎng)基中37°C靜止培養(yǎng)4天，接種量為106cfu/ml ;將培養(yǎng)后的菌液10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液。
[0026]實(shí)施例3組胺含量測(cè)定
1、組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取組胺50 mg,用0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50mL,制成I mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。分別取以上標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用0.4 mol/L HClO4配制成終濃度分別為5.0、10、20、30、40、50 μ g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光4 V冰箱保存。
[0027]2、樣品溶液的衍生化
取實(shí)施例2的上清液ImL加入ImL 0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)混均后，取ImL于5ml容量瓶中，加入200μΙ^^2πιΟ1/1 NaOH，然后加入300 μ L的飽和碳酸氫鈉溶液，再加入2 ml的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(濃`度為10mg/mL，溶劑為丙酮)，然后放置于40°C水浴黑暗中反應(yīng)處理40分鐘。反應(yīng)結(jié)束后加入100 μ L的氨水中止反應(yīng)，去除殘留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5 mL，再后用0.22 μ m的有機(jī)濾膜過(guò)濾，獲得樣品溶液的衍生物。
[0028]3、標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)樣的衍生化
分別取5.0、10、20、30、40、50μ g/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品ImL于5ml容量瓶中，加入200 μ L的2mol/L NaOH,然后加入300 μ L的飽和碳酸氫鈉溶液，再加入2 ml的丹磺酰氯(dansylchloride)溶液(濃度為10mg/mL，溶劑為丙酮)，然后放置于40°C水浴黑暗中反應(yīng)處理40分鐘。反應(yīng)結(jié)束后加入100 μ L的氨水中止反應(yīng)，去除殘留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。再用0.22 μ m的有機(jī)濾膜過(guò)濾后，獲得六組樣品溶液的衍生物。
[0029]4、色譜檢測(cè)
液相色譜系統(tǒng):SHIMADZU LC-2010A HT ；
色譜柱為 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6X 250mm,.5 μ m);
流速為I mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm,突光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)(Ex) 340nm,發(fā)射波長(zhǎng)(Em) 515nm,進(jìn)樣量20 μ L，柱溫30°C，流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈，采用梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。
[0030]表1梯度洗脫程序
【權(quán)利要求】
1.一種氣味沙雷氏菌iSerratia odor if era),其特征在于:保藏號(hào)為CGMCC N0.7781。
2.一種利用權(quán)利要求1所述氣味沙雷氏菌生產(chǎn)組胺的方法，其特征在于: 1)將菌落接種于裝有A培養(yǎng)基的試管活化，接種量為105cfu/ml，37°C靜置培養(yǎng)24小時(shí)，重復(fù)上述步驟五次； 2)將步驟I)的菌液接種到B培養(yǎng)基中，接種量為106cfu/ml，37°C靜止培養(yǎng)4天； 3)將步驟2)培養(yǎng)的菌液放入離心機(jī)中，10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液，即為組胺液； 所述的A培養(yǎng)基為:改良MSA液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量比為0.1%組氨酸； 所述的B培養(yǎng)基為:改良MSA液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量比為0.005%的磷酸吡哆醛和質(zhì)量比為0.1%的組氨酸； 所述改良MSA液體培養(yǎng)基為:蛋白胨10g，牛肉膏l(xiāng)g，D-甘露醇10g，NaCl 40g，酚紅`0.025g,蒸餾水 1000mL, p`H 值 7.2~7.6，115°C滅菌 15 分鐘。
【文檔編號(hào)】C12P17/10GK103555631SQ201310543215
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】盧士玲, 李蕊婷, 李開(kāi)雄, 許程劍, 李寶坤 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)