用于檢測革蘭陰性桿菌常見碳青霉烯酶基因的lamp引物、試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測革蘭陰性桿菌常見碳青霉烯酶基因的LAMP引物、試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明LAMP引物中，KPC和NDM引物組可檢測到除NDM-10以外的所有亞型，IMP和VIM引物組可檢測到國內(nèi)外常見亞型。本發(fā)明建立的LAMP試劑盒用于聯(lián)合檢測KPC、NDM、IMP和VIM基因，可涵蓋非發(fā)酵菌和腸桿菌科細菌常見的碳青霉烯酶基因，可準確快速的進行常見碳青霉烯酶基因的篩查，對于及時發(fā)現(xiàn)并進一步控制碳青霉烯酶基因在腸桿菌科細菌中傳播導(dǎo)致的暴發(fā)流行具有重大的臨床意義。本發(fā)明試劑盒檢測靈敏度高，KPC、NDM、IMP和VIM基因的最低檢測極限均可達到100CFU/反應(yīng)。
【專利說明】用于檢測革蘭陰性桿菌常見碳青霉烯酶基因的LAMP引物、

試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于細菌耐藥基因檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及用于檢測KPC、NDM、IMP和VIM基因的LAMP引物、試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】[0002]碳青霉烯類抗生素是目前抗菌譜最廣，抗菌活性最強的非典型b_內(nèi)酰胺類抗菌藥物。由于其對b-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定和毒性低的特點，該類藥物已經(jīng)成為目前治療多種細菌感染的主要抗菌藥物之一。然而，隨著其臨床應(yīng)用日益廣泛，碳青霉烯類抗生素不可避免地出現(xiàn)細菌耐藥現(xiàn)象，這些菌株也大都表現(xiàn)為泛耐藥。近年來，耐碳青霉烯的非發(fā)酵菌甚至腸桿菌科細菌的報道都越來越多，對于這種耐藥菌株的快速檢測并預(yù)防其流行在臨床工作中極為重要。[0003]近幾年對于耐藥性的調(diào)查研究顯示，產(chǎn)碳青霉烯酶是細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。對于這類產(chǎn)酶菌株的監(jiān)測最快速有效的方法是檢測其耐藥基因。針對臨床常見且水解活性強的碳青霉烯酶進行分子生物學(xué)方法檢測其相關(guān)基因成為急需的實驗室技術(shù)。KPC (Klebsieila pneumoniae carbapenemase,KPC)是引起腸桿菌科細菌對碳青霉烯耐藥的主要原因，而NDM (New Delhi metallo-b_lactamase)是引起世界關(guān)注的新發(fā)現(xiàn)的強水解活性的碳青霉烯酶，IMP和VIM (Verona integron-encoded MBL)是臨床中常見的具有強水解碳青霉烯活性的金屬b-內(nèi)酰胺酶。上述四個基因可以涵蓋非發(fā)酵菌和腸桿菌科細菌常見碳青霉烯酶基因，進行快速檢測對于及時發(fā)現(xiàn)并進一步控制這類細菌的流行有很重要的臨床意義。[0004]目前用于檢測碳青霉烯酶基因的主要技術(shù)是PCR，如多重PCR，熒光定量PCR。但這些方法或操作不夠簡化快捷，或檢測成本高需要特殊儀器設(shè)備。而近幾年新興起的基因擴增方法，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP),主要是針對目的基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物及2條輔助成環(huán)引物，在恒溫條件下即可完成核酸擴增反應(yīng)，且可以達到成本低，操作簡便，檢測時間短，靈敏特異的檢測目的基因。這項技術(shù)自發(fā)現(xiàn)起已廣泛用于檢測細菌領(lǐng)域，并有相關(guān)專利獲得授權(quán)。雖國內(nèi)已有發(fā)明利用LAMP方法檢測NDM-U申請?zhí)?0111029784.4)，但由于NDM基因因存在位點的突變，有多個亞型，此發(fā)明不能滿足NDM基因所有型別的檢出。而且也沒有MP、VIM, KPC基因的檢測。因此，對于碳青霉烯酶基因的檢測是不夠全面的。本發(fā)明更是針對上述四個基因國內(nèi)臨床常見亞型的基因保守區(qū)設(shè)計特異的LAMP引物，以便能更敏感特異的檢出相應(yīng)的基因片段。在引物設(shè)計的基礎(chǔ)上，我們基于LAMP的方法建立了一種能對同一標本的KPC、NDM、IMP和VIM四種碳青霉烯酶基因進行檢測的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一組用于檢測細菌常見碳青霉烯酶基因(KPC、NDM、IMP和VM)的LAMP引物，并建立一種常見碳青霉烯酶基因的LAMP檢測試劑盒及其檢測方法，以靈敏特異、簡便快速的檢測細菌常見碳青霉烯酶基因。
[0006]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
用于檢測革蘭陰性桿菌常見碳青霉烯酶基因的LAMP引物，包括KPC引物組、NDM引物組、IMP引物組和VM引物組，其核苷酸序列分別如下所示:
1)KPC引物組:
外引物:
【權(quán)利要求】
1.用于檢測革蘭陰性桿菌常見碳青霉烯酶基因的LAMP引物，包括KPC引物組、NDM引物組、IMP引物組和VIM引物組，其核苷酸序列分別如下所示: 1)KPC引物組: 外引物:
KF3:GTATCGCCGTCTAGTTCTG (SEQ ID N0.1),
KB3:TGAATGAGCTGCACAGTG (SEQ ID N0.2)； 內(nèi)引物:
KFIP:AATGGTTCCGCGACGAGGCTGTCTTGTCTCTCATGGC (SEQ ID N0.3),
KBIP:GGACTTTGGCGGCTCCATGCGCGGTAACTTACAGTT (SEQ ID N0.4)； 環(huán)引物:
KLoopF:GGCAGAAAAGCCAGCCAG (SEQ ID N0.5),
KLoopB:CGATGGATACCGGCTCAG (SEQ ID N0.6)； 2)NDM引物組: 外引物:
NF3:AACACAGCCTGACTTTCG (SEQ ID N0.7)，
NB3:GCTCATCACGATCATGCT (SEQ ID N0.8)； 內(nèi)引物:
NFIP:ATGTCGGTGCCGTCGATCCCCGCTCAAGGTATTTTACC (SEQ ID N0.9)，
NBIP:GCTTTTGGTGGCTGCCTGATCACCGAGATTGCCGAG (SEQ ID N0.10)； 環(huán)引物:
NLoopF:GATATTGTCACTGGTGTGGC (SEQ ID N0.11)，
NLoopB:GGACAGCAAGGCCAAGTC (SEQ ID N0.12)； 3)MP引物組: 外引物:
IF3:GGGCGTTGTTCCTAAACA (SEQ ID N0.13)，
IB3:GCTTGAACCTTACCGTCTT (SEQ ID N0.14)； 內(nèi)引物:
IFIP:ACGTTCCACAAACCAAGTGACTGGTTGTTCTTGTAGATGCTGA (SEQ ID N0.15)，
IBIP:CAGCACGGGCGGAATAGAGGCTCATTAGTTAATTCAGACGC (SEQ ID N0.16)； 環(huán)引物:
ILoopF:TTAGCCGTAAATGGAGTGTCAA (SEQ ID N0.17)，
ILoopB:TGGCTTAATTCTCAATCCATCC (SEQ ID N0.18)； 4)VM引物組: 外引物:
VF3:CTTCGGTCCAGTAGAACTCT (SEQ ID N0.19),
VB3:GTGTGCTTGAGCAAGTCT (SEQ ID N0.20)； 內(nèi)引物:
VFIP:TCGCACAACCACCATAGAGCGCATTCGACCGACAACTT (SEQ ID N0.21)，
VBIP:GTTGTCACGCACGTCTGCGAATCCGCTCAATGGAGG (SEQ ID N0.22)；環(huán)引物:
2.用于檢測革蘭陰性桿菌常見碳青霉烯酶基因的LAMP試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括權(quán)利要求1所述的LAMP引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括以下組份:(1)權(quán)利要求1所述的LAMP引物；(2) 2X反應(yīng)緩沖液；(3) DNA Bst聚合酶；(4)熒光指示劑或顯色劑；(5)陽性對照；(6)陰性對照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于:2X反應(yīng)緩沖液包括:40mMTris-HCl(pH 8.8),20mM KCl, 16mM MgSO4, 20mM (NH4) 2S04,0.2v/v% Tween-20，0.8M 甜菜堿，2.8mMdNTPs。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于:陽性對照為分別為KPC、NDM、IMP和VIM基因陽性的四種DNA模板；陰性對照為滅菌雙蒸水。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于:熒光指示劑為Syto-9，顯色劑為SYBR-Green。
7.利用權(quán)利要求2~6任意一項所述的試劑盒檢測革蘭陰性桿菌常見碳青霉烯酶基因的方法，包括以下步驟: 1)提取待檢樣本DNA; 2)恒溫擴增反應(yīng):配制反應(yīng)體系:2X反應(yīng)緩沖液12.5iil、DNA Bst聚合酶8U、KPC或NDM或MP或VM引物組、熒光指示劑0.5 U 1、待檢樣本DNA模板I y 1、用滅菌雙蒸水補齊至25iU，同時設(shè)置陽性對照和陰性對照；最后加入20 Ul無菌石蠟油，混勻，離心，將反應(yīng)管置于突光定量PCR儀，63°C擴增反應(yīng)50分鐘,于每分鐘末進行突光收集； 3)結(jié)果判斷:呈S型擴增曲線，且起峰時間小于40分鐘，判定為陽性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:反應(yīng)體系中，KPC引物組或NDM引物組或IMP引物組或VM引物組的外引物各為5pmol、內(nèi)引物各為40pmol、環(huán)引物各為20pmol。
9.利用權(quán)利要求2~6任意一項所述的試劑盒檢測革蘭陰性桿菌常見碳青霉烯酶基因的方法，包括以下步驟: 1)提取待檢樣本DNA; 2)恒溫擴增反應(yīng):配制反應(yīng)體系:2X反應(yīng)緩沖液12.5iil、DNA Bst聚合酶8U、KPC引物組或NDM引物組或MP引物組或VM引物組、待檢樣本DNA模板I y 1、用滅菌雙蒸水補齊至25iU，同時設(shè)置陽性對照和陰性對照；加入20 Ul無菌石蠟油，混勻，離心，然后于反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè)加I U I顯色劑；將反應(yīng)管置于金屬浴中，63°C擴增反應(yīng)40分鐘； 3)結(jié)果判斷:反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液與顯色劑混勻，呈現(xiàn)綠色為陽性，呈現(xiàn)橙色為陰性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:反應(yīng)體系中，KPC引物組或NDM引物組或IMP引物組或VM引物組的外引物各為5pmol、內(nèi)引物各為40pmol、環(huán)引物各為20pmol。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614465SQ201310545991
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】芮勇宇, 程燦燦, 鄭芬, 孫靜靜 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)