一組控制水稻抽穗期的dth2基因單倍型和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一組控制水稻抽穗期的DTH2基因及其單倍型和應(yīng)用?；駾TH2單倍型4，其CDS序列如序列表SEQ?ID?NO.7所示。通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明了該基因具有使水稻抽穗期提前的功能。并證明該基因在馴化中被選擇，且起源于中國。
【專利說明】—組控制水稻抽穗期的DTH2基因單倍型和應(yīng)用
[0001]分案說明
[0002]本案為2012-03-05遞交的申請?zhí)枮?012100546596，名稱為“一組控制水稻抽穗期的DTH2基因及其單倍型和應(yīng)用”的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一組控制水稻抽穗期的DTH2基因單倍型和應(yīng)用。技術(shù)背景
[0004]抽穗期是一個重要的農(nóng)藝性狀，并且可能在作物的馴化過程中被選擇(Izawa T.Journal of Experimental Botany58:3091 - 3097 (2007))。 栽培稻目前分布在世界范圍內(nèi)的從北緯53 °到南緯40 °之間的廣大地區(qū)(ChangT.T.Euphytica25, 425 - 441 (1976))。然而，亞洲栽培稻的祖先普通野生稻，主要分布在南亞，東南亞和澳大利亞北部，其分布的最北限位于北緯28°的東鄉(xiāng)野生稻。水稻馴化的一個重要目的是產(chǎn)生適應(yīng)各地區(qū)種植的水稻品種，從而擴(kuò)大栽培面積。影響栽培稻向北擴(kuò)張的主要限制因素就是抽穗期。在高緯度地區(qū)(例如亞洲東北部)，早抽穗和對光周期不敏感的特性，保證了水稻能在寒冷天氣來臨之前種子發(fā)育成熟。因此，為滿足日益增長的人口對糧食的需求，尋找能擴(kuò)大栽培稻種植面積的關(guān)鍵基因，并克隆相應(yīng)基因，闡明其遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)理，對培育廣適性水稻品種具有重要的理論和實(shí)踐意義。
[0005]水稻品種的抽穗期主要由其感光性、感溫性和基本營養(yǎng)生長性決定(Chang TT, Li C C, Vergara B S.(1969)Euphytica, 18:79 ~91;Tsai K H.(1985)Rice GenetNewslett, 2:77~78; Tsai K H.(1986)In:Rice Genetics.1nternational Rice ResearchInstitute, 339~349)。水稻品種感光性、感溫性和基本營養(yǎng)生長性組合的多樣性，使得抽穗期的遺傳表現(xiàn)異常復(fù)雜，經(jīng)典遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)都證明抽穗期是由少數(shù)質(zhì)量性狀基因和多個數(shù)量性狀基因(QTL Quantitative Trait Locus)控制的。到目前為止，已經(jīng)有20個水稻抽穗期基因被克隆，其中有6個是通過精細(xì)定位圖位克隆的途徑克隆的。如Hdl，冊6，冊3&』11(11，611(17和01'!18 (Yano,M.et al.(2000) Plant Cel112, 2473 - 2483; Takahashi, Y., Shomura, A., Sasaki, T.&Yano, Μ.(2001)Proc Natl Acad Sci USA98, 7922 - 7927;Kojima, S,, Takahashi, Y.&Kobayashi, Y.(2002)Plant Cell Physiol43, 1096 - 1105;Doi, K.et al.(2004) Genes.Dev.18, 926-936 ; Xue, ff.Y.et al.(2007) Nat.Genet.40, 761 -767; Wei, X.J.et al.(2010)Plant.Physiol.153，1747 - 1758)。對于抽穗期基因來說，由于各地光周期的差異，不同地區(qū)的人可能會選擇不同類型的光敏感材料以適應(yīng)當(dāng)?shù)氐墓庹諚l件。研究發(fā)現(xiàn)Hdl和Ghd7的等位基因的自然變異和水稻的分布區(qū)有關(guān)，但Hdl和Ghd7的等位變異對于品種抽穗期的改變過于劇烈，對其它基因也有很強(qiáng)的上位作用，因此，在品種抽穗期的改良上很難應(yīng)用。而微效基因的改變較易適應(yīng)環(huán)境的緩慢變化，更具有適應(yīng)性，在育種上有重要意義。另外判斷一個基因是否是馴化基因，主要看該基因在野生稻中的等位基因類型對人類是無利的，而經(jīng)過馴化以后栽培稻中的等位基因類型對人類是有利的。即人類馴化選擇了對人類有利的性狀，但并不是所有的有利性狀都是馴化的。
[0006]利用源于粳稻品種Asominori和秈稻品種IR24的重組自交系(RILs)群體，我們之前的研究檢測到多個抽穗期 QTL(Wei XJ, et al.(2010)Mol Breeding25:287 - 298)，其中我們關(guān)注位于第二染色體長臂末端RM318和RM240之間的微效抽穗期QTL (該QTL在本發(fā)明中被命名為DTH2)，在自然長日照條件下，包含Asominori等位基因的植株比包含IR24等位基因的植株提前抽穗。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)通過QTL克隆的基因?qū)儆谠陂L日照條件下促進(jìn)開花的類型(Tsuji H, Taoka KI and Shimamoto K(2010)Current Opinion inPlant Biologyl4:l -8)。精細(xì)定位水稻抽穗期QTL最好的辦法就是構(gòu)建染色體片段置換系(CSSL)或近等基因系(NIL)，使目標(biāo)QTL位點(diǎn)之外的絕大部分背景保持一致，使該位點(diǎn)表現(xiàn)為典型的孟德爾遺傳，即數(shù)量性狀質(zhì)量化。但是對于微效QTL來說，在F2群體里，由于雜合型單株和隱性純合型單株的表型差異較小，在構(gòu)建NIL的基礎(chǔ)上，還需要把F2群體繁衍成F2:3家系群體，使表型易于鑒定。之后把QTL分解為單個基因并進(jìn)行圖位克隆，即通過分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定目的基因在染色體上的物理位置。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一組控制水稻抽穗期的DTH2基因及其單倍型和應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0009]一個控制水稻抽穗期基因DTH2，它來自水稻，長度為7867bp，相應(yīng)編碼CCT/B_box鋅指蛋白的407個氨基酸，顯性等位基因DTH2-a (DTH2等位基因來自一個日本的粳稻品種Asominori)全序列為SEQ ID N0.1，其CDS序列如SEQ ID N0.2所示，屬于DTH2基因的單倍型 5 (Haplotype5, Hap5)。
[0010]所述的控制水稻抽穗期基因DTH2在水稻品種改良中的應(yīng)用。
[0011]所述的基因DTH2的隱性等位基因DTH2-1 (DTH2等位基因來自一個國際水稻所的秈稻品種IR24)，核苷酸全序列如SEQ ID N0.3所示，其CDS序列如SEQ ID N0.4所示，屬于DTH2 基因的單倍型 I (Haplotypel, HapD0
[0012]所述的基因DTH2的隱性等位基因DTH2_i在水稻品種改良中的應(yīng)用。
[0013]所述的基因DTH2的單倍型2 (Hap2)，其⑶S序列如序列表SEQ ID N0.5所示。
[0014]所述的基因DTH2的單倍型2在水稻品種改良中的應(yīng)用。
[0015]所述的基因DTH2的單倍型3 (Hap3)，其⑶S序列如序列表SEQ ID N0.6所示。
[0016]所述的基因DTH2的單倍型3在水稻品種改良中的應(yīng)用。
[0017]所述的基因DTH2的單倍型4 (Hap4)，其⑶S序列如序列表SEQ ID N0.7所示。
[0018]所述的基因DTH2的單倍型4在水稻品種改良中的應(yīng)用。
[0019]根據(jù)圖1的技術(shù)路線，本發(fā)明為精細(xì)定位QTL DTH2，利用以Asominori為背景親本，IR24為供體親本的染色體片段置換系(CSSLs)群體(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所保存)，鑒定出晚抽穗的攜帶DTH2-1插入片段的家系CSSL18。從CSSL18與Asominori雜交構(gòu)建的次級F2群體中，再次檢測到DTH2 (L0D值24.70，貢獻(xiàn)率26.22%)。進(jìn)一步利用分子標(biāo)記輔助選擇的方法(MAS)，構(gòu)建了僅攜帶DTH2的近等基因系-一NIL(DTH2)并利用NIL(DTH2) XAsominori的次級F2, F2:3以及F3:4群體，最終將DTH2限定在標(biāo)記dCAPS3與dCAPS5之間約37.6kb的區(qū)間范圍內(nèi)，共有9個候選基因。序列分析發(fā)現(xiàn)第5個基因，編碼CCT/B-box鋅指蛋白，且與擬南芥C0L9同源，暗示著該基因可能是目的基因。通過構(gòu)建一個包含該基因的7867bp基因組區(qū)段的轉(zhuǎn)基因組全長互補(bǔ)載體，轉(zhuǎn)入NIL(DTH2)中，發(fā)現(xiàn)T2R轉(zhuǎn)基因家系抽穗提前。通過Real-time RT PCR發(fā)現(xiàn)，DTH2在水稻抽穗期途徑中位于Hd3a和RFTl的上游。隨后通過對79份栽培稻和48份野生稻的測序，發(fā)現(xiàn)在DTH2編碼區(qū)存在5個堿基差異，導(dǎo)致3個氨基酸變化，產(chǎn)生5種單倍型。并證明DTH2在馴化中被選擇，且起源于中國。
[0020]有益效果
[0021]1.本發(fā)明通過構(gòu)建近等基因系NIL(DTH2)，并利用NIL(DTH2) XAsominori的次級f2、f2:3以及f3:4群體，通過圖位克隆的方法，最終克隆了一個擴(kuò)大栽培稻向北分布區(qū)及控制水稻抽穗期的微效基因DTH2，此基因是第一個通過圖位克隆的方法克隆的在長日條件下促進(jìn)水稻抽穗的基因，為擴(kuò)大栽培稻向北分布區(qū)提供新的基因資源，也為其他作物利用電子克隆法克隆相關(guān)基因提供了基因序列，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該基因是一個馴化基因，為水稻的進(jìn)化研究提供新的思路。
[0022]2.將DTH2_a導(dǎo)入包含DTH2_i的育種材料中，可以使該材料的抽穗期提前，種植范圍由其原產(chǎn)地向北遷移，擴(kuò)大栽培稻的向北分布區(qū)。
[0023]3.本發(fā)明克隆的基因與馴化相關(guān)，其馴化模式可為水稻、玉米和大豆等農(nóng)作物的光周期反應(yīng)和分子進(jìn)化研究提供參照。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1.本發(fā)明的總體技術(shù)流程圖
[0025]圖2.DTH2的精細(xì)定位和轉(zhuǎn)基因全長互補(bǔ)T2代和干擾T2代的結(jié)果。
[0026]A圖是DTH2精細(xì)定位圖；B圖表示DTH2的基因結(jié)構(gòu)；C_D圖表示轉(zhuǎn)基因全長互補(bǔ)T2代和干擾T2代及兩親本Asominori和NIL (DTH2)的表型(C)和抽穗期數(shù)據(jù)(D)，P1和P2分別指全長互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株和NIL(DTH2)及干擾植株和Asominori之間的P值，采用威爾科克森符號秩檢驗(yàn)，P3指兩親本之間的P值，
[0027]采用雙尾t檢測，η指實(shí)驗(yàn)中檢測的植株數(shù)，平均值土 s.e.m.。
[0028]圖3.本發(fā)明中用到的雙元載體PCAMBIA1305.1的載體圖。
[0029]圖4.DTH2編碼區(qū)的自然變異和地理分布分析。
[0030]圖A是對79個栽培稻和48個野生稻的DTH2編碼區(qū)測序的結(jié)果，顯示了 5個SNP和5種單倍型；圖B顯示了 5種單倍型的地理分布；圖C顯示了 5種單倍型的轉(zhuǎn)基因結(jié)果，平均值土 s.e.m.，P值采用雙尾t檢測得出；圖D顯示了 5種單倍型在不同亞種之間的分布和它們之間的進(jìn)化關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1DTH2近等基因系的構(gòu)建
[0032]1.DTH2的QTL檢測，回交與選擇
[0033]利用Asominori和IR24的RILs群體，我們之前的研究檢測到多個控制抽穗期的基因位點(diǎn)，其中的一個位點(diǎn)DTH2,在自然長日照(natural long-day, NLD)條件下,包含DTH2-a的植株比包含DTH2-1的植株提前抽穗。利用以Asominori為背景親本，IR24為供體親本的CSSLs群體，我們發(fā)現(xiàn)CSSL18比背景親本Asominori具有極顯著遲熟且表達(dá)穩(wěn)定，由于CSSL18與背景親本Asominori相比，僅在某些片段上插入了 IR24片段，因此插入的秈稻片段IR24是導(dǎo)致CSSL18具有極顯著遲熟的根本原因。我們將CSSL18與Asominori雜交一次，連續(xù)回交4次，然后自交構(gòu)建一個包含374個單株的CSSL18/ASominori BC4F2群體，采用IciMapping v2.1軟件，從中再次檢測到DTH2。目標(biāo)區(qū)段確定在兩個SSR(SimpleSequence Repeat)標(biāo)記RM318和RM240之間(RM系列引物公知公用，見網(wǎng)站www.gramene.0rg)，遺傳距離9.6cM (厘摩)。從表1可以看出在這個區(qū)間存在一個控制抽穗期的QTL，貢獻(xiàn)率26.22%，運(yùn)用MAS技術(shù)，選擇在DTH2區(qū)段為純合IR24基因型，而在其他區(qū)段為純合Asominori背景的單株即為NIL(DTH2)。
[0034]表1.位于RM318和RM240之間控制抽穗期的QTL
[0035]
【權(quán)利要求】
1.SEQ ID N0.1所示的基因DTH2的單倍型4，其CDS序列如序列表SEQ ID N0.7所示。
2.權(quán)利要求1所述的所述的基因DTH2的單倍型4在獲得抽穗期提前的水稻品種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/29GK103589734SQ201310548855
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月5日
【發(fā)明者】萬建民, 吳瑋勛, 陸廣文, 江玲, 鄭曉明, 鐘錚錚 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)