一種多重pcr法檢測(cè)水稻病原細(xì)菌的引物組及試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種多重PCR法檢測(cè)水稻病原細(xì)菌的引物組及試劑盒和方法。引物組包括六對(duì)引物，第一對(duì)引物的堿基序列如SEQ?ID?No.1～2所示，第二對(duì)引物的堿基序列如SEQ?ID?No.3～4所示，第三對(duì)引物的堿基序列如SEQ?ID?No.5～6所示，第四對(duì)引物的堿基序列如SEQ?ID?No.7～8所示，第五對(duì)引物的堿基序列如SEQ?ID?No.9～10所示，第六對(duì)引物的堿基序列如SEQ?ID?No.11～12所示。利用本發(fā)明的引物組和試劑盒能實(shí)現(xiàn)對(duì)六種水稻病原細(xì)菌的一次性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、快速、靈敏、特異穩(wěn)定，大大節(jié)約了時(shí)間和成本。
【專利說(shuō)明】—種多重PCR法檢測(cè)水稻病原細(xì)菌的引物組及試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水稻病原細(xì)菌檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種多重PCR法檢測(cè)水稻病原細(xì)菌的引物組及試劑盒和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是最重要的糧食作物，世界上一半人口以水稻為生。隨著水稻種質(zhì)資源的調(diào)運(yùn)日益頻繁，一些水稻病害隨種子調(diào)運(yùn)而嚴(yán)重?cái)U(kuò)散，對(duì)稻米產(chǎn)量造成了不可挽回的損失。因此，重視并加強(qiáng)檢驗(yàn)檢疫工作，對(duì)切實(shí)保障稻米生產(chǎn)安全及產(chǎn)地生態(tài)安全有著重要的意義。此外，我國(guó)加入WTO后，在植物出入境檢疫方面亦面臨著空前的挑戰(zhàn)。為確保我國(guó)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，必須一方面有效制止病蟲(chóng)害傳入我國(guó)，另一方面則要保證我國(guó)出口的農(nóng)產(chǎn)品符合進(jìn)口國(guó)的要求。而這些檢疫、防疫工作的落實(shí)則依賴靈敏、準(zhǔn)確以及便捷的病原檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。
[0003]細(xì)菌性病害是國(guó)內(nèi)外水稻生產(chǎn)的主要障礙，水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.0ryzae, Xoo)> 水稻細(xì)菌性條斑病菌(X.0ryzae pv.0ryzicola, Xoc)> 水稻細(xì)菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)、水稻細(xì)菌性谷腐病菌(B.gladioli )、水稻細(xì)菌性褐條病菌(Acidovorax avenae subsp.Avenae, Aaa)以及水稻葉鞘細(xì)菌性褐腐病菌(Pseudomonas fuscovaginae)是六種最主要的水稻細(xì)菌病害,對(duì)世界和中國(guó)的水稻生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。其中，水稻白葉枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌和水稻細(xì)菌性谷枯病菌被列為我國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫名錄和全國(guó)植物檢疫性有害生物名單。由于這六種病原細(xì)菌均可通過(guò)種子進(jìn)行傳播，現(xiàn)許多國(guó)家檢疫部門(mén)都加大了檢疫力度。然而這六種病原細(xì)菌通常情況下會(huì)在同一水稻產(chǎn)區(qū)同時(shí)發(fā)生，在田間很難區(qū)分。更重要的是，當(dāng)多種病原共同發(fā)生時(shí)，部分病原菌會(huì)潛伏于病株中，暫不表現(xiàn)癥狀，待環(huán)境條件成熟而大面積爆發(fā)。特別是水稻細(xì)菌性谷枯病菌和水稻細(xì)菌性谷腐病菌、水稻細(xì)菌性褐條病與水稻細(xì)菌性褐斑病的田間癥狀極為相似，稻農(nóng)和一般技術(shù)人員很難用常規(guī)的方法直接區(qū)分，進(jìn)而導(dǎo)致防治措施沒(méi)有針對(duì)性，植物檢疫無(wú)法落到實(shí)處，而造成重大損失。對(duì)田間這六種細(xì)菌性病害的早期診斷與植物檢疫檢測(cè)刻不容緩。
[0004]傳統(tǒng)病害診斷采用肉眼癥狀識(shí)別、病原菌分離、革蘭氏染色、生理生化反應(yīng)特性測(cè)定、BILOG等鑒定方法，單單檢測(cè)一種菌的周期就長(zhǎng)達(dá)一月，過(guò)程繁瑣，且檢測(cè)結(jié)果不一定可靠。若要分別檢測(cè)六種病原菌，則更加費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本極高。
[0005]多重PCR技術(shù)作為一種新型的病害分子診斷和病原檢測(cè)手段，利用特異性引物同時(shí)檢測(cè)六種病原菌，且檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度高，能有效地彌補(bǔ)單一菌檢測(cè)的缺陷。但目前國(guó)內(nèi)外尚未有利用該類技術(shù)在植物上同時(shí)檢測(cè)六種不同屬病原細(xì)菌的先例?！?br/>【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種多重PCR法檢測(cè)水稻病原細(xì)菌的引物組，利用該引物組可同時(shí)對(duì)六種水稻病原細(xì)菌進(jìn)行快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)。
[0007]多重PCR法檢測(cè)水稻病原細(xì)菌的引物組，包括六對(duì)引物，其中:
[0008]第一對(duì)引物的堿基序列如SEQ ID N0.1~2所示，用于檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzicola, Xoc)；
[0009]第二對(duì)引物的堿基序列如SEQ ID N0.3~4所示，用于檢測(cè)水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae, Xoo)；
[0010]第三對(duì)引物的堿基序列如SEQ ID N0.5~6所示，用于檢測(cè)水稻細(xì)菌性褐條病菌(Acidovorax avenae subsp.avenae, Aaa)；
[0011]第四對(duì)引物的堿基序列如SEQ ID N0.7~8所示，用于檢測(cè)水稻細(xì)菌性谷枯病菌(Burkolderia glumae)；
[0012]第五對(duì)引物的堿基序列如SEQ ID N0.9~10所示，用于檢測(cè)水稻細(xì)菌性谷腐病菌(Burkolderia gladioli)；
[0013]第六對(duì)引物的堿基序列如SEQ ID N0.11~12所示，用于檢測(cè)水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌(Pseudomonas fuscovaginae)。
[0014]本發(fā)明的六對(duì)引物能用于一次多重PCR擴(kuò)增中對(duì)六種水稻病原細(xì)菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，六對(duì)引物之間不會(huì)形成引物二聚體，且每對(duì)引物與各自的目標(biāo)模板區(qū)域均具有高度特異性，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可信。
[0015]本發(fā)明還提供了一種多重PCR法檢測(cè)水稻病原細(xì)菌的試劑盒，包括一次性多重PCR檢測(cè)體系，所述一次性多重PCR檢測(cè)體系中含有所述引物組。
[0016]作為優(yōu)選，所述一次性多重PCR檢測(cè)體系由以下成分混合而成:所述一次性多重PCR檢測(cè)體系由以下成分混合而成:Multiplex PCR Mixl0.2~0.3 μ L，Multiplex PCRMix224~26yL，2xTaq PCR Mix4.5~5.5 μ L，濃度為0.12 μ M的第一、三、五、六對(duì)引物各0.25~0.35 μ L，濃度為0.096 μ M的第四對(duì)引物0.22~0.26 μ L，濃度為0.2 μ M的第二對(duì)引物0.4~0.6 μ L ;更優(yōu)選由以下成分混合而成!Multiplex PCR Mixl0.25 μ L,MultiplexPCR Μ?χ225μ L,2xTaq PCR Μ?χ5μ L，濃度為 0.12 μ M 的第一、三、五、六對(duì)引物各(λ 3 μ L，濃度為0.096 μ M的第四對(duì)引物0.24 μ L，濃度為0.2 μ M的第二對(duì)引物0.5 μ L。
[0017]如未作特殊說(shuō)明，上述引物的含量是指每對(duì)引物的上下游引物各自的含量。Multiplex PCR Mixl> Multiplex PCR Mix2 可購(gòu)自 TaKaRa Multiplex PCR 試劑盒，2xTaqPCR Mix可購(gòu)自博彩生物。
[0018]進(jìn)行多重PCR時(shí)，只需在一次性多重PCR檢測(cè)體系中直接加入擴(kuò)增模板即可，簡(jiǎn)單方便，能有效提聞檢測(cè)效率。
[0019]本發(fā)明還提供了一種多重PCR法檢測(cè)水稻病原細(xì)菌的方法，包括:
[0020](I)從水稻樣本中分離病原細(xì)菌并提取菌物DNA，或制備水稻樣本粉末；
[0021](2)利用如權(quán)利要求2~4任一所述的試劑盒，在所述一次性多重PCR檢測(cè)體系中加入菌物DNA或水稻樣本粉末，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；
[0022](3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離、染色，根據(jù)擴(kuò)增條帶判定待測(cè)樣品中水稻病原細(xì)菌的種類。
[0023]除可用于對(duì)常規(guī)提取的菌物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增外，本發(fā)明的試劑盒還能以水稻樣本粉末為模板，對(duì)田間采集的水稻樣本進(jìn)行快速檢測(cè)。所述水稻樣本粉末的制備方法為:采集水稻樣本，經(jīng)無(wú)菌水沖洗、晾干后，進(jìn)行無(wú)菌研磨，獲得所述水稻樣本粉末。所述水稻樣本優(yōu)選為谷粒、葉鞘或葉片。本發(fā)明對(duì)水稻樣本粉末的粒徑等參數(shù)沒(méi)有要求，盡量充分研磨即可。
[0024]步驟(2)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)，優(yōu)選采用50μ L的擴(kuò)增體系。其中，利用菌物DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)保證擴(kuò)增體系中，水稻細(xì)菌性條斑病菌DNA濃度不低于3.5ng/yL,水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌菌DNA濃度不低于Ing/ μ L，水稻細(xì)菌性谷枯病菌DNA濃度不低于4ng/ μ L，水稻細(xì)菌性褐條病菌DNA濃度不低于0.6ng/ μ L，水稻細(xì)菌性谷腐病菌DNA濃度不低于0.8ng/ μ L,水稻白葉枯病菌DNA濃度不低于0.5ng/ μ L。
[0025]利用水稻樣本粉末進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增體系中水稻樣本粉末的濃度不低于2mg/mL。優(yōu)選地，用ddH20將水稻樣本粉末制成水懸液后，再加入到所述一次性多重PCR檢測(cè)體系中至總體積50 μ L，獲得擴(kuò)增體系。
[0026]水稻樣本粉末中菌物的種類和含量未知但相對(duì)較少，因此在擴(kuò)增體系中加入較多的水稻樣本粉末的水懸液，保證擴(kuò)增體系中水稻白葉枯病菌的濃度不少于102cfu/mL，水稻細(xì)菌性條斑病菌、水稻細(xì)菌性褐條病菌、水稻細(xì)菌性谷枯病菌的濃度不少于105cfu/mL，水稻細(xì)菌性谷腐病菌、水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌的濃度不少于106cfu/mL。
[0027]當(dāng)然，除了直接采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行多重PCR外，也可利用本發(fā)明的引物組，選用其他常規(guī)的試劑進(jìn)行多重PCR。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0029]( I)利用本發(fā)明的引物組和試劑盒能實(shí)現(xiàn)對(duì)六種水稻病原細(xì)菌的一次性檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果特異穩(wěn)定，重復(fù)性好，對(duì)包括標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株在內(nèi)的約130種菌株進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，只有本發(fā)明引物組針對(duì)的六種水稻病原細(xì)菌出現(xiàn)特異性條帶，而同屬的近緣菌株和其他腐生菌株均未得到條帶；
[0030](2)本發(fā)明的試劑盒可以直接對(duì)田間采集的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，而無(wú)需進(jìn)行菌株分離及DNA提取，更加方便實(shí)用，樣品分析僅需4-5小時(shí)，比用常規(guī)方法節(jié)省時(shí)間90%以上；并可同時(shí)檢測(cè)到試劑盒中六種水稻病原細(xì)菌的任意一種或多種，大大節(jié)約了時(shí)間和成本；
[0031](3)本發(fā)明的引物組和試劑盒對(duì)六種水稻病原細(xì)菌的檢出率高，從明顯發(fā)病的樣本中均擴(kuò)增到特異性條帶，一些癥狀不明顯或無(wú)癥狀的樣本也擴(kuò)增到特異性條帶，，并且分離獲得相應(yīng)病原細(xì)菌；有些在田間只顯示I到2種細(xì)菌病害癥狀的水稻樣本上，能夠檢測(cè)到這六種目標(biāo)病原細(xì)菌中的3到4種；
[0032](4)無(wú)論利用菌物DNA或者水稻樣本粉末進(jìn)行多種PCR，本發(fā)明的引物組和試劑盒對(duì)六種水稻病原細(xì)菌的檢出限均較低，靈敏度高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為以菌物DNA為模板對(duì)六種水稻病原細(xì)菌進(jìn)行多重PCR檢測(cè)的電泳結(jié)果圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，opt泳道中為六種病原細(xì)菌的DNA優(yōu)化的最低限度濃度:水稻白葉枯病菌0.5ng/ μ L，水稻細(xì)菌性條斑病菌3.5ng/ μ L，水稻細(xì)菌性褐條病菌0.6ng/ μ L，水稻細(xì)菌性谷枯病菌4ng/ μ L，水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌Ing/ μ L和水稻細(xì)菌性谷腐病菌0.8ng/ μ L，I泳道中六種病原細(xì)菌的DNA均為Ing/ μ L，2泳道中六種病原細(xì)菌的DNA均為2ng/ μ L，3泳道為水代替DNA的陰性對(duì)照；[0034]圖2為以菌體為模板對(duì)六種水稻病原細(xì)菌進(jìn)行多重PCR檢測(cè)的電泳結(jié)果圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，opt泳道中為六種病原細(xì)菌的菌液優(yōu)化的最低限度濃度:水稻白葉枯病菌102cfu/mL，水稻細(xì)菌性條斑病菌，水稻細(xì)菌性褐條病菌和水稻細(xì)菌性谷枯病菌105cfu/mL，水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌和水稻細(xì)菌性谷腐病菌106cfu/mL，I泳道中六種病原細(xì)菌的菌液濃度均為108cfu/mL，2泳道中六種病原細(xì)菌的菌液濃度均為106cfu/mL，3泳道中六種病原細(xì)菌的菌液濃度均為104cfu/mL，4泳道為水代替菌液的陰性對(duì)照；
[0035]圖3為以菌體為模板對(duì)六種水稻病原細(xì)菌的隨機(jī)組合進(jìn)行多重PCR檢測(cè)的電泳結(jié)果圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I泳道為六種病原細(xì)菌的組合，2~5泳道為隨機(jī)的五種病原細(xì)菌組合，6~10泳道為隨機(jī)的四種病原細(xì)菌組合，11~13泳道為隨機(jī)的三種病原細(xì)菌組合，14泳道為水代替菌液的陰性對(duì)照；
[0036]圖4為以菌物DNA為模板對(duì)121株近緣菌株和其它腐生或附生菌株進(jìn)行多重PCR檢測(cè)的電泳結(jié)果圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-2泳道為P.fIuorescens, 3-5泳道為P.putida, 6泳道為P.syringae pv.0ryzae, 7-10泳道為P.sp.,11_20泳道為13.31]113丨€31'1已，21-23 泳道為 B.anthina, 24-25 泳道為 B.arboris, 26-29 泳道為 B.cenocepacia, 30-45泳道為 B.cepacia, 46-55 泳道為 B.1ateens, 56, 57 泳道為 B.pyrrocinia, 58-63 泳道為 B.seminalis,64-66 泳道為 B.stabilis,67-68 泳道為 B.vietnamiensis,69-89 泳道為 B.sp.,90-92 泳道為 A.avenae subsp.Citrulli,93-98 泳道為 Enterobacteria.Cancerogenus, 99-107 泳道為 E.cloacae subsp.Dissolvens, 108-110 泳道為 E.pyrinus,111-115泳道為E.sp.，116-121泳道為水稻上分離得到的未知菌株；圖中100以上泳道百位數(shù)字用.表示；
[0037]圖5為利用粉末 水懸液對(duì)30個(gè)水稻樣本進(jìn)行多次PCR檢測(cè)的電泳結(jié)果圖；其中，皿為0嫩分子量標(biāo)準(zhǔn)，01~20泳道為谷粒樣本，018、048、068、098、188泳道為葉鞘樣本，22、23泳道為葉片樣本。
【具體實(shí)施方式】
[0038]I引物合成
[0039]通過(guò)對(duì)水稻細(xì)菌性褐條病菌(Aaa) RS-1、水稻細(xì)菌性谷枯病菌(B.glumae)ZUB1212及LMG2196、水稻細(xì)菌性谷腐病菌(B.gladioli) SD1314及LMG2216和水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌(P.fuscovaginae)CB98818的全序列基因組進(jìn)行測(cè)序，結(jié)合NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的有關(guān)數(shù)據(jù)，利用聯(lián)配軟件及引物合成軟件并與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)了本發(fā)明的第三至六對(duì)引物。
[0040]針對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xoc)的第一對(duì)引物，以及針對(duì)水稻白葉枯病菌(Xoo)的第二對(duì)引物均引自參考文獻(xiàn)(Lang JM et al..2010.Genomics-Based DiagnosticMarker Development for Xanthomonas oryzae pv.0ryzae and X.0ryzae pv.0ryzicola.Plant Dis.94:311-319)。這六對(duì)引物的堿基序列見(jiàn)表1。
[0041 ] 表1六對(duì)弓丨物的堿基序列
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種多重PCR法檢測(cè)水稻病原細(xì)菌的引物組，其特征在于，包括六對(duì)引物，第一對(duì)引物的堿基序列如SEQ ID N0.1~2所示，第二對(duì)引物的堿基序列如SEQ ID N0.3~4所示，第三對(duì)引物的堿基序列如SEQ ID N0.5~6所示，第四對(duì)引物的堿基序列如SEQ ID N0.7~8所示，第五對(duì)引物的堿基序列如SEQ ID N0.9~10所示，第六對(duì)引物的堿基序列如SEQ IDN0.11 ~ 12 所示。
2.一種多重PCR法檢測(cè)水稻病原細(xì)菌的試劑盒，包括一次性多重PCR檢測(cè)體系，其特征在于，所述一次性多重PCR檢測(cè)體系中含有如權(quán)利要求1所述的引物組。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述一次性多重PCR檢測(cè)體系由以下成分混合而成 Multiplex PCR Mixl0.2 ~0.3 μ L，Multiplex PCR Mix224 ~26 μ L，2xTaqPCR Mix4.5~5.5μ L，濃度為0.12 μ M的第一、三、五、六對(duì)引物各0.25~0.35 μ L，濃度為0.096 μ M的第四對(duì)引物0.22~0.26 μ L，濃度為0.2μ M的第二對(duì)引物0.4~0.6 μ L。
4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述一次性多重PCR檢測(cè)體系由以下成分混合而成 Multiplex PCR Mixl0.5 μ L,Multiplex PCR Mix225 μ L, 2xTaq PCR Mix5yL，濃度為0.12 μ M的第一、三、五、六對(duì)引物各0.3 μ L，濃度為0.096 μ M的第四對(duì)引物0.24 μ L，濃度為0.2 μ M的第二對(duì)引物0.5 μ L。
5.一種多重PCR法檢測(cè)水稻病原細(xì)菌的方法，包括: (1)從水稻樣本中分離病原細(xì)菌并提取菌物DNA，或制備水稻樣本粉末； (2)利用如權(quán)利要求2~4任一所述的試劑盒，在所述一次性多重PCR檢測(cè)體系中加入菌物DNA或水稻樣本粉末，獲得 擴(kuò)增體系，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增； (3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離、染色，根據(jù)擴(kuò)增條帶判定待測(cè)樣品中水稻病原細(xì)菌的種類； 所述水稻病原細(xì)菌為:水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzicola)、水稻細(xì)菌性葉鞘褐腐病菌(Pseudomonas fuscovaginae)、水稻細(xì)菌性谷腐病菌(Burkolderiagladioli)、水稻細(xì)菌性褐條病菌(Acidovorax avenae subsp.avenae)、水稻細(xì)菌性谷枯病菌(Burkolderia glumae)、7jC稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用水稻樣本粉末進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增體系中水稻樣本粉末的濃度不低于2mg/mL。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述水稻樣本粉末的制備方法為:采集水稻樣本，經(jīng)無(wú)菌水沖洗、晾干后，進(jìn)行無(wú)菌研磨，獲得所述水稻樣本粉末。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述水稻樣本為谷粒、葉鞘或葉片。
【文檔編號(hào)】C12R1/38GK103627798SQ201310548877
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】崔舟琦, 謝關(guān)林, 朱勃, 李斌 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)