一種禽流感h9亞型滅活疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種禽流感H9亞型滅活疫苗，由2株H9亞型禽流感病毒經(jīng)滅活后和油佐劑混合組成，2株H9亞型禽流感病毒分別為HZ株和FJ株，HZ株的HA基因序列如SEQ?ID?NO:1所示，F(xiàn)J株的HA基因序列如SEQ?ID?NO:2所示。其通過制備H9亞型禽流感病毒HZ株毒液和FJ株毒液，滅活H9亞型禽流感病毒HZ株毒液和FJ株毒液，制備油相溶液，制備水相溶液以及乳化制得。本發(fā)明利用2株不同地方分離的H9亞型禽流感毒株制備一種免疫原性強(qiáng)、交叉保護(hù)性好的滅活疫苗，能夠應(yīng)用于預(yù)防雞H9亞型禽流感疾病中。該疫苗接種雞后，抗體效價(jià)高，使得雞對(duì)不同地方流行的H9亞型毒株攻毒保護(hù)力好，并且安全性高、效力穩(wěn)定。
【專利說明】一種禽流感H9亞型滅活疫苗及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種禽流感H9亞型滅活疫苗及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]禽流感(Avian Influenza，Al)，是由流感病毒屬的A型流感病毒引起的禽類感染和疾病的總稱。雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等均可感染，而對(duì)家養(yǎng)的雞和火雞引起的危害最為嚴(yán)重，候鳥、觀賞鳥、散禽攜帶病毒遷徙可能是禽流感世界性流行的主要原因，豬等也可作為“混合器”傳播本病。
[0003]根據(jù)禽流感病毒AIV對(duì)禽類致病性的差異，可將AIV分為高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。H9亞型禽流感屬于低致病性流感病毒，是目前我國雞群中存在的AIV主要亞型，該病毒發(fā)病后雖然致死率不高(一般不超過30%)，但常導(dǎo)致呼吸道癥狀，蛋雞的產(chǎn)蛋下降，并使雞群易繼發(fā)嚴(yán)重的呼吸道疾病，影響家禽生產(chǎn)性能。目前其流行特點(diǎn)是:H9亞型仍是當(dāng)前流行的主要亞型；H9亞型已發(fā)生變異；H9亞型成散發(fā)或地方性流行；H9亞型呈現(xiàn)出條件性致病的特性；H9亞型對(duì)肉仔雞危害日益嚴(yán)重。
[0004]AIV遺傳變異極為頻繁，血清亞型眾多。研究發(fā)現(xiàn)，AIV可通過基于的點(diǎn)突變、基因重組和節(jié)段重排而發(fā)生不同程度的變異，從而使流感病毒的抗原性和致病性發(fā)生改變。AIV的變異主要發(fā)生在HA和NA基因上，尤其是HA基因，其分子機(jī)理主要有:抗原漂移、抗原轉(zhuǎn)變、RNA重組和缺損性病毒顆粒的產(chǎn)生等。近些年，隨著反向遺傳學(xué)的發(fā)展，禽流感遺傳變異和其機(jī)制逐步得到證實(shí)。就H5亞型而言，根據(jù)當(dāng)前H5亞型的變異情況，采用反向遺傳技術(shù)獲得了 Rec-l、Rec-4、Rec-5和Rec_6疫苗株，在高致病性禽流感的防控方面取得了一定的成績。關(guān)于H9亞型的變異研究也一直在進(jìn)行中。劉巖對(duì)1998-2002年間分離的H9亞型禽流感病毒的抗原性變異進(jìn)行了研究，經(jīng)交叉HI試驗(yàn)、雞胚中和試驗(yàn)、細(xì)胞中和試驗(yàn)、交叉攻毒保護(hù)試驗(yàn)及HA基因分析，證明了 H9亞型禽流感病毒已經(jīng)發(fā)生了抗原性漂移。而姜北宇等人的研究則表明，1998-2008年在北京及河北省分離的4株H9亞型禽流感流行毒株間大多產(chǎn)生了較好的交叉保護(hù)力，用1998-2006年分離的流行毒株制備的滅活疫苗能夠保護(hù)2008年流行毒株的攻擊?？梢姡瑢?duì)于H9亞型禽流感病毒流行毒株抗原性是否發(fā)生變異的問題，不同報(bào)道得出的試驗(yàn)結(jié)論存在較大的差異。
[0005]疫苗免疫仍是目前防控H9亞型禽流感有效辦法之一。隨著H9亞型禽流感滅活疫苗單苗或者聯(lián)苗的廣泛應(yīng)用，近些年來，在免疫壓力的作用下，開始出現(xiàn)以前使用的疫苗毒株對(duì)現(xiàn)地分離毒株的免疫保護(hù)力下降，許多養(yǎng)殖單位根據(jù)自身免疫需要紛紛采用現(xiàn)地流行毒株制成滅活疫苗來防控H9亞型禽流感的發(fā)生，但這些疫苗不能正規(guī)生產(chǎn)、銷售和大面積推廣，并且不能保證其安全性。因此，針對(duì)疫病現(xiàn)在的流行特點(diǎn)，重新篩選安全、有效、穩(wěn)定的禽流感H9亞型病毒株制備H9亞型滅活疫苗顯得非常必要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用2株不同地方分離的H9亞型禽流感毒株制備成一種免疫原性強(qiáng)、交叉保護(hù)性好的滅活疫苗，用于預(yù)防雞H9亞型
禽流感。
[0007]為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下: [0008]一種禽流感H9亞型滅活疫苗，由2株H9亞型禽流感病毒經(jīng)滅活后和油佐劑混合組成，2株H9亞型禽流感病毒分別為HZ株和FJ株，其保藏登記號(hào)分別為CGMCC N0.8355和CGMCC N0.8354 ；HZ株的HA基因序列如SEQ ID NO:1所示，F(xiàn)J株的HA基因序列如SEQ IDNO: 2所示。HZ株和FJ株于2013年10月15日提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，該中心于2013年10月18日收到上述保藏菌株，保藏日期為2013年10月18日，該中心地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編100101。
[0009]一種禽流感H9亞型滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟:
[0010]I)制備H9亞型禽流感病毒HZ株毒液:將H9亞型禽流感病毒HZ株用生理鹽水作10_4稀釋，接種9~11日齡SPF雞胚，無菌收獲24~96小時(shí)內(nèi)死亡及96小時(shí)后仍存活的HA ^ 81og2的雞胚尿囊液作為H9亞型禽流感病毒HZ株毒液；
[0011]2)制備H9亞型禽流感病毒FJ株毒液:將H9亞型禽流感病毒FJ株用生理鹽水作10_4稀釋，接種9~11日齡SPF雞胚，無菌收獲24~96小時(shí)內(nèi)死亡及96小時(shí)后仍存活的HA ^ 81og2的雞胚尿囊液作為H9亞型禽流感病毒FJ株毒液；
[0012]3)滅活H9亞型禽流感病毒HZ株毒液:在HZ株毒液中加入終濃度為0.2%甲醛溶液，37 °C搖床滅活24小時(shí)；
[0013]4)滅活H9亞型禽流感病毒FJ株毒液:在FJ株毒液中加入終濃度為0.1%甲醛溶液，37 °C搖床滅活24小時(shí)；
[0014]5)制備油相溶液:將白油和司本-80按照體積比為18~20:1混合均勻，加熱溶解后經(jīng)121°C滅菌20分鐘；
[0015]6)制備水相溶液:將滅活的HZ株毒液和滅活的FJ株毒液按照體積比為6:4混合均勻，加入占混合毒液體積比0.75%的高壓滅菌的吐溫-80，用磁力攪拌器混勻攪拌至吐溫完全溶解；
[0016]7)乳化:將油相溶液和水相溶液按照體積比為I~2:1混合均勻，在乳化攪拌機(jī)中攪拌，即制成所述禽流感H9亞型滅活疫苗。
[0017]作為本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案，步驟5)中的白油和司本-80按照體積比為18.5:1混合。
[0018]作為本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案，步驟7)中的油相溶液和水相溶液按照體積比為
1.5:1混合。
[0019]一種禽流感H9亞型滅活疫苗在預(yù)防雞禽流感疾病中的應(yīng)用。
[0020]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于:利用2株不同地方分離的H9亞型禽流感毒株制備成一種免疫原性強(qiáng)、交叉保護(hù)性好的滅活疫苗，用于預(yù)防雞H9亞型禽流感。該疫苗接種雞后，抗體效價(jià)高，使得雞對(duì)不同地方流行的H9亞型毒株攻毒保護(hù)力好，并且安全性高、效力穩(wěn)定。
[0021]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0022]圖1為黃雞免疫HZ-FJ株滅活疫苗后的禽流感H9亞型血清抗體水平變化；
[0023]圖2為竹絲雞免疫HZ-FJ株滅活疫苗后禽流感H9亞型血清抗體水平變化。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1:H9亞型禽流感病毒HZ株和FJ株的生物學(xué)特性研究
[0025]本發(fā)明所述的H9亞型禽流感病毒HZ株和FJ株分別是2010年在我國浙江湖州地區(qū)和福建莆田地區(qū)發(fā)病雞場(chǎng)的發(fā)病雞群采集的病料中分離到的，經(jīng)測(cè)序鑒定，都為禽流感病毒H9亞型。其生物學(xué)特性研究如下:1)毒種傳代:HZ株、FJ株原代種毒(El代)用滅菌生理鹽水稀釋至10_4，經(jīng)尿囊腔內(nèi)接種9日齡SPF雞胚，每胚0.2mL,于37°C繼續(xù)孵育96小時(shí)，收獲24~96小時(shí)內(nèi)死亡及存活的雞胚，凍存過夜后逐個(gè)收獲雞胚液并檢測(cè)其HA效價(jià)，將檢驗(yàn)無菌且HA效價(jià)> 81og2的雞胚液混合，定量分裝，注明收獲日期、毒種代次等，標(biāo)記為E2代，留取少量繼續(xù)傳代，其余的置_70°C保存?zhèn)溆?。按上述方法連續(xù)在SPF雞胚內(nèi)傳代至第8代(ES代)，每一代分別測(cè)定各胚的HA效價(jià)及其平均數(shù)，結(jié)果詳見表1。
[0026]表1毒株El~E8代的HA效價(jià)
[0027]
【權(quán)利要求】
1.一種禽流感H9亞型滅活疫苗，其特征在于:由2株H9亞型禽流感病毒經(jīng)滅活后和油佐劑混合組成，2株H9亞型禽流感病毒分別為HZ株和FJ株，其保藏登記號(hào)分別為CGMCC:8355和CGMCC:8354,HZ株的HA基因序列如SEQ ID NO:1所示，F(xiàn)J株的HA基因序列如SEQID NO:2 所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的禽流感H9亞型滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟: 1)制備H9亞型禽流感病毒HZ株毒液:將H9亞型禽流感病毒HZ株用生理鹽水作10_4稀釋，接種9~11日齡SPF雞胚，無菌收獲24~96小時(shí)內(nèi)死亡及96小時(shí)后仍存活的HA≥81og2的雞胚尿囊液作為H9亞型禽流感病毒HZ株毒液； 2)制備H9亞型禽流感病毒FJ株毒液:將H9亞型禽流感病毒FJ株用生理鹽水作10_4稀釋，接種擴(kuò)11日齡SPF雞胚，無菌收獲24、6小時(shí)內(nèi)死亡及96小時(shí)后仍存活的HA >8log2的雞胚尿囊液作為H9亞型禽流感病毒FJ株毒液； 3)滅活H9亞型禽流感病毒HZ株毒液:在HZ株毒液中加入終濃度為0.2%甲醛溶液，37 °C搖床滅活24小時(shí)； 4)滅活H9亞型禽流感病毒FJ株毒液:在FJ株毒液中加入終濃度為0.1%甲醛溶液，37 °C搖床滅活24小時(shí)； 5)制備油相溶液:將白油和司本-80按照體積比為If20:1混合均勻，加熱溶解后經(jīng)121°C滅菌20分鐘； 6)制備水相溶液:將滅活的HZ株毒液和滅活的FJ株毒液按照體積比為6:4混合均勻，加入占混合毒液體積比0.75%的高壓滅菌的吐溫-80，用磁力攪拌器混勻攪拌至吐溫完全溶解； 7)乳化:將油相溶液和水相溶液按照體積比為廣2:1混合均勻，在乳化攪拌機(jī)中攪拌，即制成所述禽流感H9亞型滅活疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種禽流感H9亞型滅活疫苗的制備方法，其特征在于:步驟5)中的白油和司本-80按照體積比為18.5:1混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種禽流感H9亞型滅活疫苗的制備方法，其特征在于:步驟7)中的油相溶液和水相溶液按照體積比為1.5:1混合。
5.一種禽流感H9亞型滅活疫苗在預(yù)防雞禽流感疾病中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103736088SQ201310553960
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】陳瑞愛, 林綺萍, 陳春麗, 黃文科, 徐家華, 嚴(yán)潔珍 申請(qǐng)人:廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司