一種新型β-內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用特定的工程菌——轉(zhuǎn)化體BL21(DE3)/PET28-ASPGA生產(chǎn)新型內(nèi)酰胺類抗生素的方法，本發(fā)明方法以SEQIDNO：1所示的青霉素?；赴被嵝蛄袨榛A(chǔ)，首先引入突變位點(diǎn)，然后反向設(shè)計(jì)出核苷酸序列并進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)而通過(guò)進(jìn)行全基因合成、構(gòu)建重組載體、構(gòu)建出重組菌株；所構(gòu)建的重組菌株經(jīng)發(fā)酵、細(xì)胞破碎、分離、純化、脫色、固定化步驟處理后，最終得到能夠直接用于工業(yè)生產(chǎn)的新型內(nèi)酰胺類抗生素固定化酶成品。本發(fā)明方法所制備的固定化酶酶活高、穩(wěn)定性好、重復(fù)利用效果優(yōu)良，并且能夠催化多種內(nèi)酰胺類抗生素抗生素的合成如阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢克洛等。
【專利說(shuō)明】一種新型β-內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵與酶的純化固定化技術(shù)，具體的說(shuō)是涉及一種新型β -內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]β_內(nèi)酰胺類抗生素是一類非常重要和常用的抗生素，其療效高而毒性小，是目前治療感染性疾病的主要藥物，在抗生素使用中所占比例很大，也是在抗菌藥物中開(kāi)發(fā)品種最多的一類抗生素，主要包括青霉素類、頭孢菌素類、青霉稀類、單環(huán)內(nèi)酰胺類和β_內(nèi)酰胺酶抑制劑，其中又以青霉素類、頭孢菌素類為典型代表。
[0003]傳統(tǒng)半合成抗生素主要以化學(xué)法合成，青霉素類如阿莫西林，頭孢菌素類如頭孢氨芐等，其在化學(xué)合成過(guò)程經(jīng)過(guò)混酐、縮合、水解和結(jié)晶等工序，由于需要基團(tuán)保護(hù)、工藝路線長(zhǎng)，所用部分試劑毒性較大，污染嚴(yán)重，其中部分有害物質(zhì)易在藥物中造成微量殘留。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外都致力于酶法合成的研究，酶法合成頭孢氨芐有著許多化學(xué)法無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，它具有反應(yīng)條件溫和、工藝操作簡(jiǎn)單、無(wú)需基團(tuán)保護(hù)、清潔安全等優(yōu)點(diǎn)。6-APA，7-ACA和7-ADCA的許多酸化衍生物均可用酶法合成(Park C B, Lee S B, Stabilization ofpenicillin V Acylase from streptomyces lavendula by covalent immobilization.J.Mol.Cataly.B: Enzyme, 2000,9: 275-2281)。
[0004]酶法合成內(nèi)酰胺類抗生素研究的重點(diǎn)是合成用酶活性及穩(wěn)定性的提高，以及能夠，目前有關(guān)內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的研究主要傾向應(yīng)用于半合成青霉素和頭孢菌素類的工業(yè)生產(chǎn)中，用以催 化制備高效、廣譜、適用于不同用途的新型β_內(nèi)酰胺抗生素。該酶一方面可以催化青霉素或頭孢霉素水解，得到半合成抗生素的重要中間體6-氨基青霉烷酸(6-ΑΡΑ)和7-氨基頭孢烷酸(7-ACA);另一方面可以催化?；磻?yīng)由6-ΑΡΑ合成新型青霉素或由7-ACA合成新型頭孢菌素，其中應(yīng)用較多的半合成抗生素有氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢羥氨芐和頭孢克洛。這些抗生素的合成應(yīng)用最廣的為青霉素?；浮?br> [0005]產(chǎn)青霉素?；傅奈⑸锖芏啵煞譃楦锾m氏陰性菌(G_)和革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)兩大類，前者有大腸桿菌，嗜檸檬酸克魯沃爾氏菌，雷氏普羅威登斯菌，糞產(chǎn)堿桿菌與無(wú)色桿菌木糖氧化屬等；后者有巨大芽孢桿菌與粘節(jié)桿菌等。G—菌產(chǎn)生的青霉素?；竿ǔ６ㄎ挥谥苜|(zhì)空間，G+菌產(chǎn)生的青霉素酰化酶則分泌于胞外。
[0006]內(nèi)酰胺類抗生素合成酶生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一是高表達(dá)量菌株的獲得。雖然以上已經(jīng)提到的產(chǎn)青霉素?；傅奈⑸锖芏?，但是這些原始菌株的表達(dá)量一般難以滿足生產(chǎn)上的需求，并且很多需要在培養(yǎng)初期添加苯乙酸誘導(dǎo)表達(dá)，而苯乙酸對(duì)細(xì)菌的毒害比較明顯。為提高菌株的表達(dá)量，人們將基因工程技術(shù)和大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，使得原來(lái)無(wú)法獲得的許多天然蛋白能夠大量生產(chǎn)。目前，眾多研究者多選用大腸桿菌作為宿主菌，其原因是大腸桿菌結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳學(xué)背景清晰、生長(zhǎng)周期短、生長(zhǎng)條件清楚，已被廣泛應(yīng)用于重組蛋白，以及非蛋白的生物分子，如氨基酸等的生產(chǎn)。
[0007]如，楊志建等將糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；笜?gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pKKFPGA，pKKFPGA再轉(zhuǎn)化宿主菌DH5 α，所得重組菌不需誘導(dǎo)便能高效表達(dá)青霉素G?；?，表達(dá)量達(dá)2590u/L，比野生型糞產(chǎn)堿桿菌表達(dá)量高432倍。(楊志建，蔡謹(jǐn)，孫健，袁中一，生物工程學(xué)報(bào)，2004
(5), 736-740)。由于酶活偏低，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
[0008]任立華以產(chǎn)生青霉素G?；傅拇竽c工程菌株LRN075為研究對(duì)象，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件與不同比例的培養(yǎng)基成分，使得菌株在培養(yǎng)36h酶活最高達(dá)到22800u/L(任立華，青霉素G酰化酶工程菌培養(yǎng)條件的研究，齊魯藥事，2010(11)，651-654)。該酶主要應(yīng)用在水解頭孢菌素G到7-氨基脫乙酰頭孢烷酸(7-ADCA)，酶活為水解活性，未涉及合成活性。
[0009]黃艷紅等從巨大芽孢桿菌CA4098的基因組中，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增青霉素酰化酶基因，克隆到PKK223-3質(zhì)粒中，在E.coli HBlOl中得到表達(dá)，每克菌體(濕重)酶活為61.8u(黃艷紅，張穎，儲(chǔ)瑞藹，吳祥甫，王應(yīng)睞，袁中一，巨大芽孢桿菌的青霉素酰化酶基因在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1998 (2)，107-113)。
[0010]除此之外，β -內(nèi)酰胺類抗生素合成酶生產(chǎn)的另一個(gè)關(guān)鍵因素是酶的分離純化與固定化過(guò)程，這個(gè)過(guò)程的第一步是細(xì)胞破碎。正如大多數(shù)情況大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)，外源蛋白質(zhì)表達(dá)后被輸送到周質(zhì)空間再進(jìn)行修飾后成為一個(gè)全功能的酶，青霉素?；竿瑯釉诒磉_(dá)后存在于大腸桿菌的周質(zhì)空間，因此需要利用選擇性破壞細(xì)胞的方法得到目的蛋白酶。
[0011]進(jìn)行細(xì)胞破碎有多種方法可以選擇，如超聲波破碎法、滲透壓沖擊法、有機(jī)溶劑法、高壓均質(zhì)機(jī)法、溶菌酶法等。采用滲透壓沖擊法提取大腸桿菌青霉素?；?，得到了高比活的粗酶液(武金霞，張賀迎，青霉素酰化酶的分離和純化，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜質(zhì)，2002, 33
(4)，161-163);德萊昂等在報(bào)告了使用各種有機(jī)溶劑從大腸桿菌中提取青霉素G酰化酶(德萊昂、加西亞等，生物化學(xué)過(guò)程，39:301-305，2003)，并能夠提升蛋白的產(chǎn)量和純度；據(jù)報(bào)道酵素生物技術(shù)有限公司(印度)用SDS配合氯紡使用可以較好的對(duì)大腸桿菌(BL21CCM7394)進(jìn)行破壁提取表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)5小時(shí)處理提取物收率可達(dá)到111%(專利CN 101802212 B)。目前工業(yè)上常用的主要有高壓均質(zhì)機(jī)法、溶菌酶法及超聲波破碎法，高壓均質(zhì)機(jī)法相對(duì)簡(jiǎn)單，但對(duì)設(shè)備及操作條件要求較高，相`對(duì)耗能；采用超聲破碎法全破碎細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)容物全部釋放，加之超聲波產(chǎn)生大量熱能易使酶失活，得到的粗酶液比活很低，這就需要加入更多的純化步驟，使得收率很低。
[0012]進(jìn)行細(xì)胞破碎后，需要對(duì)細(xì)胞破碎物進(jìn)行固液分離、抽提、純化、固定化等處理，其核心問(wèn)題是高效固定化青霉素?；傅闹苽浼夹g(shù)，而載體材料的選擇與固定化的方法是固定化技術(shù)的關(guān)鍵所在。從載體材料的選擇上看，與無(wú)機(jī)材料相比，有機(jī)載體易成型結(jié)合酶量高。高分子載體材料鍵合酶蛋白能力強(qiáng)；從固定化方法上看，包埋法工藝簡(jiǎn)便條件溫和，酶活回收高，共價(jià)結(jié)合法酶分子與載體共價(jià)結(jié)合牢固，穩(wěn)定性良好，適宜重復(fù)使用。
[0013]共價(jià)結(jié)合型載體有主要有氨基型和環(huán)氧型兩種。環(huán)氧基具有很高的反應(yīng)活性和可塑性，載體上的環(huán)氧基可直接與酶分子上的-NH2, -SH等非活性基團(tuán)反應(yīng)進(jìn)行共價(jià)固定，也可以通過(guò)乙二胺、戊二醛等雙官能團(tuán)化合物作為交聯(lián)劑進(jìn)行連接。固定化可提高酶的重復(fù)使用率和催化穩(wěn)定性，共價(jià)固定法通過(guò)偶聯(lián)劑使酶蛋白與載體功能基團(tuán)高密度連接，但酶活通常與連接數(shù)成反比，連接量過(guò)多會(huì)降低酶蛋白的彈性，影響活性和穩(wěn)定性。
[0014]以上，雖然人們通過(guò)基因工程和大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)獲得了高表達(dá)量的各種工程菌，但是所產(chǎn)酶卻由于活性偏低或合成活性較弱等原因，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。另外，在固定化酶尤其是對(duì)于特定的固定化酶，人們一直在探索如何才能既保證一定的固定化的連接數(shù)，又保證酶活的收率保持在比較高的水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的目的是通過(guò)構(gòu)建重組菌株——轉(zhuǎn)化體BL21 (DE3) /PET28-ASPGA，并通過(guò)菌株的發(fā)酵、細(xì)胞破碎、分離純化、脫色、固定化，從而得到能夠用于工業(yè)生產(chǎn)的新型β_內(nèi)酰胺類抗生素合成酶固定化酶成品。
[0016]本發(fā)明的目的是按如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種新型內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法，它包括如下步驟，
[0017]a)根據(jù)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列反向設(shè)計(jì)出核苷酸序列，并進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；將SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列進(jìn)行全基因合成后構(gòu)建重組載體，然后將所述重組載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，得到重組菌株；
[0018]b)將所得重組菌株進(jìn)行發(fā)酵，然后依次經(jīng)細(xì)胞破碎、分離、純化、脫色后，得到用于固定化的酶液；
[0019]c)在所得酶液中加入磷酸鹽溶解使其終濃度為0.4M，并調(diào)整酶液的PH為6.0~
8.0，然后加入到活化好的環(huán)氧基型載體中，在25°C、150rpm條件下攪拌固定化24h，然后真空抽濾收集濾餅；
[0020]d)所得濾餅用去離子水沖洗干凈，加入到濃度I~2M、PH5.8~9.0的賴氨酸溶液中反應(yīng)24h,即得固定化酶。
[0021]本發(fā)明所述的新型β -內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法，
`[0022]b)步所述的細(xì)胞破碎具體是:發(fā)酵完畢后，在所得發(fā)酵液中按體積比加入0.1~0.5%的表面活性劑，然后加熱至40~60°C、攪拌處理30min，得濁液；所述表面活性劑選自Triton χ-100 或 CTAB ；
[0023]b)步所述的分離具體是:所得濁液中按質(zhì)量體積比加入I~5%的磷酸氫二鉀，然后用氯化鈣溶液調(diào)節(jié)PH至4.0~6.0，然后按質(zhì)量體積比再加入2~8%的助濾劑，真空抽濾，得清液；
[0024]b)步所述的純化及脫色具體是:向所得清液中加入磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)PH至6.0~
7.0以上，然后過(guò)濾收集濾液，向所得濾液中加入固體硫酸銨攪拌溶液，鹽析產(chǎn)生沉淀，然后過(guò)濾收集濾餅；將所得濾餅用所述清液1/4~1/2體積的去離子水溶解，然后真空過(guò)濾，收集濾液，調(diào)節(jié)濾液的PH至7.0~9.0，然后加入活性炭脫色，再過(guò)濾分離出活性炭，收集得到酶液。
[0025]本發(fā)明所述的新型β -內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法，b)步所述發(fā)酵，在該發(fā)酵4~12h時(shí)添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，所述IPTG的濃度為0.01mM~0.1mM。
[0026]本發(fā)明所述的新型β -內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法，b)步所述的細(xì)胞破碎是在所得發(fā)酵液中按體積比加入0.1~0.2%的Triton χ-100。
[0027]本發(fā)明所述的新型β -內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法，c)步所用氯化鈣溶液為飽和溶液。
[0028]本發(fā)明所述的新型β -內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法，c)步所述磷酸鹽為磷
酸二氫鉀或磷酸氫二鉀。
[0029]本發(fā)明所述步驟a)中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列是按如下的方案獲得的:[0030]根據(jù)Genebank提供的無(wú)色桿菌屬CCM4824青霉素酰化酶的氨基酸序列(SEQ IDNO:l,Genebank:AY919310.1)，在該序列中引入3個(gè)突變位點(diǎn)(將330位的苯丙氨酸替換為丙氨酸、將415位的賴氨酸替換為精氨酸、將770位的亮氨酸替換為苯丙氨酸)，得到如SEQID NO:2所示氨基酸序列。
[0031]本發(fā)明所述步驟a)中SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列具體是按如下的技術(shù)方案獲得的: [0032]根據(jù)SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列，使用在線設(shè)計(jì)工具Jcat反向設(shè)計(jì)出核苷酸序列，然后根據(jù)宿主大腸桿菌內(nèi)基因高效表達(dá)所需的優(yōu)選密碼子和G+C堿基含量，對(duì)設(shè)計(jì)出的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的核苷酸序列(如SEQ ID顯:3所示)與無(wú)色桿菌屬0114824青霉素?；傅暮塑账嵝蛄?如SEQ ID N0:4所示)相比，SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列中稀有密碼子的數(shù)量從55個(gè)降低到了 2個(gè)，G+C堿基含量從68.75%下降到了 57.25% ;同時(shí)SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列去除了原有序列中間的BamHI酶切位點(diǎn)。
[0033]本發(fā)明所述步驟a)中重組載體的構(gòu)建具體是按如下的技術(shù)方案進(jìn)行的:
[0034]I)將SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列進(jìn)行全基因合成，獲得ASPGA基因；
[0035]2)將PET28質(zhì)粒和所述ASPGA基因分別使用BamH I和Hind III雙酶切體系進(jìn)行酶切，分別得到ASPGA基因片段和PET28質(zhì)粒片段；
[0036]3)使用T4連接酶對(duì)ASPGA基因片段和PET28質(zhì)粒片段進(jìn)行連接，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主菌中，然后涂布到LB培養(yǎng)抗性平板，然后挑取生長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆接種到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒即得到所構(gòu)建的重組載體——表達(dá)載體PET28-ASPGA。
[0037]本發(fā)明步驟a)所述重組菌株具體是按如下的技術(shù)方案獲得的:
[0038]在E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入所述重組載體混勻，然后經(jīng)過(guò)冷卻、熱激、冷卻、復(fù)蘇等步驟，完成轉(zhuǎn)化，吸取轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布加有卡那霉素抗生素的平板，倒置培養(yǎng)，生長(zhǎng)出的菌株即為重組菌株——轉(zhuǎn)化體BL21(DE3) / PET28-ASPGA。
[0039]按本發(fā)明方法所構(gòu)建的重組菌株以及利用該菌株進(jìn)行發(fā)酵，并進(jìn)一步按本發(fā)明的方法生產(chǎn)的內(nèi)酰胺類抗生素合成酶固定化酶，具有較高的酶活及較好的穩(wěn)定性，并能夠多次重復(fù)利用，數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的固定化酶在重復(fù)使用10批次之后，合成酶活保持穩(wěn)定，底物轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定，未見(jiàn)明顯衰減，證明本發(fā)明固定化酶具有很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1是Bradford法蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0041]以下實(shí)施例1~3給出了本發(fā)明特定工程菌——轉(zhuǎn)化體BL21 (DE3) /PET28-ASPGA的構(gòu)建過(guò)程。
[0042]實(shí)施例1:基因設(shè)計(jì)及基因合成
[0043](I)基因設(shè)計(jì):
[0044](1.1)根據(jù)Genebank中無(wú)色桿菌屬CCM4824青霉素?；赴被嵝蛄?SEQ IDNO:1，Genebank:AY919310.1 )，將其第330位苯丙氨酸替換為丙氨酸，第415位賴氨酸替換為精氨酸，第770位亮氨酸替換為苯丙氨酸，這些位點(diǎn)引入突變位點(diǎn)，得到如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，然后利用在線設(shè)計(jì)工具Jcat (http://www.jcat.de/)反向設(shè)計(jì)出引入突變位點(diǎn)后的核苷酸序列；
[0045](1.2)根據(jù)宿主大腸桿菌基因表達(dá)所需的優(yōu)選密碼子和基因高效表達(dá)所需的G +C堿基含量,優(yōu)化上述反向設(shè)計(jì)出的核苷酸序列,優(yōu)化后的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，該序列與無(wú)色桿菌屬CCM4824青霉素酰化酶核苷酸序列(如SEQ ID NO: 4所示)相比:①大腸桿菌稀有密碼子從55個(gè)降低到了 2個(gè)；②G + C堿基含量由68.75%下降到57.25%;③優(yōu)化設(shè)計(jì)過(guò)程中去除了序列中間出現(xiàn)的BamH I酶切位點(diǎn)，有利后期基因操作。通過(guò)上述優(yōu)化設(shè)計(jì)后，有利于宿主菌大腸桿菌聞效表達(dá)該基因。
[0046](2)基因合成:根據(jù)SEQ ID NO:3所示基因序列進(jìn)行全基因合成(由生工生物工程(上海)有限公司完成)，獲得ASPGA基因。
[0047]實(shí)施例2:表達(dá)載體PET28-ASPGA (即重組載體)的構(gòu)建
[0048](I)對(duì)實(shí)施例1獲得的ASPGA基因使用BamH I和Hind III雙酶切，酶切體系如下:
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種新型β-內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法，其特征是它包括如下步驟， a)根據(jù)SEQID NO:2所示的氨基酸序列反向設(shè)計(jì)出核苷酸序列，并進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；將SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列進(jìn)行全基因合成后構(gòu)建重組載體，然后將所述重組載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，得到重組菌株； b)將所得重組菌株進(jìn)行發(fā)酵，然后依次經(jīng)細(xì)胞破碎、分離、純化、脫色后，得到用于固定化的酶液； c)在所得酶液中加入磷酸鹽溶解使其終濃度為0.4M，并調(diào)整酶液的PH為6.0-8.0，然后加入到活化好的環(huán)氧基型載體中，在25°C、150rpm條件下攪拌固定化24h，然后真空抽濾收集濾餅； d)所得濾餅用去離子水沖洗干凈,加入到濃度2M、PH5.8^9.0的賴氨酸溶液中反應(yīng)24h，即得固定化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法，其特征是， b)步所述的細(xì)胞破碎具體是:發(fā)酵完畢后，在所得發(fā)酵液中按體積比加入0.1~0.5%的表面活性劑，然后加熱至4(T6(TC、攪拌處理30min，得濁液；所述表面活性劑選自Tritonx-100 或 CTAB ； b)步所述的分離具體是:所得濁液中按質(zhì)量體積比加入f 5%的磷酸氫二鉀，然后用氯化鈣溶液調(diào)節(jié)PH至4.0-6.0，然后按質(zhì)量體積比再加入2~8%的助濾劑，真空抽濾，得清液； b)步所述的純化及脫色具體是:向所得清液中加入磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)PH至6.0-7.0以上，然后過(guò)濾收集濾液，向所得濾液中加入固體硫酸銨攪拌溶液，鹽析產(chǎn)生沉淀，然后過(guò)濾收集濾餅；將所得濾餅用所述清液1/1~1/2體積的去離子水溶解，然后真空過(guò)濾，收集濾液，調(diào)節(jié)濾液的PH至7.(T9.0，然后加入活性炭脫色，再過(guò)濾分離出活性炭，收集得到酶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的新型β-內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法，其特征是，b)步所述發(fā)酵，在該發(fā)酵4~12h時(shí)添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，所述IPTG的濃度為0.01mlT0.1mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型β-內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法，其特征是，b)步所述的細(xì)胞破碎是在所得發(fā)酵液中按體積比加入0.1 "0.2%的Triton x_100。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型β-內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的生產(chǎn)方法，其特征是，c)步所用氯化鈣溶液為飽和溶液。
【文檔編號(hào)】C12N9/84GK103695405SQ201310557791
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】劉力強(qiáng), 石晨光, 范俊輝, 王召業(yè), 王歡, 武芳, 賈娟娟, 牛昆, 呂娜, 楊麗萍, 邸勝苗, 劉 東 申請(qǐng)人:華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司