一種丹參素的生物生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種丹參素的生物生產(chǎn)方法，對羥基苯丙酮酸在對羥基苯乙酸間位羥基化酶的催化下合成3，4-二羥基苯丙酮酸，隨后在D-乳酸脫氫酶的催化下合成丹參素；或者對羥基苯丙酮酸現(xiàn)在D-乳酸脫氫酶的催化下合成對羥基苯乳酸，然后在經(jīng)過對羥基苯乙酸間位羥基化酶的催化，合成丹參素。本發(fā)明使用基因工程谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌，進行發(fā)酵生產(chǎn)丹參素，不需底物添加即可合成丹參素，實現(xiàn)了丹參素的從頭合成，可解決丹參素的來源問題，同時最大限度的降低了生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種丹參素的生物生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明所屬生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種丹參素的生產(chǎn)方法，特別是丹參素的生物生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丹參素(SalvianicacidA, Danshensu),屬于酸性芳香類化合物，其化學(xué)名為β-(3，4-二羥基苯基)乳酸，也稱丹參素甲，分子式為C9HltlO5，分子量為198.17。其多為棕黃色粉末或黃色粉末，純品為白色長針狀結(jié)晶，熔點84~86°C，密度1.546。最近的藥理藥效研究表明，丹參素可抑制血小板合成、聚集及釋放TXA2等縮血管物質(zhì)，提高心肌耐缺氧能力，保護心肌，增加冠脈流量。這些藥理作用是丹參注射液治療冠心病、心肌缺血的主要機制。因此丹參素在心腦血管疾病方面具有非常好的功能，如:抗血栓形成，抗動脈粥樣硬化及降血脂，擴張冠狀動脈，保護心肌線粒體免受氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化物的損傷等作用。同時一些研究也發(fā)現(xiàn)其在抗菌消炎及增強機體免疫，防止創(chuàng)面的過度愈合，治療肝損傷，抗腦缺血損傷，素抗腫瘤，治療銀屑病等方面也有較好的作用。如天士力集團出品的復(fù)方丹參滴丸的主要有效成分之一就是丹參素。因此，丹參素擁有廣闊的市場市場和前景。丹參素屬于酸性芳香類化合物，是丹參水溶提取物的主要活性成分之一。到目前為止，從植物丹參中提取仍是生產(chǎn)丹參素的最主要的方法。我國目前是丹參素植物提取物的主要生產(chǎn)國家。傳統(tǒng)的提取方法為水提醇沉，這也是目前制作注射液及口服液的主要提取方法。但不足之處是乙醇濃度過高，使原植物中的主要活性丹參素等酚性成分損失較大，含量不穩(wěn)定。近年來出現(xiàn)了一些新的提取技術(shù)，如酶提法、CO2超臨界萃取法、微波萃取法、超聲萃取法等等。但仍然不能解決植物提取法面臨的根本問題，如植物原料受限和質(zhì)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)能力低、種植受到季節(jié)和地理位置的限制等等。雖然已有化學(xué)全合成丹參素的報道，但步驟復(fù)雜，產(chǎn)率低，環(huán)境污染嚴重。近年來，隨著合成生物學(xué)技術(shù)的不斷進步，使用重組微生物生產(chǎn)丹參素成為備受關(guān)注的方法。但目前為止還沒有任何文獻報道利用重組微生物合成丹參素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的技術(shù)目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，首次設(shè)計并構(gòu)建了丹參素的生物合成途徑，并成功突破了丹參素重組微生物合成的瓶頸，提供了一種全新的丹參素的生物生產(chǎn)方法，通過構(gòu)建重組工程菌株，實現(xiàn)丹參素的從葡萄糖或者其他生物質(zhì)能源為起始的生物合成，使生產(chǎn)成本最低化。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn):
[0005]一種丹參素的生物生產(chǎn)方法，按照下述步驟進行:
[0006]步驟1，設(shè)計·并優(yōu)化對羥基苯乙酸間位羥基化酶(hpaB，hpaC)的基因序列，并全合成所述目標基因；
[0007]在所述步驟I中，依據(jù)大腸桿菌BL21 (DE3)菌株的對羥基苯乙酸間位羥基化酶(hpaB, hpaC)基因序列，設(shè)計引物并克隆,所述對羥基苯乙酸間位羥基化酶(hpaB, hpaC)的基因序列如序列表SEQ ID N0.1所不
[0008]步驟2，設(shè)計并優(yōu)化D-乳酸脫氫酶(D-LCH)的基因序列，并全合成所述目標基因，并經(jīng)過位點突變，獲得D-乳酸脫氫酶基因序列的突變基因序列D-LCH (Y52V)和D-LCH(Y52A)；
[0009]在所述步驟2 中，以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) ATCC14917 的 D-乳酸脫氫酶(D-LCH)基因序列作為參考，設(shè)計PCR引物，以植物乳桿菌CICC21419的基因組為模板進行PCR反應(yīng)，并克隆；所述D-乳酸脫氫酶(D-LCH)的基因序列如序列表SEQ IDN0.4所示，其對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列中第52位氨基酸為酪氨酸(Y，Tyr);所述D-LCH (Y52V)的DNA序列如序列表SEQ ID N0.7所不,其對應(yīng)的蛋白序列如序列表SEQID N0.8所不，與序列表SEQ IDN0.4編碼的蛋白質(zhì)相比，在第52位氨基酸突變?yōu)槔i氨酸(Val)，表示為突變基因序列D-LCH (Y52V)；D-LCH (Y52A)的DNA序列如序列表SEQ IDN0.9所示，其對應(yīng)的蛋白序列如序列表SEQ ID N0.10所示，與序列表SEQ ID N0.4編碼的蛋白質(zhì)相比，在第52位氨基酸突變?yōu)楸彼?Ala)，表示為突變基因序列D-LCH (Y52A)。 [0010]步驟3，設(shè)計并優(yōu)化T7RNA聚合酶基因序列，并全合成所述目標基因；
[0011]在所述步驟3中，以大腸桿菌BL21 (DE3)基因組序列中的T7RNA聚合酶序列為參考，設(shè)計PCR引物，以大腸桿菌BL21 (DE3)基因組為模板進行PCR反應(yīng)，得到T7RNA聚合酶基因以及其前面包含LacUV5啟動子和IacI基因在內(nèi)的一部分序列，并將其克?。?，所述T7RNA聚合酶基因序列如序列表SEQ ID N0.15所示，RNA聚合酶蛋白序列如序列表SEQ IDN0.16所示，并以此序列構(gòu)建表達載體。
[0012]步驟4，將獲得的對羥基苯乙酸間位羥基化酶基因序列SEQ ID N0.1、T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15，與D-乳酸脫氫酶基因序列SEQ ID N0.4、突變基因序列D-LCH(Y52V) SEQ ID N0.7、或者突變基因序列D-LCH (Y52A) SEQ ID N0.9之一的序列進行配合構(gòu)建表達載體，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌或者嵌入大腸桿菌基因組
[0013]在所述步驟4中，選擇將對羥基苯乙酸間位羥基化酶基因序列SEQ ID N0.1分別與D-乳酸脫氫酶基因序列SEQ ID N0.4、突變基因序列D-LCH(Y52V)SEQ ID N0.7、突變基因序列 D-LCH(Y52A)SEQ ID N0.9 構(gòu)建重組質(zhì)粒(例如 pCDF-hpaBC-D-LCH、pCDF-hpaBC-D_LCH(Y52V)、pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A))，將上述重組質(zhì)粒分別與利用T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15構(gòu)建的輔助質(zhì)粒(例如pECXK99E_T7)轉(zhuǎn)染大腸桿菌；所述大腸桿菌菌種名稱為SyBE-002447，建議的分類命名為大腸埃希氏菌Escherichiacoli，現(xiàn)于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號為CGMCCN0.7962，保藏時間為2013年7月22日，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101。
[0014]在所述步驟4的轉(zhuǎn)染大腸桿菌過程中，以對羥基苯乙酸間位羥基化酶基因序列SEQ ID N0.1、T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15與突變基因序列D-LCH (Y52A) SEQ IDN0.9轉(zhuǎn)化高產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌(CGMCC N0.7962)得到的工程菌，取得相對較好的丹參素產(chǎn)量，將上述工程菌進行保藏，保藏信息如下:菌種名稱為SyBE-002444，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.7961，建議的分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，現(xiàn)于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏時間為2013年7月22日，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101。
[0015]在所述步驟4中，將對羥基苯乙酸間位羥基化酶基因序列SEQ ID N0.1、突變基因序列D-LCH(Y52A)SEQ IDN0.9嵌入高產(chǎn)酪氨酸大腸桿菌(CGMCC N0.7962)基因組中，選擇將GAP啟動子、RBS、hpaBC基因(對羥基苯乙酸間位羥基化酶基因序列SEQ ID N0.1)，D-LCH基因(突變基因序列D-LCH (Y52A) SEQ ID N0.9)和氯霉素基因序列SEQ ID N0.19利用重疊延伸方法構(gòu)造GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH的串聯(lián)片段，用λ - Red同源重組方法，將該串聯(lián)片段插入到高產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌(CGMCC N0.7962)基因組ybhB和ybhC基因中間，經(jīng)PCR和測序篩選得到正確菌株。
[0016]步驟5，利用步驟4得到的工程菌進行發(fā)酵生產(chǎn)丹參素；
[0017]在所述步驟5中，選擇添加前體物對羥基苯丙酮酸和誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。
[0018]本發(fā)明設(shè)計的丹參素的生物合成途徑屬于莽草酸途徑，詳細的合成途徑如下:以葡萄糖/甘油或者其他生物質(zhì)為碳源，經(jīng)莽草酸途徑合成對羥基苯丙酮酸。以芒草酸為底物合成丹參素有兩條途徑。一.對羥基苯丙酮酸在對羥基苯乙酸間位羥基化酶(hpaB, hpaC)的催化下合成3，4-二羥基苯丙酮酸，隨后在D-乳酸脫氫酶(D-LCH)的催化下合成丹參素；二.對羥基苯丙酮酸現(xiàn)在D-乳酸脫氫酶(D-LCH)的催化下合成對羥基苯乳酸，然后在經(jīng)過對羥基苯乙酸間位羥基化酶(hpaB，hpaC)的催化，合成丹參素。兩條途徑雖然合成的中間產(chǎn)物不一樣，但實際上起催化作用的酶是一樣的。本發(fā)明提供了一種用生物發(fā)酵生產(chǎn)丹參素的方法，使用基因工程谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌，進行發(fā)酵生產(chǎn)丹參素，不需底物添加即可合成丹參素，實現(xiàn)了丹參素的從頭合成。本發(fā)明可以解決丹參素的來源問題，同時最大限度的降低了生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明使用的丹參素生物合成路線，其中I為TyrA，2為D-LCH，3為hpaB&C。圖2是本發(fā)明P⑶F-hpaBC-D-LCH質(zhì)粒構(gòu)建過程。
[0020]圖3是本發(fā)明產(chǎn)物驗證的HPLC圖譜，其中標準品為丹參素標準品(lg/L);對照為未加IPTG誘導(dǎo)基因基因表達；野生型為D-LCH基因未突變的表達載體；1為Y52V，即D-LCH(Y52V)突變的表達載體；2為Y52A，即D-LCH (Y52A)突變的表達載體。
[0021]圖4是構(gòu)建工程菌株發(fā)酵檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。各個使用質(zhì)粒具體信息如下:質(zhì)粒pJETl.2購自北京全式金生物技術(shù)有限公司(北京市海淀區(qū)西小口路66號中關(guān)村東升科技園B-3號樓四層)；質(zhì)粒pCDFDuet-l、pECXK99E、pKD46、pKD3和pcp20購自北京中原公司(北京市朝陽區(qū)東方東路11號)。
[0023]實施例1高產(chǎn)L-酪氨酸菌株的篩選
[0024]以與日本交換所獲得的大腸桿菌BW25113(由日本國家遺傳研究所在2009年2月通過贈送或交換獲得，提供者聯(lián)系方式為矢田1111，三島，靜網(wǎng)縣411-8540，日本)為出發(fā)菌株，在LB培養(yǎng)基(10g/lNaCl，10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物)中進行(紫外)誘變培養(yǎng)，并分離出候選菌株，進行發(fā)酵檢測L-酪氨酸產(chǎn)量。
[0025]將50uL保存的候選菌株轉(zhuǎn)接至含有5mLpH=7.0的LB培養(yǎng)基(并加入相應(yīng)的抗生素:氨芐青霉素100ug/ml)的試管中，37°C，220rmp培養(yǎng)12h，后將500ul的過夜培養(yǎng)候選菌株轉(zhuǎn)接至含有50mlpH=7.0的LB培養(yǎng)基(并加入相應(yīng)的抗生素:氨芐青霉素100ug/ml)的250mL搖瓶中，370C，220rmp培養(yǎng)。當0D0.6-0.8時，加入終濃度為0.5mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3h。后將菌液離心，并重新懸浮于MOPS培養(yǎng)基(5g/l葡萄糖，lg/Ι酵母提取物，K2HPO40.3g/1，NH4Cl:2.54g/l, MgCl2:0.05g/l, K2SO4:0.05g/l, FeSO4:0.0015g/l, CaCl2:0.05g/l,NaCl:3g/l, MOPS:9.24g/l，甘氨酸:0.3g/l)中，IPTG (IPTG:異丙基-β _D_ 硫代吡喃半乳糖苷，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司購買，地址:北京市昌平區(qū)北七家鎮(zhèn)北順工業(yè)園區(qū)東沙384號)濃度為0.5mM,發(fā)酵24h后檢測酪氨酸產(chǎn)量。
[0026]發(fā)酵結(jié)束后，取ImL發(fā)酵液12000r/min離心5min，取上清，用0.22um的水系微孔濾膜過濾后進行HPLC檢測。色譜條件如下:色譜柱:C18 (4.6X 250mm);流動相為20%甲醇-80%水-0.1%甲酸；流速為lmL/min ;進樣量20ul ;紫外檢測器，檢測波長為281nm。最終獲得702.7mg/l的酪氨酸，即高產(chǎn)酪氨酸菌株，建議的分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli,現(xiàn)于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,菌種名稱為SyBE-002447，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.7962，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101。
[0027]實施例2對羥基苯乙酸間位羥基化酶(hpaB, hpaC)序列獲得和p⑶F_hpaBC的構(gòu)建依據(jù)大腸桿菌BL21 (DE3)菌株的對羥基苯乙酸間位羥基化酶(hpaB，hpaC)基因序列，設(shè)計引物，并克隆(即由大腸桿菌BL21 (DE3)菌株提供對羥基苯乙酸間位羥基化酶的基因序列)。由于對羥基苯乙酸間位羥基化酶功能的實現(xiàn)需要hpaB和hpaC兩個基因共同完成，在BL21(DE3)基因組中， hpaB和hpaC基因是相鄰的，故克隆時是一起克隆下來并表達的。所述大腸桿菌BL21 (DE3)由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供，北京市海淀區(qū)西小口路66號中關(guān)村東升科技園B-3號樓四層。對羥基苯乙酸間位羥基化酶(hpaB，hpaC)的基因序列如序列表SEQ ID N0.1所示。設(shè)計引物如下:
[0028]hpaBC-U(up)，如序列表 SEQ ID N0.2 所示:CGCGGATCCGATGAAACCAGAAGATTTCCGCG(下劃線部分為BamHI酶切位點)；hpaBC_D (down),如序列表SEQ ID N0.3所示:CCCAAGCTTAAATCGCAGCTTCCATTTCC (下劃線部分為 HindIII 酶切位點)
[0029]使用FASTpfu 酶進行 PCR，PCR 反應(yīng)條件為:95°C，5min，I 個循環(huán)；95°C，30s，57°C，30s，72°C，lmin30s，共 30 個循環(huán);72°C，5min，I 個循環(huán);4°C保存。PCR 得至Ij 2000bp 左右的目標片段。將得到的PCR產(chǎn)物進行純化后用BamHI和HindII酶進行酶切；連接到同樣用BamHI和HindII進行酶切的p⑶FDuet-1載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒p⑶F_hpaBC載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)(需要說明的是此處僅僅用于驗證基因的表達，故可使用的大腸桿菌為一般市售的大腸桿菌即可)。37°C復(fù)蘇完成后涂布鏈霉素抗性LB平板，37°C培養(yǎng)12小時。然后以引物hpaBC-U (up,上段引物)和hpaBC-D (down,下段引物)進行菌落PCR驗證，篩選陽性克隆，并將驗證得到的陽性克隆株進行測序驗證。
[0030]實施例3D-乳酸脫氫酶(D-LCH)序列獲得以及p⑶F-hpaBC-D_LCH表達載體的構(gòu)
建
[0031]以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ATCC14917 的 D-LCH 基因序列作為參考，設(shè)計PCR引物，以植物乳桿菌CICC21419 (在中國普通微生物菌種保藏管理中心購買，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)的基因組為模板進行PCR反應(yīng)，并克隆至pJETl.2載體上，送交測序。然后連接的以構(gòu)建好的P⑶F-hpaBC載體上，最終獲得的一個表達質(zhì)粒P⑶F-hpaBC-D-LCH。經(jīng)測序得到的D-LCH基因序列如序列表SEQIDN0.4所示，設(shè)計引物如下:
[0032]D-LCH-U (up)，如序列表 SEQ ID N0.5 所示:GGGAATTCCATATGAAAATTATTGCCTATGCTGTAC (下劃線部分為NdeI酶切位點)；D-LCH-D (down)，如序列表SEQ ID N0.6所示:CGGGGTACCCAGTGATAATCGAGATTAGTCAAACT (下劃線部分為 KpnI 酶切位點)
[0033]使用FASTpfu 酶進行 PCR，PCR 反應(yīng)條件為:95°C，5min，I 個循環(huán)；95°C，30s，58°C，30s，72°C，45s，共30個循環(huán)；72°C，5min, I個循環(huán)；4°C保存?？傻玫?000bp左右片段。將得到的PCR產(chǎn)物進行純化后，按照pJETl.2克隆試劑盒說明，將PCR片段連接到pJETl.2質(zhì)粒上得到PJETl.2-D-LCH，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)。37°C復(fù)蘇完成后涂布氨芐青霉素抗性LB平板，37°C培養(yǎng)12小時。然后以引物D-LCH-U (up，上段引物)和D-LCH-D (down，下段引物)進行菌落PCR驗證，篩選陽性克隆。并將驗證得到的陽性克隆株進行測序驗證。提取測序正確PJET1.2-D-LCH質(zhì)粒，用Kpn I和Nde I酶進行酶切，回收D-LCH基因片段，連接到同樣用Kpn I和Nde I酶切的pCDF_hpaBC質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDF-hpaBC-D-LCH，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)。37°C復(fù)蘇完成后涂布鏈霉素抗性LB平板，37°C培養(yǎng)12小時。然后以引物D-LCH-U和D-LCH-D進行菌落PCR驗證，篩選陽性克隆。并將驗證得到的陽性克隆株進行測序驗證。
[0034] 實施例4D-LCH基因的突變和表達載體pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52V)和pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A)的構(gòu)建
[0035]依據(jù)測序獲得的植物乳桿菌CICC21419 (在中國普通微生物菌種保藏管理中心購買，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)的D-LCH的序列設(shè)計突變引物，利用重疊延伸PCR技術(shù)，獲得催化活性和底物專一性都得到提高的D-LCH (Y52V)和D-LCH (Y52A)突變基因。然后利用實施例2中類似的方法連接到pCDF-hpaBC上，獲得CDF-hpaBC-D_LCH (Y52V)和P⑶F-hpaBC-D-LCH (Y52A)表達載體。上述實施例3中的D-LCH基因序列如序列表SEQ IDN0.4所示，其對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列中第52位氨基酸為酪氨酸(Y，Tyr) ;D_LCH (Y52V)的DNA序列如序列表SEQ ID N0.7所不,其對應(yīng)的蛋白序列如序列表SEQIDN0.8所不，與上述實施例3的D-LCH基因序列SEQ ID N0.4對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列相比，在第52位氨基酸突變?yōu)槔i氨酸(Val )，表示為Y52V ；D-LCH (Y52A)的DNA序列如序列表SEQ ID N0.9所示，其對應(yīng)的蛋白序列如序列表SEQ ID N0.10所示，與上述實施例3的D-LCH基因序列SEQ ID N0.4對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列相比，在第52位氨基酸突變?yōu)楸彼?Ala)，表示為Y52A。設(shè)計引物如下:
[0036]D-LCH-U (up)，如序列表 SEQ ID N0.5 所示:GGGAATTCCATATGAAAATTATTGCCTATGCTGTAC (下劃線部分為NdeI酶切位點)；D-LCH-D (down)，如序列表SEQ ID N0.6所示:CGGGGTACCCAGTGATAATCGAGATTAGTCAAACT (下劃線部分為 KpnI 酶切位點)；Y52V_D (down),如序列表 SEQ ID N0.11 所示:TTGTTGGACTACATCGGCACCGTCGAAG ;Y52V_U (up),如序列表 SEQ ID N0.12 所示:TgCCgATgTAgTCCAACAAAAggAC ;Y52A-D (down)，如序列表 SEQ IDN0.13 所示:TTGTTGGGCTACATCGGCACCGTCGAAG ;Y52A_U (up)，如序列表 SEQ ID N0.14 所示:TgCCgATgTAgCCCAACAAAAggAC[0037]以Y52A 的點突變?yōu)槔?使用 FASTpfu 酶進行 PCR，以 D_LCH_U、Y52A-D 和 Y52A-U、D-LCH-D兩對引物分別進行PCR反應(yīng)，以P⑶F-hpaBC-D-LCH質(zhì)粒為模板。由于反應(yīng)條件相差不大，故一起做PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為:95°C，5min，l個循環(huán)；95°C，40s，58°C，30s，72°C，45s，共 30 個循環(huán);72°C，5min，l 個循環(huán);4°C保存。PCR 得到一個 200bp 和一個 800bp左右的片段。將此PCR產(chǎn)物回收后，以這兩個片段為模板，以D-LCH-U和D-LCH-D引物進行第二輪重疊延伸PCR，應(yīng)條件如上。反應(yīng)結(jié)束后將得到一個1000bp左右的條帶。將此條帶回收后，按照實施例2中類似的方法連接到pCDF-hpaBC上，篩選陽性克隆病測序驗證。最終獲得 pO)F-hpaBC-D-LCH (Y52V)和 pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A)兩個表達載體。
[0038]實施例5驗證hpaBC基因、D-LCH基因、D-LCH (Y52V)基因、D_LCH(Y52A)基因功能
[0039]將實施例3 和 4 中獲得 pCDF-hpaBC-D-LCH、pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52V)和pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A)三個表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。然后從轉(zhuǎn)化的平板中挑取單菌落到5mlLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。然后將將100 μ L過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接進入含有50mlLB培養(yǎng)基(加入相應(yīng)的鏈霉素抗生素50ug/ml)的250ml搖瓶中，37°C，220rpm培養(yǎng)。當菌體0D600長至0.6-0.8時，加入終濃度為0.5mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3h，然后將菌液離心，并重新懸浮于50mLM9培養(yǎng)基(M9培養(yǎng)基配方=Na2HPO4.12H20:17.lg/1 ；KH2PO4:3g/I ；NaCl:0.5g/l ；NH4Cl:lg/l ；lmol/lMgS04:2mL ；20% 葡萄糖:20mL ；lmol/lCaCl2:0.1mL)中，并補充500mg/L的前體物-對羥基苯丙酮酸和0.5mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)24_48h至發(fā)酵結(jié)束。同時有一瓶菌株，只加終濃度為500mg/L的對羥基苯丙酮酸而兩個發(fā)酵階段都不加0.5mM的IPTG作為對照。
[0040]發(fā)酵結(jié)束后，取ImL發(fā)酵液12000r/min離心3分鐘，取上清，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾后進行HPLC檢測。色譜條件如下:色譜柱:C18 (4.6X250mm);流動相為20%甲醇-80%水-0.1%甲酸；流速lmL/min ;進樣量20 μ L ;柱溫室溫；紫外檢測器，檢測波長281nm。依據(jù)液相的檢測結(jié)果，通過和標準品保留時間的對照，確認合成的產(chǎn)物為丹參素，并通過峰面積的計算,最終確認產(chǎn)量為259mg/l (如附圖3所示)。
[0041]實施例6輔助質(zhì)粒的構(gòu)造
[0042]以大腸桿菌BL21 (DE3)基因組序列中的T7RNA聚合酶序列為參考，設(shè)計PCR引物，以大腸桿菌BL21 (DE3)基因組為模板進行PCR反應(yīng)，得到T7RNA聚合酶基因以及其前面包含LacUV5啟動子和IacI基因在內(nèi)的一部分序列，并將其克隆至pJETl.2載體上，送交測序，然后連接到PECXK99E載體上，最終獲得一個表達質(zhì)粒pECXK99E-T7RNApol。測序獲得LacUV5-lac1-T7RNApol的序列如序列表SEQ ID N0.15所示，RNA聚合酶蛋白序列如序列表SEQ ID N0.16所示。設(shè)計引物如下:T7_U (up)，如序列表SEQ ID N0.17所示:CCGGAATTCTCACTCATTAGGCACCCC (下劃線部分為 EcoRI 酶切位點)；T7_D (down)，如序列表SEQ ID N0.18 所示:GCAAAACTGCAGTGGCGGAGAAACCATMTTGCA (下劃線部分為 PstI 酶切位點)
[0043]使用FASTpfu 酶進行 PCR，PCR 反應(yīng)條件為:95°C，5min，I 個循環(huán)；95°C，30s，55°C，30s，72°C，95s，共30個循環(huán);72°C，5min，I個循環(huán);4°C保存?？傻玫?000bp左右片段。將得到的PCR產(chǎn)物進行純化后，按照pJETl.2克隆試劑盒說明，將PCR片段連接到pJETl.2質(zhì)粒上得到pJETl.2-T7，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)。37°C復(fù)蘇完成后涂布氨芐青霉素抗性LB平板，37°C培養(yǎng)1·2小時。然后以引物T7-U和T7-D進行菌落PCR驗證，篩選陽性克隆。并將驗證得到的陽性克隆株進行測序驗證。提取測序正確PJET1.2-T7質(zhì)粒，用EcoRI和PstI酶進行酶切，回收T7基因片段，連接到同樣用EcoRI和PstI酶切的pECXK99E質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒PECXK99E-T7，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)。37°C復(fù)蘇完成后涂布卡納抗性LB平板，37°C培養(yǎng)12小時。然后以引物T7-U和T7-D進行菌落PCR驗證，篩選陽性克隆。并將驗證得到的陽性克隆株進行測序驗證。
[0044]實施例7生物質(zhì)碳源直接發(fā)酵法合成丹參素
[0045]分別將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCDF-hpaBC-D-LCH、pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52V)、pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A)和實施例6構(gòu)建的輔助質(zhì)粒pECXK99E_T7 (提供T7RNA聚合酶)電擊轉(zhuǎn)化進入高產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌菌株中(CGMCC N0.7962，詳見實施例1)，得到三種工程菌。將轉(zhuǎn)化的單菌落挑至5mlLB培養(yǎng)基(加入相應(yīng)的抗生素:硫酸鏈霉素50ug/ml ;氨芐青霉素100ug/ml ;硫酸卡納霉素50ug/ml)中，37°C、220rmp過夜培養(yǎng)。后將100 μ L過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接進入含有50mlLB培養(yǎng)基(加入相應(yīng)的抗生素:硫酸鏈霉素50ug/ml ;氨芐青霉素100ug/ml ;硫酸卡納霉素50ug/ml)的250ml搖瓶中，37°C，220rpm培養(yǎng)。當菌體0D600長至0.6-0.8時，加入終濃度0.5mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，后將菌液離心重新懸浮于MOPS培養(yǎng)基中，并加入終濃度為0.5mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)24_48h至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后按照實施例5中的檢測條件測量不同發(fā)酵時間丹參素合成的產(chǎn)量，HPLC檢測結(jié)果分析表明，所構(gòu)建的工程菌，可以高效的利用生物質(zhì)碳源，通過發(fā)酵合成丹參素，平均產(chǎn)量為6.9mg/l，其中以P⑶F-hpaBC-D-LCH (Y52A)和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化高產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌(CGMCC N0.7962)得到的工程菌，取得相對較好的丹參素產(chǎn)量，將上述工程菌進行保藏，保藏信息如下:菌種名稱為SyBE-002444，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.7961，建議的分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli,現(xiàn)于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101。
[0046]實施例8將hpaBC基因和D-LCH (Y52A)基因嵌入高產(chǎn)酪氨酸大腸桿菌(CGMCCN0.7962)基因組中并發(fā)酵檢測丹參素產(chǎn)量
[0047]按照文獻(LimCG, Fowler ZL, Hueller T, et al.High-yield resveratrolproductionin engineered Escherichia coli[J].Applied and Environmental Microbiology, 2011,77(10):3451-3460)中已報道的GAP啟動子的序列，大腸桿菌基因組序列以及測序的hpaBC和D-LCH基因序列設(shè)計引物，將GAP啟動子、RBS、hpaBC基因，D-LCH基因和氯霉素基因利用重疊延伸方法構(gòu)造GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH的串聯(lián)片段，用λ - Red同源重組方法，將該串聯(lián)片段插入到高產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌基因組ybhB和ybhC基因中間，經(jīng)PCR和測序篩選得到正確菌株后進行發(fā)酵檢測丹參素產(chǎn)量。使用的氯霉素基因序列如序列表SEQ ID N0.19所示，設(shè)計引物具體如下:GAP-U (up)，如序列表SEQ ID N0.20所示:GCGTAATGCTTAGGCACA ;GAP-D (down)，如序列表 SEQ ID N0.21 所示:TGTAATCCTCCTAAACCATGGTTCTGAATAAAAGGTTGCCTGTAA ;hpaBC_U，如序列表 SEQ ID N0.22 所示:CCATGGITTAGGAGGATTACAAAATGAAACCAGAAGATTTCC ;hpaBC_D，如序列表 SEQ ID N0.23 所示:TGTAATCCTCCTAAACCATGGTTAAATCGCAGCTTCCAT ;D-LCH_U，如序列表 SEQ ID N0.24 所示:CCATGGITTAGGAGGATTACAAAATGAAAATTATTGCCTAT ;D-LCH_D，如序列表 SEQ ID N0.25 所示:TACACAATCGCTCAAGACGTTTAGTCAAACTTAACTTGT ;C1_U， 如序列表 SEQ ID N0.26 所示:ACGTCTTGAGCGATTGTGTA ;C1_D，如序列表 SEQ ID N0.27 所示:GAATTAGCCATGGTCCATAT[0048]使用FASTpfu酶進行PCR，以GAP-U和GAP-D為引物，以大腸桿菌BL21(DE3)基因組為模板，進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為:95°C，5min，l個循環(huán)；95°C，40s，60°C，30s，72°C，45s，共30個循環(huán)；72°C，5min，l個循環(huán)；4°C保存，獲得150bp左右的片段。以hpaBC_U，hpaBC-D 和 D-LCH-U，D-LCH-D 為兩對引物，以 pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A)為模板，進行 PCR反應(yīng)，PCR 反應(yīng)條件為:95°C，5min, I 個循環(huán)；95°C，40s, 58°C，30s, 72°C，45s，共 30 個循環(huán)；72°C，5min，I個循環(huán)；4°C保存，由兩對引物分別得到2000bp和1000bp左右的片段，將PCR所獲得的三個片段進行PCR純化回收，后以上述150bp左右的片段和2000bp左右的片段為模板，以GAP-U和hpaBC-D為引物，進行重疊延伸PCR，PCR條件為:PCR反應(yīng)條件同上，得到2200bp左右的片段，將此片段進行PCR回收，以此片段和上述1000左右的片段為模板，以GAP-U和D-LCH-D為引物，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如上，獲得3200左右片段，將產(chǎn)物進行PCR回收，按照pJETl.2克隆質(zhì)粒試劑盒說明書進行連接，將PCR片段連接到pJETl.2質(zhì)粒上得到 PJETl.2-GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態(tài)。37°C復(fù)蘇完成后涂布氨芐青霉素抗性LB平板，37°C培養(yǎng)12小時。然后以引物D-LCH-U和D-LCH-D進行菌落PCR驗證，篩選陽性克隆。并將驗證得到的陽性克隆株進行測序驗證，結(jié)果為之前所設(shè)計的序列。
[0049]以pJETL 2-GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH 質(zhì)粒為模板，以 GAP-U 和 D-LCH-D 為引物，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為950C，5min, I個循環(huán)；95°C，40s, 58°C，30s, 72°C，45s，共30個循環(huán)；72°C，5min, I 個循環(huán)；4°C保存，獲得 GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH 片段。以 Cl-U 和 Cl-D為引物，以PKD3質(zhì)粒為模板，進行PCR反應(yīng)，克隆氯霉素抗性加基因，反應(yīng)條件如下:95°C，5min，l 個循環(huán)；95°C，40s，55°C，30s，72°C，45s，共 30 個循環(huán);72°C，5min，I 個循環(huán);4°C保存，獲得1000bp左右片段，進行PCR產(chǎn)物回收。以此片段和GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH片段為模板，以Cl-U和D-LCH-D為引物，進行重疊延伸PCR，獲得4200bp左右的片段，將產(chǎn)物進行PCR回收。
[0050]挑取含有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌(CGMCC N0.7962)于5mlLB培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)。取IOOul過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于含有50mlLB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，同時添加終濃度為50ug/ml的氨芐青霉素，30°C，220rpm培養(yǎng)。當菌體培養(yǎng)至0D600在0.1-0.2之間時，加入終濃度為IOOmM的L-阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑，繼續(xù)培養(yǎng)至0D600約為0.6，制備電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。取5ul制備的插入片段，電擊轉(zhuǎn)化進入制備的待電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，2.5KV，5-6ms, 37攝氏度復(fù)蘇。復(fù)蘇完成后涂布氯霉素抗性的LB的平板,過夜培養(yǎng)。第二天用Y-Up和Y-Down為引物，進行菌落PCR驗證，挑選出陽性克隆，同時以原始菌株作為對照。驗證PCR 反應(yīng)條件為:95°C，5min，l 個循環(huán)；95°C，30s，53°C，30s，72°C，lmin30s，共 30 個循環(huán)；72°C，5min，l個循環(huán)；4°C保存。將得到的PCR產(chǎn)物進行測序驗證，以確?；虿迦氤晒?。將50uL測序正確的插入菌株保存的甘油菌(甘油菌保存方法為600uL甘油和600uL菌液混合，放置-20度進行長期保藏)接入5mLLB培養(yǎng)基(加入相應(yīng)抗生素氨芐青霉素:100ug/ml)中，370C，220rmp培養(yǎng)12h。后將500ul菌液轉(zhuǎn)接至含有15mL的MOPS培養(yǎng)基中(含有5g/l葡萄糖，lg/Ι酵母提取物，并加入相應(yīng)的抗生素:100ug/ml)，37°C，220rmp,當OD=0.6-0.8時，加入IPTG，每隔12h補充一次葡萄糖至5g/l，發(fā)酵48h后按照實施例5中的檢測條件檢測丹參素產(chǎn)量，通過HPLC檢測，最終檢測得到7.5g/l丹參素。
[0051]以上對本發(fā)明做了示例性的描述，應(yīng)該說明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費創(chuàng)造性勞動的等同替換均落入本發(fā)明的保護范 圍。
【權(quán)利要求】
1.一種丹參素的生物生產(chǎn)方法，其特征在于，按照下述步驟進行: 步驟1，設(shè)計并優(yōu)化對羥基苯乙酸間位羥基化酶的基因序列，并全合成所述目標基因；所述對羥基苯乙酸間位羥基化酶的基因序列如序列表SEQ ID N0.1所示； 步驟2，設(shè)計并優(yōu)化D-乳酸脫氫酶(D-LCH)的基因序列，并全合成所述目標基因，并經(jīng)過位點突變，獲得D-乳酸脫氫酶基因序列的突變基因序列D-LCH (Y52V)和D-LCH (Y52A)；所述D-乳酸脫氫酶(D-LCH)的基因序列如序列表SEQ ID N0.4所示，其對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列中第52位氨基酸為酪氨酸；所述D-乳酸脫氫酶基因序列的突變基因序列D-LCH (Y52V)如序列表SEQ ID N0.7所不，其對應(yīng)的蛋白序列如序列表SEQ ID N0.8所不，與序列表SEQ IDN0.4編碼的蛋白質(zhì)相比，在第52位氨基酸突變?yōu)槔i氨酸；所述D-乳酸脫氫酶基因序列的突變基因序列D-LCH (Y52A)如序列表SEQ ID N0.9所示，其對應(yīng)的蛋白序列如序列表SEQID N0.10所示，與序列表SEQ ID N0.4編碼的蛋白質(zhì)相比，在第52位氨基酸突變?yōu)楸彼幔? 步驟3，設(shè)計并優(yōu)化T7RNA聚合酶基因序列，并全合成所述目標基因；所述T7RNA聚合酶基因序列如序列表SEQ ID N0.15所示，RNA聚合酶蛋白序列如序列表SEQ ID N0.16所示； 步驟4，將獲得的對羥基苯乙酸間位羥基化酶基因序列SEQ ID N0.1、T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15，與D-乳酸脫氫酶基因序列SEQ ID N0.4、D_乳酸脫氫酶基因序列的突變基因序列D-LCH (Y52V)SEQ ID N0.7、或者D-乳酸脫氫酶基因序列的突變基因序列D-LCH (Y52A) SEQ ID N0.9之一的序列進行配合構(gòu)建表達載體，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌或者嵌入大腸桿菌基因組；所述大腸桿菌為高產(chǎn)酪氨酸大腸桿菌，菌種名稱為SyBE-002447，建議的分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli,現(xiàn)于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.7962 ； 步驟5，利用步驟4得到的工程菌進行發(fā)酵生產(chǎn)丹參素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參素的生物生產(chǎn)方法，其特征在于，在所述步驟I中，選用大腸桿菌BL21 (DE3)菌株的對`羥基苯乙酸間位羥基化酶基因序列，設(shè)計引物并克隆。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參素的生物生產(chǎn)方法，其特征在于，在所述步驟2中，以植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) ATCC14917的D-乳酸脫氫酶基因序列作為參考，設(shè)計PCR引物，以植物乳桿菌CICC21419的基因組為模板進行PCR反應(yīng)，并克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參素的生物生產(chǎn)方法，其特征在于，在所述步驟3中，以大腸桿菌BL2KDE3)基因組序列中的T7RNA聚合酶序列為參考，設(shè)計PCR引物，以大腸桿菌BL21 (DE3)基因組為模板進行PCR反應(yīng)，得到T7RNA聚合酶基因以及其前面包含LacUV5啟動子和IacI基因在內(nèi)的一部分序列，并將其克隆。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參素的生物生產(chǎn)方法，其特征在于，在所述步驟4中，選擇將對羥基苯乙酸間位羥基化酶基因序列SEQ ID N0.1分別與D-乳酸脫氫酶基因序列SEQ ID N0.4、D-乳酸脫氫酶基因序列的突變基因序列D-LCH (Y52V)SEQ ID N0.7、D_乳酸脫氫酶基因序列的突變基因序列D-LCH (Y52A) SEQ ID N0.9構(gòu)建重組質(zhì)粒，將上述重組質(zhì)粒分別與利用T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15構(gòu)建的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參素的生物生產(chǎn)方法，其特征在于，在所述步驟4中，將對羥基苯乙酸間位羥基化酶基因序列SEQ ID N0.1、突變基因序列D-LCH (Y52A) SEQID N0.9嵌入高產(chǎn)酪氨酸大腸桿菌(CGMCC N0.7962)基因組中，選擇將GAP啟動子、RBS、對羥基苯乙酸間位羥基化酶基因序列SEQ ID N0.1、D-乳酸脫氫酶基因序列的突變基因序列D-LCH (Y52A) SEQ ID N0.9和氯霉素基因序列SEQ ID N0.19利用重疊延伸方法構(gòu)造GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH的串聯(lián)片段，用λ - Red同源重組方法，將該串聯(lián)片段插入到高產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌(CGMCC N0.7962)基因組ybhB和ybhC基因中間，經(jīng)PCR和測序篩選得到正確菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種丹參素的生物生產(chǎn)方法，其特征在于，在所述步驟4的轉(zhuǎn)染大腸桿菌過程中，以對羥基苯乙酸間位羥基化酶基因序列SEQ ID N0.1、T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15與D-乳酸脫氫酶基因序列的突變基因序列D-LCH (Y52A) SEQ IDN0.9轉(zhuǎn)化高產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌(CGMCC N0.7962)得到的工程菌，取得相對較好的丹參素產(chǎn)量，將上述工程菌進行保藏，保藏信息如下:菌種名稱為SyBE-002444，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.7961，建議的分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參素的生物生產(chǎn)方法，其特征在于，在所述步驟5中，選擇添加前體物對羥基苯丙酮酸和誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷。
9.一種大腸桿菌菌種保藏登記號為CGMCC N0.7961，菌種名稱為SyBE-002444，建議的分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli。
10.如權(quán)利要求9所述的菌種在制備丹參素中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/19GK103667371SQ201310559498
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】趙廣榮, 姚元鋒, 趙瑩, 王長松 申請人:天津大學(xué)