經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了包含經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和/或經(jīng)代謝的細胞提取物的組合物和使用方法。經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和經(jīng)代謝的細胞提取物組合物可以與可接受的載體一起配制在可注射制劑或局部制劑中，例如，作為霜劑、洗劑或凝膠，且可以用于藥妝或藥物應(yīng)用。經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和經(jīng)代謝的細胞提取物還可以被進一步處理以濃縮或減少包含在經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基或經(jīng)代謝的細胞提取物內(nèi)的一種或多種要素或組分。生長培養(yǎng)基可以通過任何真核細胞來調(diào)節(jié)。經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和經(jīng)代謝的細胞提取物可以用于防止或治療病狀，例如皮膚病狀。
【專利說明】經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和使用方法
[0001]本申請是申請日為2011年11月11日，申請?zhí)枮?01180064131.0，發(fā)明名稱為“經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和使用方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]交叉引用
[0003]本申請要求2010年11月12日提交的美國臨時申請第61/413，166號的權(quán)益，通過引用以其整體并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0004]本公開內(nèi)容涉及包含經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和/或經(jīng)代謝的細胞提取物的組合物，和用于通過向受試者施用組合物防止或治療病狀例如皮膚病狀的方法。
[0005]發(fā)明背景
[0006]培養(yǎng)基組合物通常包含必需氨基酸、鹽、維生素、礦物質(zhì)、微量金屬、糖、脂質(zhì)和核苷。細胞培養(yǎng)基努力供應(yīng)滿足使細胞在控制的、人造的和體外的環(huán)境中生長所需要的營養(yǎng)需求必需的組分。營養(yǎng)素制劑、pH和同滲容摩根據(jù)參數(shù)例如細胞類型、細胞密度和采用的培養(yǎng)系統(tǒng)而改變。許多細胞培養(yǎng)基制劑在文獻中被證明，且許多培養(yǎng)基是商購的。一旦培養(yǎng)基用細胞溫育，其就被本領(lǐng)域技術(shù)人員稱為“廢的”或“經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基”。經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基包含培養(yǎng)基的許多原始組分，以及各種細胞代謝物和分泌的蛋白，分泌的蛋白包括，例如生長因子、炎性媒介物和其他胞外蛋白。
[0007]發(fā)明概述
[0008]在一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供包含經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和可接受的載體的組合物。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基是由酵母細胞代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在一些實施方案中，經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基通過在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以形成經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基來制備。在其他實施方案中，組合物是局部的或可注射的組合物。在一些實施方案中，組合物用于治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫發(fā)或后天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環(huán)境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發(fā)光度和均勻度下降；皮膚緊致度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內(nèi)在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發(fā)紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數(shù)量增加；或其組合。在一個實施方案中，組合物使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現(xiàn)；改善膚色、紋理和彈性；減 少粗糙度和光損傷；預(yù)防或減少環(huán)境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發(fā)亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊致度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊致或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態(tài)；增強自然唇色；增加唇量；促進手術(shù)后皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。在一個實施方案中，組合物減淡細紋和皺紋的外觀；減少老年斑和色素沉著異常的出現(xiàn)；改善皮膚紋理、膚色和彈性；減少粗糙度和光損傷；加強皮膚本身再生的能力；防止或減少環(huán)境損傷；使皮膚光滑和緊致；使老年斑變亮和減淡；減少細紋和粗紋以及皺紋；改善細的和粗的眼周皺紋的外觀；改善鼻唇溝的外觀；改善口周皺紋；改善面部細紋和粗紋；改善膚色、發(fā)光度和均勻度；改善皮膚緊致度；減少觸覺粗糙度；改善皮膚紋理、總的光損傷、總的色素沉著過多；整體改善；減淡黑斑和/或斑紋的外觀；改善皮膚亮度外觀和年輕外觀；改善皮膚的總病狀；改善光老化皮膚的外觀；改善內(nèi)在和外在老化的皮膚的外觀；改善皮膚細胞更新；改善皮膚屏障；改善皮膚保持水分的能力；減淡褐色和紅色斑點、發(fā)紅的外觀；增加皮膚表皮厚度；加強真皮表皮連接；減少孔尺寸和孔的出現(xiàn)；改善光滑度，或其組合。[0009]在某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種癥狀或病狀改善至少2倍。一種或多種癥狀或病狀的改善倍數(shù)包括但不限于，3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之間的任何數(shù)量。在某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致改善約1%至約100%、約10%至約90%、約20%至約80%、約30%至約70%、約40%至約60%、或約50%。在其他實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種癥狀或病狀改善約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 100%、約 125%、約 150% 或一種或多種癥狀或病狀改善更多。
[0010]在其他實施方案中，本公開內(nèi)容還提供包含經(jīng)代謝的細胞提取物和可接受的載體的組合物。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的細胞提取物是由酵母細胞代謝的細胞提取物。在一些實施方案中，細胞提取物源自動物細胞、皮膚細胞或成纖維細胞。在其他實施方案中，組合物是局部的或可注射的組合物。在一些實施方案中，組合物用于治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫發(fā)或后天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環(huán)境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發(fā)光度和均勻度下降；皮膚緊致度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內(nèi)在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發(fā)紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數(shù)量增加；或其組合。
[0011]在一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供通過包括以下的工藝制備的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基:(a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以形成經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和從經(jīng)培養(yǎng)的細胞除去經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；(b)培養(yǎng)酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露于經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；(d)培養(yǎng)酵母細胞以使經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的至少一部分代謝；和(e)收集經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。
[0012]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于制備經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的工藝，該工藝包括:(a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以形成經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和從經(jīng)培養(yǎng)的細胞除去經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；(b)培養(yǎng)酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露于經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；(d)培養(yǎng)酵母細胞以使經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的至少一部分代謝；和(e)收集經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。
[0013]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供包含經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和可接受的載體的組合物。在另一個實施方案中，公開內(nèi)容提供包含經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和可接受的載體的組合物，其中局部組合物用于治療或防止皮膚病狀。在一些實施方案中，組合物用于治療或防止皮膚病狀。在一些實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫發(fā)或后天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環(huán)境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發(fā)光度和均勻度下降；皮膚緊致度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內(nèi)在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發(fā)紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數(shù)量增加；或其組合。
[0014]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供包含經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和可接受的載體的組合物，其中局部組合物用于治療或防止皮膚病狀，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在，且經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基通過在足以滿足使酵母細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞以形成經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基來制備。
[0015]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于防止或治療受試者中的皮膚病狀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在一些實施方案中，組合物用于治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫發(fā)或后天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環(huán)境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發(fā)光度和均勻度下降；皮膚緊致度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年 輕外觀下降；光老化皮膚；內(nèi)在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發(fā)紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數(shù)量增加；或其組合。
[0016]在一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于治療脫發(fā)的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于刺激毛發(fā)生長的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于防止或治療受試者中的先天性缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于防止或治療受試者中的外觀缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在一個實施方案中，外觀缺陷的治療使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現(xiàn)；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預(yù)防或減少環(huán)境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發(fā)亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊致度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊致或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態(tài)；增強自然唇色；增加唇量；促進手術(shù)后皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于防止或治療受試者中的后天缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。所述方法可以使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；改善膚色、紋理和/或緊致度；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發(fā)亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；改善皮膚緊致度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊致或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態(tài)；增強自然唇色；增加唇量；促進手術(shù)后皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀；減淡細紋和皺紋的外觀；減少老年斑和色素沉著異常的出現(xiàn)；改善皮膚紋理、膚色和彈性；減少粗糙度和光損傷；加強皮膚本身再生的能力；防止或減少環(huán)境損傷；使皮膚光滑和緊致；使老年斑變亮和減淡；減少細紋和粗紋以及皺紋；改善細的和粗的眼周皺紋的外觀；改善鼻唇溝的外觀；改善口周皺紋；改善面部細紋和粗紋；改善膚色、發(fā)光度和均勻度；改善皮膚緊致度；減少觸覺粗糙度；改善皮膚紋理、總的光損傷、總的色素沉著過多；整體改善；減淡黑斑和/或斑紋的外觀；改善皮膚亮度外觀和年輕外觀；改善皮膚的總病狀；改善光老化皮膚的外觀；改善內(nèi)在和外在老化的皮膚的外觀；改善皮膚細胞更新；改善皮膚屏障；改善皮膚保持水分的能力；減淡褐色和紅色斑點、發(fā)紅的外觀；增加皮膚表皮厚度；加強真皮表皮連接；減少孔尺寸和孔的出現(xiàn)；改善光滑度，或其組合。
[0017]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于減淡細紋和皺紋的外觀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于減少老年斑和色素沉著異常的出現(xiàn)的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于改善皮膚紋理、膚色和彈性的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于減少粗糙度和光損傷的方法，該方法包括向受試者施 用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于加強皮膚本身再生的能力的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于防止或減少環(huán)境損傷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于使皮膚平滑和緊致的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于使老年斑變亮和減淡的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。
[0018]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供通過包括以下的工藝制備的經(jīng)代謝的細胞提取物:(a)提供細胞提取物；(b)培養(yǎng)酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露于細胞提取物；(d)培養(yǎng)酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和(e)收集經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的細胞提取物。
[0019]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于制備經(jīng)代謝的細胞提取物的工藝，該工藝包括:(a)提供細胞提取物；(b)培養(yǎng)酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露于細胞提取物；(d)培養(yǎng)酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和(e)收集經(jīng)代謝的細胞提取物。
[0020]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供包含經(jīng)代謝的細胞提取物和可接受的載體的組合物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供包含經(jīng)代謝的細胞提取物和可接受的載體的組合物，其中局部組合物用于治療或防止皮膚病狀。在一些實施方案中，組合物用于治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫發(fā)或后天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環(huán)境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發(fā)光度和均勻度下降；皮膚緊致度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內(nèi)在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發(fā)紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數(shù)量增加；或其組合。
[0021]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供包含經(jīng)代謝的細胞提取物和可接受的載體的組合物，其中局部組合物用于治療或防止皮膚病狀，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在，且經(jīng)代謝的細胞提取物是由酵母細胞代謝的細胞提取物。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫發(fā)或后天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環(huán)境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發(fā)光度和均勻度下降；皮膚緊致度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內(nèi)在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發(fā)紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數(shù)量增加；或其組合。在一個實施方案中，外觀缺陷的治療使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現(xiàn)；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預(yù)防或減少環(huán)境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發(fā)亮；加強皮膚本身再生 的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊致度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊致或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態(tài)；增強自然唇色；增加唇量；促進手術(shù)后皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。
[0022]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于防止或治療受試者中的皮膚病狀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于治療脫發(fā)的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于刺激毛發(fā)生長的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于防止或治療受試者中的先天性缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于防止或治療受試者中的外觀缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在一個實施方案中，外觀缺陷的治療使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現(xiàn)；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預(yù)防或減少環(huán)境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發(fā)亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊致度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊致或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態(tài)；增強自然唇色；增加唇量?’促進手術(shù)后皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于防止或治療受試者中的后天缺陷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。所述方法可以使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；改善膚色、紋理和/或緊致度；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發(fā)亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；改善皮膚緊致度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊致或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態(tài)；增強自然唇色；增加唇量；促進手術(shù)后皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，減淡細紋和皺紋的外觀；減少老年斑和色素沉著異常的出現(xiàn)；改善皮膚紋理、膚色和彈性；減少粗糙度和光損傷；加強皮膚本身再生的能力；防止或減少環(huán)境損傷；使皮膚光滑和緊致；使老年斑變亮和減淡；減少細紋和粗紋以及皺紋；改善細的和粗的眼周皺紋的外觀；改善鼻唇溝的外觀；改善口周皺紋；改善面部細紋和粗紋；改善膚色、發(fā)光度和均勻度；改善皮膚緊致度；減少觸覺粗糙度；改善皮膚紋理、總的光損傷、總的色素沉著過多；整體改善；減淡黑斑和/或斑紋的外觀；改善皮膚亮度外觀和年輕外觀；改善皮膚的總病狀；改善光老化皮膚的外觀；改善內(nèi)在和外在老化的皮膚的外觀；改善皮膚細胞更新；改善皮膚屏障；改善皮膚保持水分的能力；減淡褐色和紅色斑點、發(fā)紅的外觀；增加皮膚表皮厚度；加強真皮表皮連接；減少孔尺寸和孔的出現(xiàn)；改善光滑度，或其組合。
[0023]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于減淡細紋和皺紋的外觀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于減少老年斑和色素沉著異常的出現(xiàn)的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于改善皮膚紋理、膚色和彈性的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于減少粗糙度和光損傷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于加強皮膚本身再生的能力的方法，該`方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于防止或減少環(huán)境損傷的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于使皮膚平滑和緊致的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于使老年斑變亮和減淡的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的經(jīng)代謝的細胞提取物。
[0024]在一個實施方案中，還提供包含經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和可接受的載體的組合物，其中經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基是由酵母細胞代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在一個實施方案中，經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基通過在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以形成經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基來制備。在另一個實施方案中，組合物是可注射組合物或局部組合物。在又一個實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在另一個實施方案中，經(jīng)代謝的調(diào)節(jié)生長培養(yǎng)基被封裝在密封劑內(nèi)。在一個實施方案中，密封劑是脂質(zhì)體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。在一些實施方案中，組合物用于治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，組合物用于治療或防止細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環(huán)境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降?’老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發(fā)光度和均勻度下降；皮膚緊致度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內(nèi)在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發(fā)紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數(shù)量增加；或其組合。在其他實施方案中，組合物用于治療或防止外觀缺陷、先天性缺陷、脫發(fā)或后天缺陷。在一些實施方案中，外觀缺陷是眉間皺眉線、深鼻唇溝折痕、嘴邊地理皺紋(circum-oral geographical wrinkle)、雙頰凹陷或乳房發(fā)育不全。在其他實施方案中，外觀缺陷的治療使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現(xiàn)；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預(yù)防或減少環(huán)境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發(fā)亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊致度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊致或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態(tài)；增強自然唇色；增加唇量；促進手術(shù)后皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。在一些實施方案中，后天缺陷是創(chuàng)傷后、手術(shù)后或感染后發(fā)生的醫(yī)療病狀。在其他實施方案中，后天缺陷是醫(yī)療程序后缺陷。在其他實施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎縮、角化性病變、去核眼睛中眼球內(nèi)陷、面部痤瘡凹坑、線狀硬皮病皮下萎縮、鞍鼻畸形、龍貝格病或單側(cè)聲帶麻痹。
[0025]還提供了包含經(jīng)代謝的細胞提取物和可接受的載體的組合物，其中經(jīng)代謝的細胞提取物是由酵母細胞代謝的細胞提取物。在一些實施方案中，細胞提取物源自動物細胞。在其他實施方案中，細胞提取物源自皮膚細胞。在另一個實施方案中，細胞提取物源自成纖維細胞。在一些實施方案中，組合物是可注射組合物或局部組合物。在一些實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜 劑、水凝膠或洗劑。在其他實施方案中，經(jīng)代謝的調(diào)節(jié)生長培養(yǎng)基被封裝在密封劑內(nèi)。在一個實施方案中，密封劑是脂質(zhì)體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。在一些實施方案中，組合物用于治療或防止皮膚病狀。在其他實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫發(fā)或后天缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環(huán)境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發(fā)光度和均勻度下降；皮膚緊致度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內(nèi)在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發(fā)紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數(shù)量增加；或其組合。
[0026]在其他實施方案中，組合物用于治療或防止外觀缺陷、先天性缺陷、脫發(fā)或后天缺陷。在一些實施方案中，外觀缺陷是眉間皺眉線、深鼻唇溝折痕、嘴邊地理皺紋、雙頰凹陷或乳房發(fā)育不全。在一些實施方案中，外觀缺陷的治療使曬傷和老化皮膚復原；改善細紋和皺紋的外觀；促進細胞更新；減少老年斑和色素沉著異常的出現(xiàn)；改善膚色、紋理和彈性；減少粗糙度和光損傷；預(yù)防或減少環(huán)境損傷；使皮膚飽滿；使皮膚變亮；使皮膚發(fā)亮；加強皮膚本身再生的能力；改善老年斑的外觀；使老年斑變亮和減淡；改善皮膚緊致度、彈性、回彈性；使皮膚上的細紋光滑、緊致或填充；減淡眼睛下方黑眼圈的外觀；改善唇紋理或狀態(tài)；增強自然唇色；增加唇量；促進手術(shù)后皮膚的上皮形成；恢復皮膚的屏障或水分平衡；改善老年斑的外觀；改善皮膚色素沉著的外觀，或其組合。在一些實施方案中，后天缺陷是創(chuàng)傷后、手術(shù)后或感染后發(fā)生的醫(yī)療病狀。在其他實施方案中，后天缺陷是醫(yī)療程序后缺陷。在其他實施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎縮、角化性病變、去核眼睛中眼球內(nèi)陷、面部痤瘡凹坑、線狀硬皮病皮下萎縮、鞍鼻畸形、龍貝格病或單側(cè)聲帶麻痹。在其他實施方案中，組合物用于治療或防止細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環(huán)境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發(fā)光度和均勻度下降；皮膚緊致度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內(nèi)在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發(fā)紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數(shù)量增加；或其組合。
[0027]本文還提供通過包括以下的工藝制備的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基:
[0028](a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以形成經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和從經(jīng)培養(yǎng)的細胞除去經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；
[0029](b)培養(yǎng)酵母細胞；
[0030](C)將酵母細胞暴露于經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；
[0031](d)培養(yǎng)酵母細胞以使經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的至少一部分代謝；和
[0032](e)收集經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在一些實施方案中，在以上工藝中使用的酵母是畢赤酵母(Pichia genus)。在其他實施方案中,酵母是巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。在其他實施方案中，步驟(a)中的細胞是皮膚細胞。在其他實施方案中，步驟(a)中的細胞是成纖維細胞。在其他實施方案中，步驟(a)中的細胞是動物細胞。在其他實施方案中，制備經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的工藝還包括(e)處理經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基包括(a)或(b)的培養(yǎng)步驟中的連續(xù)流系統(tǒng)或生物反應(yīng)器系統(tǒng)。在其他實施方案中，細胞被懸浮或漂浮在生長培養(yǎng)基中。
[0033]本文提供了用于制備以上經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的工藝，該工藝包括:
[0034](a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以形成經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和從經(jīng)培養(yǎng)的細胞除去經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；
[0035](b)培養(yǎng)酵母細胞；
[0036](C)將酵母細胞暴露于經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；
[0037](d)培養(yǎng)酵母細胞以使經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的至少一部分代謝；和
[0038](e)收集經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在一個實施方案中，提供了包含經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和可接受的載體的組合物。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.0001%至約95%的量存在。在其他實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培 養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.01%至約10%的量存在。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約10%至約20%的量存在。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.01%、0.5%、
1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一個非限制性實例中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約10%、約15%、或約20%的量存在組合物中。在其他實施方案中，組合物還包括以下中的至少一種:水、表面活性劑、乳化劑、調(diào)節(jié)劑、潤膚劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、營養(yǎng)制品、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑劑、抗痤瘡組分、防曬劑和防腐劑。在一些實施方案中，組合物是可注射的組合物或局部組合物。在一個實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在其他實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基被封裝在密封劑內(nèi)。在一些實施方案中，密封劑是脂質(zhì)體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。
[0039]本文還提供了通過包括以下的工藝制備的經(jīng)代謝的細胞提取物:
[0040](a)提供細胞提取物；
[0041](b)培養(yǎng)酵母細胞；
[0042](c)將酵母細胞暴露于細胞提取物；
[0043](d)培養(yǎng)酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和
[0044](e)收集經(jīng)代謝的細胞提取物。在一些實施方案中，酵母是畢赤酵母屬。在其他實施方案中，酵母是巴斯德畢赤酵母。在其他實施方案中，細胞提取物源自皮膚細胞。在其他實施方案中，細胞提取物源自成纖維細胞。在其他實施方案中，細胞提取物源自動物細胞。在其他實施方案中，工藝還包括(e)處理經(jīng)代謝的細胞提取物，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在一個實施方案`中，培養(yǎng)包括連續(xù)流系統(tǒng)或生物反應(yīng)器系統(tǒng)。
[0045]在其他實施方案中，用于制備以上經(jīng)代謝的細胞提取物的工藝包括:
[0046](a)提供細胞提取物；
[0047](b)培養(yǎng)酵母細胞；
[0048](C)將酵母細胞暴露于細胞提取物；
[0049](d)培養(yǎng)酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和
[0050](e)收集經(jīng)代謝的細胞提取物。
[0051]本文還提供了包含以下的組合物:可接受的載體和通過包括以下的工藝制備的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基:
[0052](a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以形成經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和從經(jīng)培養(yǎng)的細胞除去經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；
[0053](b)培養(yǎng)酵母細胞；
[0054](C)將酵母細胞暴露于經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；
[0055](d)培養(yǎng)酵母細胞以使經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的至少一部分代謝；和
[0056](e)收集經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在一些實施方案中，酵母是畢赤酵母屬。在其他實施方案中，酵母是巴斯德畢赤酵母。在一些實施方案中，步驟(a)中的細胞是皮膚細胞。在其他實施方案中，步驟(a)中的細胞是成纖維細胞。在又一個實施方案中，步驟(a)中的細胞是動物細胞。在一些實施方案中，工藝還包括(e)處理經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在一些實施方案中，步驟(a)或(b)的培養(yǎng)包括連續(xù)流系統(tǒng)或生物反應(yīng)器系統(tǒng)。在其他實施方案中，細胞被懸浮或漂浮在生長培養(yǎng)基中。在其他實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.0001%至約95%的量存在。在其他實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在。在其他實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.01%至約10%的量存在。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約 0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一個非限制性實例中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約10%、約15%、或約20%的量存在組合物中。在其他實施方案中，組合物還包括以下中的至少一種:水、表面活性劑、乳化劑、調(diào)節(jié)劑、潤膚劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、營養(yǎng)制品、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑劑、抗痤瘡組分、防曬劑和防腐劑。在其他實施方案中，組合物是可注射的組合物或局部組合物。在其他實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基被封裝在密封劑內(nèi)。在一個實施方案中，密封劑是脂質(zhì)體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。
[0057]本文還提供了包含以下的組合物:可接受的載體和通過包括以下的工藝制備的經(jīng)代謝的細胞提取物:
[0058](a)提供細胞提取物；
[0059](b)培養(yǎng)酵母細胞；
[0060](c)將酵母細胞暴露于細胞提取物；
[0061](d)培養(yǎng)酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和
[0062](e)收集經(jīng)代謝的細胞提取物。在一些實施方案中，酵母是畢赤酵母屬。在其他實施方案中，酵母是巴斯德畢赤酵母。在其他實施方案中，細胞提取物源自皮膚細胞。在其他實施方案中，細胞提取物源自成纖維細胞。在其他實施方案中，細胞提取物源自動物細胞。在一個實施方案中，工藝還包括(e)處理經(jīng)代謝的細胞提取物，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在另一個實施方案中，培養(yǎng)包括連續(xù)流系統(tǒng)或生物反應(yīng)器系統(tǒng)。在其他實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.0001%至約95%的量存在。在又一個實施方案中，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在。在其他實施方案中，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%至約10%的量存在。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約10%至約20%的量存在。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 的量存在。在一個非限制性實例中，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約10%、約15%、或約20%的量存在組合物中。在一個實施方案中，組合物還包括以下中的至少一種:水、表面活性劑、乳化劑、調(diào)節(jié)劑、潤膚劑、臘、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、營養(yǎng)制品、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑劑、抗痤瘡組分、防曬劑和防腐劑。在其他實施方案中，組合物是可注射的組合物或局部組合物。在又一個實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在一個實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基被封裝在密封劑內(nèi)。在另一個實施方案中，密封劑是脂質(zhì)體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。
[0063]本文還提供了用于防止或治療受試者中的皮膚病狀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的包含以下的組合物:可接受的載體和通過包括以下的工藝制備的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基:
[0064](a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以形成經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和從經(jīng)培養(yǎng)的細胞除去經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；
[0065](b)培養(yǎng)酵母細胞；
[0066](C)將酵母細胞暴露于經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；
[0067](d)培養(yǎng)酵母細胞以使經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的至少一部分代謝；和
[0068](e)收集經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在一個實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷。在另一個實施方案中，病狀是脫發(fā)。在另一個實施方案中，病狀是先天性缺陷或后天缺陷。在一個實施方案中，后天缺陷是創(chuàng)傷后、手術(shù)后或感染后發(fā)生的醫(yī)療病狀。在另一個實施方案中，后天缺陷是醫(yī)療程序后缺陷。在又一個實施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎縮、角化性病變、去核眼睛中眼球內(nèi)陷、面部痤瘡凹坑、線狀硬皮病皮下萎縮、鞍鼻畸形、龍貝格病或單側(cè)聲帶麻痹。在一個實施方案中，外觀缺陷是眉間皺眉線、深鼻唇溝折痕、嘴邊地理皺紋、雙頰凹陷或乳房發(fā)育不全。在某些實施方案中，病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環(huán)境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發(fā)光度和均勻度下降；皮膚緊致度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內(nèi)在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發(fā)紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數(shù)量增加；或其組合。在某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種癥狀或病狀改善至少2倍。一種或多種癥狀或病狀的改善倍數(shù)包括但不限于3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之間的任何數(shù)量。在`某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致改善約1%至約100%、約10%至約90%、約20%至約80%、約30%至約70%、約40%至約60%、或約50%。在其他實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種癥狀或病狀改善約5%、約10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約100%、約125%、約150%或一種或多種癥狀或病狀改善更多。在一些實施方案中，酵母是畢赤酵母屬。在一些實施方案中，酵母是巴斯德畢赤酵母。在一個實施方案中，步驟(a)中的細胞是皮膚細胞。在另一個實施方案中，步驟(a)中的細胞是成纖維細胞。在一些實施方案中，步驟(a)中的細胞是動物細胞。在其他實施方案中，工藝還包括(e)處理經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在一個實施方案中，步驟(a)或(b)的培養(yǎng)包括連續(xù)流系統(tǒng)或生物反應(yīng)器系統(tǒng)。在另一個實施方案中，細胞被懸浮或漂浮在生長培養(yǎng)基中。在其他實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.0001%至約95%的量存在組合物中。在另一個實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在組合物中。在一個實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約0.01%至約10%的量存在組合物中。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約10%至約20%的量存在。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約 0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一個非限制性實例中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基以組合物的按重量計約10%、約15%、或約20%的量存在組合物中。在一些實施方案中，組合物還包括以下中的至少一種:水、表面活性劑、乳化劑、調(diào)節(jié)劑、潤膚劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、營養(yǎng)制品、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、甾族激素、去屑劑、抗痤瘡組分、防曬劑和防腐劑。在一個實施方案中，組合物是可注射的組合物或局部組合物。在另一個實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在一個實施方案中，經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基被封裝在密封劑內(nèi)。在一些實施方案中，密封劑是脂質(zhì)體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。在一些實施方案中，至少一種胞外基質(zhì)蛋白通過將組合物施用至受試者而上調(diào)。在一些實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白被上調(diào)約5%至約100%。在一個實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白被上調(diào)約10%至約50%。在另一個實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白被上調(diào)約60%至約100%。在又一個實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白被上調(diào)約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95% 或約 100%。在一個實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白是膠原蛋白或賴氨?；u化酶蛋白。在一些實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白被C0L4A1基因或PLODl基因編碼。在其他實施方案中，至少一種修復蛋白通過將組合物施用至受試者而上調(diào)。在一個實施方案中，修復蛋白被上調(diào)約10%至約70%。在另一個實施方案中，修復蛋白被上調(diào)約25%至約50%。在一些實施方案中，修復蛋白被上調(diào)約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%。在一個實施方案中，修復蛋白是纖連蛋白。在又一個實施方案中，修復蛋白被FNl基因編碼。在一些實施方案中，至少一種細胞連接蛋白通過將組合物施用至受試者而上調(diào)。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調(diào)約5%至約200%。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調(diào)約10%至約80%。在一些實施方案中，細胞連接蛋白被上調(diào)約30%至約50%。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調(diào)約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70 %、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 100%、約 110%、約 120%、約 130%、約140%、約150%、約160%、約170%、約180%、約190%或約200%。在其他實施方案中，細胞連接蛋白是內(nèi)披蛋白。在一些實施方案中，細胞連接蛋白被IVL基因編碼。在一個實施方案中，至少一種抗氧化蛋白通過將組合物施用至受試者而上調(diào)。在又一個實施方案中，抗氧化蛋白被上調(diào)約5%至約300%。在一些實施方案中，抗氧化蛋白被上調(diào)約10%至約50%。在其他實施方案中，抗氧化蛋白被上調(diào)約200%至約250%。在一些實施方案中，抗氧化蛋白被上調(diào)約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 100%、約 125%、約 150%、約 175%、約200%、約250%或約300%。在一個實施方案中，抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白。在另一個實施方案中，抗氧化蛋白被S0D2基因編碼。
[0069]本文還提供了用于防止或治療受試者中的皮膚病狀的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的包含以下的組合物:可接受的載體和通過包括以下的工藝制備的經(jīng)代謝的細胞提取物:[0070](a)提供細胞提取物；
[0071](b)培養(yǎng)酵母細胞；
[0072](c)將酵母細胞暴露于細胞提取物；
[0073](d)培養(yǎng)酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和
[0074](e)收集經(jīng)代謝的細胞提取物。
[0075]在一個實施方案中，病狀是外觀缺陷。在另一個實施方案中，病狀是脫發(fā)。在另一個實施方案中，病狀是先天性缺陷或后天缺陷。在一個實施方案中，后天缺陷是創(chuàng)傷后、手術(shù)后或感染后發(fā)生的醫(yī)療病狀。在另一個實施方案中，后天缺陷是醫(yī)療程序后缺陷。在又一個實施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎縮、角化性病變、去核眼睛中眼球內(nèi)陷、面部痤瘡凹坑、線狀硬皮病皮下萎縮、鞍鼻畸形、龍貝格病或單側(cè)聲帶麻痹。在一個實施方案中，外觀缺陷是眉間皺眉線、深鼻唇溝折痕、嘴邊地理皺紋、雙頰凹陷或乳房發(fā)育不全。在某些實施方案中，皮膚病狀是外觀缺陷、先天性缺陷、脫發(fā)或后天醫(yī)療缺陷。在另外的實施方案中，皮膚病狀是細紋和皺紋；老年斑和色素沉著異常；皮膚紋理、膚色和彈性下降；粗糙度和光損傷；皮膚本身再生的能力下降；環(huán)境損傷；皮膚光滑度和緊縮感下降；老年斑；細紋和粗紋以及皺紋；細的和粗的眼周皺紋；鼻唇溝；面部細紋和粗紋；皮膚發(fā)光度和均勻度下降；皮膚緊致度下降；色素沉著過多；黑斑和/或斑紋；皮膚亮度和年輕外觀下降；光老化皮膚；內(nèi)在和外在老化的皮膚；異常的皮膚細胞更新；皮膚屏障下降；皮膚保持水分的能力下降；褐色和紅色斑點；發(fā)紅；皮膚表皮厚度異常；真皮表皮連接減少；孔尺寸和孔數(shù)量增加；或其組合。在某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種癥狀或病狀改善至少2倍。一種或多種癥狀或病狀的改善倍數(shù)包括但不限于，3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之間的任何數(shù)量。在某些實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致改善約1%至約100%、約10%至約90%、約20%至約80%、約30%至約70%、約40%至約60%、或約50%。在其他實施方案中，施用本文描述的組合物可以導致一種或多種癥狀或病狀改善約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 100%、約 125%、約150%或一種或多種癥狀或病狀改善更多。在一些實施方案中，酵母是畢赤酵母屬。在一些實施方案中，酵母是巴斯德畢赤酵母。在一個實施方案中，步驟(a)中的細胞源自皮膚細胞。在另一個實施方案中，步驟(a)中的細胞源自成纖維細胞。在一些實施方案中，步驟(a)中的細胞源自動物細胞。在其他實施方案中，工藝還包括(e)處理經(jīng)代謝的細胞提取物，其中處理是濃縮、過濾、純化或其組合。在一個實施方案中，步驟(a)或(b)的培養(yǎng)包括連續(xù)流系統(tǒng)或生物反應(yīng)器系統(tǒng)。在另一個實施方案中，細胞被懸浮或漂浮在生長培養(yǎng)基中。在其他實施方案中，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.0001%至約95%的量存在組合物中。在另一個實施方案中，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%至約50%的量存在組合物中。在一個實施方案中，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約0.01%至約10%的量存在組合物中。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約10%至約20%的量存在。在一些實施方案中，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約 0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一個非限制性實例中，經(jīng)代謝的細胞提取物以組合物的按重量計約10%、約15%、或 約20%的量存在組合物中。在一些實施方案中，組合物還包括以下中的至少一種:水、表面活性劑、乳化劑、調(diào)節(jié)劑、潤膚劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、營養(yǎng)制品、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑劑、抗痤瘡組分、防曬劑和防腐劑。在一個實施方案中，組合物是可注射的組合物或局部組合物。在另一個實施方案中，局部組合物是軟膏劑、霜劑、水凝膠或洗劑。在一個實施方案中，經(jīng)代謝的細胞提取物被封裝在密封劑內(nèi)。在一些實施方案中，密封劑是脂質(zhì)體、泡囊、亞微米乳液、聚合物膠囊密封材料、凝膠、霜劑和洗劑中的至少一種。在一些實施方案中，至少一種胞外基質(zhì)蛋白通過將組合物施用至受試者而上調(diào)。在一些實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白被上調(diào)約5%至約100%。在一個實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白被上調(diào)約10%至約50%。在另一個實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白被上調(diào)約60%至約100%。在又一個實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白被上調(diào)約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%。在一個實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白是膠原蛋白或賴氨酰基羥化酶蛋白。在一些實施方案中，胞外基質(zhì)蛋白被C0L4A1基因或PLODl基因編碼。在其他實施方案中，至少一種修復蛋白通過將組合物施用至受試者而上調(diào)。在一個實施方案中，修復蛋白被上調(diào)約10%至約70%。在另一個實施方案中，修復蛋白被上調(diào)約25%至約50%。在一些實施方案中，修復蛋白被上調(diào)約5%、約10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%。在一個實施方案中，修復蛋白是纖連蛋白。在又一個實施方案中，修復蛋白被FNl基因編碼。在一些實施方案中，至少一種細胞連接蛋白通過將組合物施用至受試者而上調(diào)。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調(diào)約5%至約200%。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調(diào)約10%至約80%。在一些實施方案中，細胞連接蛋白被上調(diào)約30%至約50%。在一個實施方案中，細胞連接蛋白被上調(diào)約5%、約10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 100%、約 110%、約 120%、約 130%、約 140%、約 150%、約160%、約170%、約180%、約190%或約200%。在其他實施方案中，細胞連接蛋白是內(nèi)披蛋白。在一些實施方案中，細胞連接蛋白被IVL基因編碼。在一個實施方案中，至少一種抗氧化蛋白通過將組合物施用至受試者而上調(diào)。在又一個實施方案中，抗氧化蛋白被上調(diào)約5%至約300%。在一些實施方案中`，抗氧化蛋白被上調(diào)約10%至約50%。在其他實施方案中，抗氧化蛋白被上調(diào)約200%至約250%。在一些實施方案中，抗氧化蛋白被上調(diào)約5%、約10%、約15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 100%、約 125%、約 150%、約 175%、約 200%、約 250% 或約300%ο在一個實施方案中，抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白。在另一個實施方案中，抗氧化蛋白被S0D2基因編碼。
[0076]附圖簡述
[0077]圖1是表示由三維組織產(chǎn)品Transcyte?和DennagmiVf隨時間沉積的氨基葡聚
糖和膠原的沉積的動力學的圖表。氨基葡聚糖的沉積體積取決于生長時間，而膠原的沉積不取決于生長時間。
[0078]圖2是表示胞外基質(zhì)(從Transcyte?除去)和以1:2、1:5、1:10和1:100的稀釋度加入到人成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞的單層培養(yǎng)物的效果的圖表。所闡明的最顯著的效果是以基質(zhì)的1:10稀釋度。[0079]圖3是表示暴露于經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(先前已經(jīng)支持細胞在Transcyte?中生長的細胞培養(yǎng)基)的人成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞的相對增殖的圖表。在少至三天顯示細胞響應(yīng)的增加。
[0080]圖4是表明細皺紋和粗皺紋的研究員評估的圖表。在所有訪問中觀察到細皺紋和粗皺紋的平均分數(shù)的顯著下降(全部P〈0.0001)。在每一個數(shù)據(jù)組，在左邊示出細皺紋評估，且在右邊示出粗皺紋評估。
[0081]圖5是表明膚色、緊致度和發(fā)光度的研究員評估的圖表。在所有訪問中皮膚緊致度、膚色和發(fā)光度的平均分數(shù)顯著改善(全部P <0.02)。在每一個數(shù)據(jù)組，在左邊示出第4星期結(jié)果，在中間示出第8星期結(jié)果，且在右邊示出第12星期結(jié)果。
[0082]圖6是表明觸覺粗糙度的研究員評估的圖表。在所有訪問中皮膚緊致度、膚色和發(fā)光度的平均分數(shù)顯著改善(全部P〈0.0001)。分別在左手列示出第4星期的從基線的百分數(shù)變化，在中間列示出第8星期的從基線的百分數(shù)變化和在右手列示出第12星期的從基線的百分數(shù)變化。
[0083]圖7是提供來自實施例18中所描述的12星期臨床使用(組合的/組合產(chǎn)品)研究的受試者自我評估問卷的第12星期的結(jié)果的圖表。
[0084]發(fā)明詳述
[0085]本公開內(nèi)容涉及包含使用任何真核細胞類型或三維組織構(gòu)建體培養(yǎng)的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和/或經(jīng)代謝的細胞提取物的新的組合物、以及使用組合物的方法。以單層或以三維培養(yǎng)細胞。細胞優(yōu)選地是人且包括基質(zhì)細胞、實質(zhì)細胞、間充質(zhì)干細胞、肝儲備細胞、神經(jīng)干細胞、胰腺干細胞和/或胚胎干細胞。由細胞和組織培養(yǎng)物調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基將包含各種天然分泌的蛋白，例如生物學活性生長因子。還公開了包含源自經(jīng)調(diào)節(jié)的細胞培養(yǎng)基的產(chǎn)品的新的組合物和這些組合物的用途。
[0086]“預(yù)調(diào)節(jié)的”細胞培養(yǎng)基可`以是充分地解決正被培養(yǎng)的細胞的營養(yǎng)需求的任何細胞培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)基的實例包括(但不限于)達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、Ham’ sF12、RPMI1640、Iscove’ S、McCoy’s和本領(lǐng)域技術(shù)人員容易明白的其他培養(yǎng)基制劑，包括見于以下中的那些:Methods For Preparation of Media, Supplements and SubstrateFor Serum-Free Animal Cell Culture Alan R.Liss, New York(1984)和 Cell&TissueCulture: Laboratory Procedures, John ffiley&Sons Ltd., Chichester, Englandl996,兩者通過引用以其整體并入本文。培養(yǎng)基可以被補充有支持所需的細胞或組織培養(yǎng)物所需的任何組分。另外，如果需要的話，可以加入血清例如牛血清，其是白蛋白、球蛋白、生長促進劑和生長抑制劑的復合溶液。血清應(yīng)是不含病原體的且針對支原體細菌、真菌和病毒污染而被仔細地篩過。此外，血清應(yīng)通常從美國獲得而不是從本地牲畜攜帶可遞送的劑的國家獲得。激素加入到培養(yǎng)基中可能是期望的或可能不是期望的。培養(yǎng)基還可以是不含血清的，即，細胞在沒有血清補充物的情況下生長。
[0087]“經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基”可以是如本文所公開調(diào)節(jié)的任何生長培養(yǎng)基，且可以被制備，例如如在美國專利第6，372，494號；第7，118，746號；第7，160，726號中所公開的，它們?nèi)客ㄟ^引用以其整體并入本文。
[0088]其他成分例如維生素、生長和附著因子、蛋白等，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)他的或她的特定需要來選擇。在一些實施方案中，可以使用適合于實現(xiàn)所需的經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的任何細胞類型。基因工程細胞可以用于培養(yǎng)培養(yǎng)基。這樣的細胞可以被修飾，例如，以表達一種或多種所需的蛋白，使得一種或多種被表達的蛋白在培養(yǎng)基中的濃度被優(yōu)化用于特定的所需應(yīng)用。根據(jù)本公開內(nèi)容，用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的細胞和組織培養(yǎng)物可以被設(shè)計為表達目標基因產(chǎn)物，該目標基因產(chǎn)物可以給予各種各樣的功能，包括(但不限于)類似于生理反應(yīng)的表達蛋白的改善的性質(zhì)、可用于具體應(yīng)用的特定蛋白的增加的表達，例如創(chuàng)傷愈合或抑制某些蛋白例如蛋白酶、乳酸等。
[0089]細胞可以被設(shè)計成表達目標基因產(chǎn)物，目標基因產(chǎn)物是生物學活性的，提供所選擇的生物學功能，作為選擇的生理情況的報告基因，增加基因產(chǎn)物的缺乏的或有缺陷的表達，或提供抗病毒、抗菌、抗微生物或抗癌活性。根據(jù)本公開內(nèi)容，目標基因產(chǎn)物可以是肽或蛋白，例如酶、激素、細胞因子、抗原、或抗體、調(diào)節(jié)蛋白例如轉(zhuǎn)錄因子或DNA結(jié)合蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白例如細胞表面蛋白，或目標基因產(chǎn)物可以是核酸例如核糖體或反義分子。目標基因產(chǎn)物包括(但不限于)增強細胞生長的基因產(chǎn)物。例如，遺傳修飾可以上調(diào)內(nèi)源性蛋白，通過表達異種離子通道或改變內(nèi)源性離子通道功能而引入新的蛋白或調(diào)節(jié)離子濃度。實例包括(但不限于)基因組織，其表達被全身遞送的基因產(chǎn)物(例如，分泌的基因產(chǎn)物例如蛋白，包括生長因子、激素類、因子VII1、因子IX、神經(jīng)遞質(zhì)和腦啡肽)。
[0090]在一些實施方案中，使細胞根據(jù)技術(shù)人員已知的任何方法以二維單層生長。參見，例如，細胞培養(yǎng)技術(shù)，諸如在以下中描述的那些=Sambrook J等人(2000)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第三版)；Goeddel 編輯(1990)Methods inEnzymologyl85, Current Protocols In Molecular Biology ;F.M.Ausubel 等人編輯，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons, Inc.(1994，增訂直到 1999) ；Animal Cell Culture:A PracticalApproach (Freshney 編輯 1986)。
[0091]在一些實施方案中，細胞在三維基質(zhì)支撐物上生長并以多層生長，形成細胞基質(zhì)。該基質(zhì)系統(tǒng)比先前所描述的單層組織培養(yǎng)系統(tǒng)在更大的程度上接近體內(nèi)存在的生理狀態(tài)。三維培養(yǎng)物 例如 Dermagfaft⑩(Advanced Tissue Sciences, Inc.，LaJol la, CA) “ Dermagraft ⑩'，，和 TransCyte?(Smi th&Nephew, PLC, UnitedKingdom) “Transcyte?”，產(chǎn)生許多生長因子和以生理比率和濃度分泌到培養(yǎng)基中的其他蛋白。Dermagraft?.主要由在可生物降解的羥乙酸乳酸聚酯(polyglactin)上培養(yǎng)的異源新生成纖維細胞組成。TransCyte?是包括結(jié)合至過渡覆蓋物的三維基質(zhì)組織的臨時活的皮膚替換物，如美國專利5，460，939中所描述的。另外，調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)基的三維組織培養(yǎng)物可以包含許多組織類型中見到的間充質(zhì)干細胞、肝儲備細胞、神經(jīng)干細胞、胰腺干細胞、和/或胚胎干細胞和/或?qū)嵸|(zhì)細胞和/或?qū)嵸|(zhì)干細胞，組織類型包括(但不限于)骨髓、皮膚、肝、胰腺、腎、腎上腺和神經(jīng)組織，以及胃腸道和泌尿生殖道組織、和循環(huán)系統(tǒng)。參見美國專利第 4，721，096 號；第 4，963，489 號；第 5，032，508 號；第 5，266，480 號；第 5，160，490 號；和第5，559，022號，它們中的每一個通過引用以其整體并入本文。
[0092]1.定義
[0093]本文使用的以下術(shù)語將具有所指示的意思:
[0094]細胞:包括來自任何有機體的細胞,有機體包括動物、植物、真菌、原生生物或無核原蟲類。在一個實施方案中，細胞源是動物或植物。在另一個實施方案中，動物是哺乳動物。在另一個實施方案中，哺乳動物是人。
[0095]細胞提取物:包括可以或不可以包括細胞微粒物質(zhì)的溶解的或碎裂的細胞內(nèi)容物。
[0096]粘附層:直接附接至三維支撐物或通過附著于本身直接附接至支撐物的細胞而間接連接的細胞。
[0097]經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基:包含胞外蛋白和細胞代謝物的制劑，其先前已經(jīng)支持任何所需的真核細胞類型的生長，所述細胞已經(jīng)以二維或三維被培養(yǎng)。還稱為“經(jīng)調(diào)節(jié)的細胞培養(yǎng)基”或“經(jīng)調(diào)節(jié)的細胞和組織培養(yǎng)基”。
[0098]基質(zhì)細胞:具有或不具有疏松結(jié)締組織中存在的其他細胞和/或成分的成纖維細胞，包括(但不限于)內(nèi)皮細胞、周細胞、巨噬細胞、單核細胞、漿細胞、肥大細胞、脂肪細胞、間充質(zhì)干細胞、肝儲備細胞、神經(jīng)干細胞、胰腺干細胞、軟骨細胞、前軟骨細胞(prechondrocyte)等。
[0099]組織特有的或?qū)嵸|(zhì)細胞:形成器官的不同于其支持骨架的必需和區(qū)別的組織的細胞。
[0100]二維細胞培養(yǎng)物:以單層(例如)在平旦表面等上培養(yǎng)的細胞。
[0101]三維骨架:三維支架主要由任何材料和/或形狀組成，所述材料和/或形狀(a)允許細胞附接至其(或可以被修飾為允許細胞附接至其)；和(b)允許細胞以多于一層生長。該支撐物接種有基質(zhì)細胞以形成活的三維基質(zhì)組織。骨架的結(jié)構(gòu)可以包括網(wǎng)、海綿或可以由水凝膠形成。
[0102]三維基質(zhì)組織或活的基質(zhì)基質(zhì):已經(jīng)接種有在支撐物上生長的基質(zhì)細胞的三維骨架。由基質(zhì)細胞加工的胞外基質(zhì)蛋白沉積到骨架上，因此形成活的基質(zhì)組織?；畹幕|(zhì)組織可以支持稍后接種的組織特有的細胞的生長，以形成三維細胞培養(yǎng)物。
[0103]組織特有的三維細胞培養(yǎng)物或組織特有的三維構(gòu)建體:已經(jīng)接種有組織特有的細胞并被培養(yǎng)的三維活的基質(zhì)組織。一般而言，用于接種三維基質(zhì)的組織特有的細胞應(yīng)包括該組織的“干”細胞(或“儲備”細胞)；即，產(chǎn)生將成熟為形成組織實質(zhì)的特有細胞的新細胞的那些細胞。
[0104]以下縮寫將具有所指示的意思:
[0105]BCS=小牛血清
[0106]BFU-E=紅系爆式形成單位
[0107]TGF-β =轉(zhuǎn)化生長因子-β
[0108]CFU-C=培養(yǎng)集落形成單位
[0109]CFU-GEMM=粒細胞、紅細胞、單核細胞、巨核細胞集落形成單位
[0110]CSF=集落刺激因子
[0111]DMEM=達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基
[0112]EDTA=乙二胺四乙酸
[0113]FBS=胎牛血清
[0114]FGF=成纖維細胞生長因子 [0115]GAG=葡胺聚糖
[0116]GM-CSF=粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子[0117]HBSS=漢克平衡鹽溶液
[0118]HS=馬血清
[0119]IGF=胰島素樣生長因子
[0120]LTBMC=長期骨髓培養(yǎng)
[0121]MEM=最低必需培養(yǎng)基
[0122]PBL=外周血白細胞
[0123]PBS=磷酸鹽緩沖鹽水
[0124]F1DGF=血小板衍生生長因子
[0125]RPMI1640=洛斯維帕克紀念研究所培養(yǎng)基編號1640 (GIBCO, Inc.，GrandIsland, N.Y.)
[0126]SEM=掃描電子顯微術(shù)
[0127]VEGF=血管內(nèi)皮生長因子
[0128]11.經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和經(jīng)代謝的細胞提取物
[0129]在一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供通過包括以下的工藝制備的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培 養(yǎng)基:(a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以形成經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和從經(jīng)培養(yǎng)的細胞除去經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；(b)培養(yǎng)酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露于經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基；(d)培養(yǎng)酵母細胞以使經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的至少一部分代謝；和(e)收集經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。在一些實施方案中，細胞可以源自植物和/或動物源，包括人。
[0130]在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供通過包括以下的工藝制備的經(jīng)代謝的細胞提取物:(a)提供細胞提取物；(b)培養(yǎng)酵母細胞；(C)將酵母細胞暴露于細胞提取物；(d)培養(yǎng)酵母細胞以使細胞提取物的至少一部分代謝；和(e)收集經(jīng)代謝的細胞提取物。在一些實施方案中，細胞提取物通過以下來獲得:在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞和從生長培養(yǎng)基除去所得到的細胞提取物。在一些實施方案中，細胞可以源自植物和/或動物源，包括人。
[0131]使胞外蛋白在經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基或細胞提取物例如生長因子、細胞因子和應(yīng)激蛋白中代謝，在以下中打開了新的可能性:制備用于包括組織修復的各種各樣領(lǐng)域的產(chǎn)品，例如，治療創(chuàng)傷和其他組織缺陷例如外觀缺陷以及人和動物供給補充物。例如，已知生長因子在創(chuàng)傷愈合過程中起到重要的作用。通過本公開內(nèi)容的代謝工藝將這些生長因子的至少一種活性給予經(jīng)調(diào)節(jié)的細胞培養(yǎng)基或細胞提取物。
[0132]細胞的細胞因子和生長因子涉及到許多關(guān)鍵的細胞過程，包括細胞增殖、粘附、形態(tài)學外觀、分化、遷移、炎癥反應(yīng)、血管生成、和細胞死亡。研究已經(jīng)證明，缺氧應(yīng)激和對細胞的損傷誘導包括mRNA和蛋白的水平增加的響應(yīng)，蛋白相應(yīng)于生長因子例如I3DGF (血小板衍生生長因子)、VEGF (血管內(nèi)皮生長因子)、FGF (成纖維細胞生長因子)和IGF (胰島素樣生長因子)(Gonzalez-Rubio, M.等人，1996，Kidney Int.50 (I):164-73 ；Abramovitch, R.等人，1997，Int J Exp.Pathol.78(2):57-70 ；Stein, 1.等人，1995，Mol Cell Biol.15(10):5363-8 ；Yang, ff.等人，1997，F(xiàn)EBS Lett.403 (2):139-42 ；ffest, N.R.等人，1995，J.Neurosc1.Res.40(5):647-59)。
[0133]生長因子，例如轉(zhuǎn)化生長因子，還稱為TGF-β，由某些應(yīng)激蛋白在創(chuàng)傷愈合期間誘導。兩種已知的應(yīng)激蛋白是GRP78和HSP90。這些蛋白穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)且使細胞對不利狀態(tài)有抵抗力。二聚蛋白的TGF-β家族包括TGF-β 1、TGF-02和TGF-03且調(diào)節(jié)許多細胞類型的生長和分化。此外，該蛋白家族展示各種生物效應(yīng)，刺激一些細胞類型的生長(Noda等人，1989，EndocrinologylM =2991-2995)和抑制其他細胞類型的生長(Goey 等人，1989, J.1mmunol.143:877-880 ；Pietenpol 等人，1990, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87 =3758-3762) 0還示出TGF-β增加包括膠原和纖連蛋白的胞外基質(zhì)蛋白的表達(Ignotz 等人，1986, J.Biol.Chem.261:4337-4345)和加速創(chuàng)傷的愈合(Mustoe 等人，1987，Science迎1:1333-1335)。
[0134]另一種這樣的生長因子是H)GF。I3DGF最初被發(fā)現(xiàn)是間葉細胞衍生的細胞的有效促細胞分裂劑(Ross R.等人，1974，Proc.Natl.Acad.Sc1.USAU(4):1207-1210 ；KohlerN.等人，1974，Exp.Cell Res.87 =297-301) 0另外的研究已經(jīng)表明，PDGF增加組織形成中的細胞構(gòu)成和肉芽形成的速率。用I3DGF治療的創(chuàng)傷具有早期炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)，包括中性白細胞和巨噬細胞類型在創(chuàng)傷部位處的增加。這些創(chuàng)傷還示出增強的成纖維細胞功能(Pierce, G.F.等人，1988.J.Exp.Med.167:974-987)。 PDGF 和 TGF-β 兩者均已經(jīng)在動物研究中被示出增加膠原形成、DNA含量和蛋白水平(Grotendorst, G.R.等人，1985，J.Clin.1nvest.76:2323-2329 ；Sporn, Μ.B.等人，1983，Science (Wash DC)迅豆:1329)。已經(jīng)表明TOGF在治療人創(chuàng)傷中是有效的。在人創(chuàng)傷中，TOGF-AA表達在經(jīng)歷愈合的壓力潰瘍內(nèi)增加。I3DGF-AA的增加相應(yīng)于創(chuàng)傷的活化成纖維細胞、胞外基質(zhì)沉積和有效血管形成的增加。此外，在慢性非愈合創(chuàng)傷中沒有看到F1DGF-AA的這樣的增加(Principles of TissueEngineering, R.Lanza 等人(編輯)，第 133-141 頁(R.G.Landes C0.TX1997)。具有誘導血管生成和創(chuàng)傷愈合的能力的許多其他生長因子包括VEGF、KGF和堿性FGF。
[0135]A.牛.長培 養(yǎng)基
[0136]用于細胞培養(yǎng)的生長培養(yǎng)基制劑在文獻中是熟知的，且許多是商購的。
[0137]預(yù)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基成分包括(但不限于)下面所描述的那些。另外，成分的濃度是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。參見，例如上文的Methods For Preparation OfMedia, Supplements and Substrate for Serum-free Animal Cell Cultures, supra。成分包括氨基酸(D-氨基酸和/或L-氨基酸兩者)，例如谷氨酸鹽、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸以及它們的衍生物；酸溶性亞組例如硫胺、抗壞血酸、正鐵化合物、亞鐵化合物、嘌呤、谷胱甘肽和磷酸二氫鈉。
[0138]另外的成分包括糖、脫氧核糖、核糖、核苷、水溶性維生素、核黃素、鹽、微量金屬、脂質(zhì)、乙酸鹽、磷酸鹽、HEPES、酚紅、丙酮酸鹽和緩沖劑。
[0139]常常使用在培養(yǎng)基制劑中的其他成分包括脂溶性維生素(包括A、D、E和K)類固醇和它們的衍生物、膽固醇、脂肪酸和脂質(zhì)、吐溫80、2_巰基乙醇嘧啶以及各種補充物，包括血清(胎兒的，馬、小牛等)、蛋白(胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、生長因子、激素類等)、抗生素(慶大霉素、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B等)、全蛋超濾液和附著因子(纖連蛋白、玻連蛋白、膠原、昆布氨酸、肌腱蛋白(tenascin)等)。
[0140]培養(yǎng)基可以需要或可以不需要補充有生長因子和其他蛋白例如附著因子，因為許多細胞構(gòu)建體尤其是本申請中描述的三維細胞和組織培養(yǎng)物構(gòu)建體本身將這樣的生長因子和附著因子以及其他產(chǎn)物加工到培養(yǎng)基中。
[0141]B.細朐培養(yǎng)物
[0142]1.細朐
[0143]任何細胞可以使用在細胞培養(yǎng)物中。例如，細胞可以是基質(zhì)細胞、實質(zhì)細胞、間充質(zhì)干細胞(血統(tǒng)定向或非定向的祖細胞)、肝儲備細胞、神經(jīng)干細胞、胰腺干細胞和/或胚胎干細胞。僅舉幾個例子，細胞可以包括(但不限于)骨髓、皮膚、肝、胰腺、腎、神經(jīng)組織、腎上腺、粘膜上皮和平滑肌。包括基質(zhì)的成纖維細胞和成纖維細胞樣細胞以及其他細胞和/或成分在來源上可以是胎兒的或成人的，且可以源自適宜的源例如皮膚、肝、胰腺、粘膜、動脈、靜脈、臍帶和胎盤組織等。這樣的組織和/或器官可以通過適當?shù)幕罱M織切片或在尸體解剖之后獲得。實際上，尸體器官可以用于提供基質(zhì)細胞和成分的豐富供應(yīng)。[0144]包括基質(zhì)的胚胎干細胞和/或其他成分可以使用本領(lǐng)域已知的方法來分離。例如，最近，人胚胎干細胞種群以及分離和使用這些細胞的方法已經(jīng)被報告在Keller等人，Nature Med., 5:151-152 (1999), Smith Curr.Biol.8:R802-804 (1998)中；已經(jīng)從原生殖細胞被分離，Shamblatt等人，PNAS95:13726-1373 (1998)；已經(jīng)從胚細胞被分離，Thomason等人，Science282:1145-1147(1988)。間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng)是本領(lǐng)域已知的。參見Mackay 等人，Tissue Eng.4:415-428 (1988) ;William 等人,Am Surg.65:22-26 (1999)。這些細胞的接種在下文描述在部分5.3中。同樣地，神經(jīng)干細胞可以在以下中描述的方式被分離:Flax 等人，Nature Biotechnol., 16: 1033-1039 (1998);和 Frisen 等人，Cell.Mol.Life Sc1.，54:935-945(1998)。
[0145]細胞可以本領(lǐng)域已知的任何方式來培養(yǎng)，包括以單層、珠或以三維和通過任何方式(即，培養(yǎng)容器、滾瓶、連續(xù)流系統(tǒng)等)。細胞和組織培養(yǎng)的方法是本領(lǐng)域熟知的，且被描述在例如上文的 Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures, supra,下文的Freshney(1987), Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques, infra。
[0146]一般而言，利用的細胞系被仔細地篩選人和動物病原體。取決于應(yīng)用，當僅不含病原體的細胞是可接受的時(例如，對于創(chuàng)傷愈合、食物添加劑等)，這樣的篩選可以具有關(guān)鍵的重要性。篩選病原體的方法是本領(lǐng)域熟知的。細胞類型，無論是以二維還是三維被培養(yǎng)，將影響經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的性質(zhì)。在一些實施方案中，細胞以二維被培養(yǎng)。在其他實施方案中，細胞以三維被培養(yǎng)。
[0147]a.某因工稈細朐
[0148]在一些實施方案中，細胞可以作為用于將基因產(chǎn)物引入到促進例如組織缺陷的修復和/或再生的培養(yǎng)基或提取物中的媒介物。細胞可以被基因工程為表達(例如)炎性媒介物例如IL-6、IL-8和G-CSF。細胞還可以或可選擇地被基因工程為表達抗炎因子，例如，抗 GM-CSF、抗 TNF、抗 IL-1、抗 IL-2 等。
[0149]在另一個實施方案中，細胞可以被基因工程為將基因表達到將發(fā)揮治療作用的培養(yǎng)基或提取物中，例如，在TGF-β的生產(chǎn)中以刺激軟骨生產(chǎn)，或其他因子例如BMP-13以促進軟骨形成、或促進基質(zhì)細胞的遷移和/或基質(zhì)沉積的刺激因子。因為構(gòu)建體包括真核細胞，所以基因產(chǎn)物將被適當?shù)乇磉_和加工以形成活性產(chǎn)物。優(yōu)選地，使用的表達控制成分應(yīng)允許基因的調(diào)節(jié)表達，使得產(chǎn)物可以在培養(yǎng)物中被過度合成。通常，所選擇的翻譯啟動子和具體地啟動子成分，部分地取決于培養(yǎng)的組織和細胞的類型。能夠分泌蛋白的細胞和組織是優(yōu)選的(例如，具有大量糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體細胞器的那些)。過渡生產(chǎn)的基因產(chǎn)物然后將由工程細胞分泌到經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中。
[0150]細胞可以被基因工程為調(diào)節(jié)一個或多個基因；或基因表達的調(diào)節(jié)可以是短暫的或長期的；或基因活性可以是不可誘導的或可誘導的。
[0151]細胞還可以被基因工程為“破壞(knock out) ”促進炎癥的因子的表達。在下面討論用于降低目標基因表達水平或目標基因產(chǎn)物活性水平的負調(diào)節(jié)技術(shù)。如本文使用的“負調(diào)節(jié)”是指相對于在沒有調(diào)節(jié)處理的情況下的目標基因產(chǎn)物的水平和/或活性，目標基因產(chǎn)物的水平和/或活性下降。原產(chǎn)于該細胞的基因的表達可以使用許多技術(shù)來降低或破壞，例如，表達可以通過使用標準同源重組技術(shù)使完全基因失活(通常稱為“擊昏”)來抑制。通常，編碼蛋白的重要的區(qū)的外顯子(或該區(qū)的外顯子5’)由陽性可選擇的標記物(例如neo)間隔，阻止從目標基因生產(chǎn)正常mRNA且導致基因的失活?；蜻€可以通過在基因的一部分中產(chǎn)生缺失或失活插入，或通過刪除整個基因而失活。通過將具有兩個同源性的區(qū)域的構(gòu)建體用于在基因組中遠離的目標基因，插入兩個區(qū)域的序列可以被刪除。Mombaerts等人，1991，Proc.Nat.Acad.Sc1.U.S.A.88:3084-3087?可選擇地，基因還可以通過刪除上游或下游表達成分而失活。
[0152]抑制目標基因的表達的反義分子和核酶分子還可以用于降低目標基因活性的水平。例如，抑制主要組織適合性基因 群(HLA)的表達的反義RNA分子已經(jīng)被表明關(guān)于免疫響應(yīng)是最通用的。此外，適當?shù)暮嗣阜肿涌梢员辉O(shè)計，如由例如Haseloff等人，1988，Nature—:585-591 ;Zaug 等人，1984，SciencegM:574-578 ;和 Zaug 和Cech, 1986，Science益1:470-475所描述的。更進一步地，三鏈螺旋分子可以用于降低目標基因活性的水平。這些技術(shù)由L.G.Davis等人編輯，Basic Methods in MolecularBiology,第 2 版，Appleton&Lange, Norwalk, Conn.1994 詳細地描述。
[0153]可用于對細胞進行基因工程的方法是本領(lǐng)域熟知的且在共同在審的美國專利4，963，489和5，785，964中進一步詳述，兩個專利的公開內(nèi)容通過引用并入本文。例如，包含外源核酸例如編碼所關(guān)心的基因產(chǎn)物的重組體DNA構(gòu)建體或支撐物，可以被構(gòu)建和用于轉(zhuǎn)變或轉(zhuǎn)染基質(zhì)細胞。攜帶外源核酸且能夠表達所述核酸的這樣的轉(zhuǎn)變的或轉(zhuǎn)染的細胞，被選擇且以本公開內(nèi)容的三維構(gòu)建體克隆擴展。
[0154]用于制備包含所關(guān)心的基因的DNA構(gòu)建體的方法、用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞的方法，和用于選擇攜帶并表達所關(guān)心的基因的細胞的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，在以下中描述的技術(shù):Maniatis 等人，1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Ausubel 等人，1989, Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates&ffileyInterscience, N.Y.;和 Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.。
[0155]細胞可以使用任何各種載體中的任何來設(shè)計，載體包括但不限于，整合病毒載體，例如，還原病毒載體或腺相關(guān)病毒載體；或非整合復制載體，例如，乳頭狀瘤病毒載體、SV40載體、腺病毒載體；或復制缺陷型病毒載體。當需要短暫表達時，非整合載體和復制缺陷型載體可能是優(yōu)選的，因為可誘導的或構(gòu)成的啟動子可以在這些系統(tǒng)中用于控制所關(guān)心的基因的表達?？蛇x擇地，整合載體可以用于獲得短暫表達，只要所關(guān)心的基因受可誘導的啟動子控制。將DNA引入細胞中的其他方法包括使用脂質(zhì)體、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、基因槍、或通過直接的DNA注射。
[0156]細胞優(yōu)選地用核酸例如DNA來轉(zhuǎn)變或轉(zhuǎn)染，通過一種或多種適當?shù)谋磉_控制成分例如啟動子或增強子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸部位以及其他、和可選擇的標記物來控制，即，與它們處于操作結(jié)合。在引入外來DNA之后，工程細胞可以允許在富集培養(yǎng)基中生長且然后轉(zhuǎn)到選擇的培養(yǎng)基。外來DNA中的可選擇的標記物給予針對選擇的抗性且允許細胞穩(wěn)定地將外來DNA整合在諸如例如質(zhì)粒上，進入它們的染色體并生長以形成灶，該灶又可以被克隆和擴展到細胞系。該方法可以有利地用于對將基因產(chǎn)物表達到培養(yǎng)基中的細胞系工程化。
[0157]任何啟動子可以用于驅(qū)動插入的基因的表達。例如，病毒啟動子包括(但不限于)CMV啟動子/增強子、SV40、乳頭狀瘤病毒、埃-巴二氏病毒、彈性蛋白基因啟動子和β-球蛋白。優(yōu)選地，用于控制所關(guān)心的基因的表達的控制成分應(yīng)允許基因的調(diào)節(jié)表達，使得產(chǎn)物僅當在體內(nèi)需要時被合成。如果需要短暫表達，則構(gòu)成的啟動子優(yōu)選地用于非整合和/或復制缺陷型載體中?？蛇x擇地，當需要時，可誘導的啟動子可以用于驅(qū)動插入的基因的表達?？烧T導的啟動子可以建到整合和/或復制載體中。例如，可誘導的啟動子包括但不限于，金屬硫蛋白和熱休克蛋白。
[0158]根據(jù)一個實施方案，用于表達所關(guān)心的的外源基因的可誘導的啟動子是為如本文所公開的由于低溫保存和隨后的解凍而誘發(fā)的那些調(diào)節(jié)蛋白的天然啟動子的那些。例如，TGF-13、VEGF、或各種已知的熱休克蛋白的啟動子可以用作表達控制成分，即，可以可操作地結(jié)合至所關(guān)心的外源基因以在調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)基的組織構(gòu)建體中表達所需的基因產(chǎn)物。
[0159]各種方法可以用于獲得被工程化到細胞中的基因產(chǎn)物的構(gòu)成的或短暫的表達。例如，可以使用由Seldon等人，1987，Science236:714-718描述的轉(zhuǎn)核移植技術(shù)。如本文使用的“轉(zhuǎn)核”表明移植的細胞的核`已經(jīng)通過加入DNA序列通過穩(wěn)定的或短暫的轉(zhuǎn)染而被改變。優(yōu)選地，細胞被工程化為短暫地和/或在可誘導的控制下在手術(shù)后恢復時間期間表達這樣的基因產(chǎn)物，或被工程化為錨至基質(zhì)細胞的嵌合融合蛋白，例如，被工程化為主要由受體或受體樣分子的細胞內(nèi)和/或橫跨膜域組成的嵌合分子，作為胞外的域融合至基因產(chǎn)物。
[0160]此外，可能期望制備具有包含外來基因產(chǎn)物、生長因子、調(diào)節(jié)因子等的胞外基質(zhì)的構(gòu)建體，其然后在經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中被發(fā)現(xiàn)。該實施方案是基于以下發(fā)現(xiàn):在人基質(zhì)細胞在三維支撐物骨架上生長期間，細胞在骨架上合成和沉積，原樣產(chǎn)生的人胞外基質(zhì)在正常人組織中。胞外基質(zhì)局部地由細胞分泌且不僅將細胞和組織結(jié)合在一起，而且影響其接觸的細胞的發(fā)育和行為。胞外基質(zhì)包含各種結(jié)締組織蛋白，例如，在主要由氨基葡聚糖鏈的網(wǎng)絡(luò)組成的水合凝膠中交織的纖維形成蛋白。氨基葡聚糖是長的帶負電荷的多糖鏈的多相群，其(除了透明質(zhì)酸)共價地鍵合至蛋白以形成蛋白聚糖分子。根據(jù)該實施方案，基質(zhì)細胞可以被基因工程為表達所需的基因產(chǎn)物，或改變的基因產(chǎn)物形式，其將存在胞外基質(zhì)中和最終存在細胞培養(yǎng)基中。
[0161]2.培養(yǎng)細朐
[0162]在一些實施方案中，細胞在二維細胞培養(yǎng)物中生長。在其他實施方案中，細胞在三維細胞培養(yǎng)物中生長。參見，例如，通過引用以其整體并入本文的美國專利第6，372，494號。用于細胞培養(yǎng)物中的基質(zhì)細胞優(yōu)選地包括成纖維細胞、間充質(zhì)干細胞、肝儲備細胞、神經(jīng)干細胞、胰腺干細胞、和/或胚胎干細胞，具有或不具有本文更充分地描述的另外的細胞和/或成分。
[0163]細胞可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式來培養(yǎng)。優(yōu)選地，在能夠?qū)崿F(xiàn)無菌加工和處理的環(huán)境中培養(yǎng)細胞。細胞和組織培養(yǎng)的常規(guī)方式已經(jīng)由于需要人監(jiān)督和控制培養(yǎng)基而受限制。這限制了可以在單一時間培養(yǎng)的細胞和組織的量和從而限制了可以在單一時間獲得的經(jīng)調(diào)節(jié)的細胞培養(yǎng)基的體積。由于該原因，優(yōu)選的是，培養(yǎng)基以允許大規(guī)模生長(產(chǎn)生大規(guī)模經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基)的方式使用(例如)用于無菌大規(guī)模培養(yǎng)的設(shè)備，比如共同所有的美國專利5，763，267( ‘267專利)中描述的設(shè)備來調(diào)節(jié)，為了所有的目的，通過引用以其整體并入本文。使用‘267專利中描述的無菌封閉系統(tǒng)，將預(yù)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基從流體儲器運輸至入口歧管且均勻地分配至連續(xù)流系統(tǒng)中的培養(yǎng)物且可用于培養(yǎng)三維細胞和組織培養(yǎng)物，例如諸如Dermagraft?。特定地，‘267專利中描述的設(shè)備包括多個柔性的或半柔性的處理室，該處理室包括一個或多個個體培養(yǎng)袋、多個硬的隔離物、入口流體歧管、出口流體歧管、流體儲器，和用于在系統(tǒng)內(nèi)運輸流體的裝置。
[0164]在處理期間，將液體培養(yǎng)基從流體儲器運輸至入口歧管，入口歧管又將培養(yǎng)基均勻地分配至連接的處理室和內(nèi)部培養(yǎng)袋中的每一個。還提供出口流體歧管以確保每一個處理室被均勻地填充和確保在處理期間形成的任何氣泡被從處理室除去。處理室是柔性的或半柔性的，以便在沖洗和應(yīng)用培養(yǎng)的移植物期間提供便于最終用戶的處理。由于處理室的柔性，還提供硬的隔離物，硬的隔離物確保在處理期間在室內(nèi)均勻的流體分布。
[0165]在另一個實施方案中，在用于組織培養(yǎng)物的無菌生長的設(shè)備中培養(yǎng)組織，如為了所有目的以其整體并入本文的美國專利第5，843，766 (‘766專利)號中所描述的?！?66專利公開了組織培養(yǎng)室，其中室是提供用于組織的生長的套管，組織可以在相同的無菌容器中生長，以冷凍形式 被保存，和運往最終用戶。組織培養(yǎng)室包括套管，套管包括在套管內(nèi)的基材，基材被設(shè)計為促進在基材的表面上的三維組織生長。套管包括幫助培養(yǎng)基的流入和流出的入口和出口。套管還包括至少一個流量分配器。在一個實施方案中，流量分配器是擋板，其用于分配在室內(nèi)的培養(yǎng)基流以產(chǎn)生組織的連續(xù)的、均一的塊。在第二實施方案中，流量分配器是偏轉(zhuǎn)板、分配通道和流動通道的組合。在每一個實施方案中，套管還包括密封件以便確保在組織生長和儲存期間在室內(nèi)部的無菌環(huán)境。
[0166]成纖維細胞將支持許多不同的細胞和組織在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長，且因此，可以被接種到基質(zhì)上以形成“一般的”基質(zhì)支持基體，用于培養(yǎng)各種細胞和組織中的任一種。然而，在某些情況下，使用“特殊的”而不是“一般的”基質(zhì)支持基體可能是優(yōu)選的，在該情況下，基質(zhì)細胞和成分可以從特定的組織、器官或個體獲得。此外，成纖維細胞和其他基質(zhì)細胞和/或成分可以源自將在三維系統(tǒng)中培養(yǎng)的相同類型的組織。當培養(yǎng)組織時這可能是有利的，其中特殊的基質(zhì)細胞可以起到特定的結(jié)構(gòu)/功能作用，例如，動脈的平滑肌細胞、神經(jīng)組織的神經(jīng)膠質(zhì)細胞、肝的庫柏法細胞等。
[0167]一旦接種到三維支撐物上，基質(zhì)細胞將在骨架上增殖并沉積由基質(zhì)細胞天然分泌的結(jié)締組織蛋白例如生長因子、調(diào)節(jié)因子和胞外基質(zhì)蛋白?；|(zhì)細胞和它們的天然分泌的結(jié)締組織蛋白基本上包圍骨架，因此形成活的基質(zhì)組織，該活的基質(zhì)組織將支持接種到本公開內(nèi)容的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中的組織特有的細胞的生長。實際上，當用組織特有的細胞接種時，三維基質(zhì)組織將維持培養(yǎng)物的活躍增殖，持續(xù)長的時間段。重要地，因為網(wǎng)的開口允許培養(yǎng)物中的基質(zhì)細胞離開，匯合的基質(zhì)培養(yǎng)物沒有展示接觸抑制，且基質(zhì)細胞繼續(xù)生長、分裂和保持功能上是活性的。
[0168]生長因子和調(diào)節(jié)因子由基質(zhì)組織加工到培養(yǎng)基中。生長因子(例如但不限于，aFGF、PFGF、胰島素生長因子或TGF-β)、或天然的或改性的血液制品或其他生物活性的生物分子(例如但不限于，透明質(zhì)酸或激素類)，增強三維骨架或支架的定植(colonization)并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。
[0169]在體內(nèi)使用培養(yǎng)物之前可以改變基質(zhì)細胞生長的程度，這取決于以三維組織培養(yǎng)生長的組織的類型。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的活的基質(zhì)組織可以通過將它們植入體內(nèi)而用作矯正結(jié)構(gòu)?？蛇x擇地，活的基質(zhì)組織可以用另一種細胞類型接種并植入體內(nèi)。基質(zhì)細胞可以被基因工程為調(diào)節(jié)分泌到培養(yǎng)基中的蛋白產(chǎn)物的水平以提高從經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基獲得的回收產(chǎn)物的濃度。例如，基質(zhì)細胞可以被基因工程為提高從經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基獲得的以下產(chǎn)物中的一種或多種的濃度?？寡滓蜃永缈笹M-CSF、抗TNF、抗IL-1、抗IL-2等?？蛇x擇地，基質(zhì)細胞可以被基因工程為“破壞”促進炎癥的天然基因產(chǎn)物的表達，例如，GM-CSF, TNF、IL-UIL-2，或“破壞” MHC的表達以便降低排斥的風險。
[0170]基質(zhì)細胞以三維生長將維持基質(zhì)細胞和組織特有的細胞兩者在培養(yǎng)物中的活躍增殖，持續(xù)比單層系統(tǒng)持續(xù)的時間更長的時間。此外，三維系統(tǒng)支持細胞在體外培養(yǎng)中的成熟、分化和分離，以形成類似于在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的對應(yīng)物的成人組織組分且將蛋白固定到更接近地類似生理比率的調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中。
[0171]a.三維基質(zhì)組織的建立
[0172]三維支撐物或骨架可以是任何材料和/或形狀，該材料和/或形狀:(a)允許細胞附接至其(或可以被修飾為允許細胞附接至其)；和(b)允許細胞以多于一層生長。許多不同的材料可以用于形成骨架，包括但不限于:不可生物降解的材料，例如，尼龍(聚酰胺)、滌綸(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯基化合物(例如，聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE ;特氟隆)、thermanox(TPX)、硝酸纖維素、棉花；和可生物降解的材料，例如，聚乙醇酸(PGA)、膠原、膠原海綿、腸線、纖維素、明膠、葡聚糖、聚鏈烷酸酯等。這些材料中的任何可以例如被紡織、`編織、針織等為網(wǎng)，以形成三維骨架。骨架又可以被塑造成矯正結(jié)構(gòu)所需的任何形狀，例如管、繩、細絲等。某些材料例如尼龍、聚苯乙烯等是用于細胞附著的差的基材。當這些材料用作三維骨架時，可取的是在接種基質(zhì)細胞之前預(yù)處理骨架以便增強基質(zhì)細胞附著到支撐物。例如，在用基質(zhì)細胞接種之前，尼龍骨架可以用0.1M乙酸來處理，并在聚賴氨酸、FBS和/或膠原中溫育以包覆尼龍。聚苯乙烯可以同樣地使用硫酸來處理。
[0173]當培養(yǎng)物被植入體內(nèi)時，可以優(yōu)選使用可生物降解的基質(zhì)，例如諸如聚乙醇酸、膠原、膠原海綿、紡織膠原、腸線材料、明膠、聚乳酸、或聚乙醇酸和其共聚物。當培養(yǎng)物將被維持長的時間段或低溫保存時，不可降解的材料例如尼龍、滌綸、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、乙烯類聚合物、特氟隆、棉花等可以是優(yōu)選的?？梢愿鶕?jù)本公開內(nèi)容使用的方便的尼龍網(wǎng)是NITFJC?,其是具有210 μ m的平均孔徑和90 μ m的平均尼龍纖維直徑的尼龍過濾網(wǎng)(#3-210/36, Tetko, Inc.，N.Y.)。
[0174]具有或不具有下面所描述的其他細胞和成分的包括成纖維細胞、間充質(zhì)干細胞、肝儲備細胞、神經(jīng)干細胞、胰腺干細胞和/或胚胎干細胞的基質(zhì)細胞，被接種到骨架上。此外，在疏松結(jié)締組織中存在的細胞連同成纖維細胞可以被接種到三維支撐物上。這樣的細胞包括但不限于平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、周細胞、巨噬細胞、單核細胞、漿細胞、肥大細胞、月旨肪細胞等。如先前解釋，胎兒成纖維細胞可以用于形成將支持各種不同的細胞和/或組織的生長的“一般的”三維基質(zhì)基體。然而，“特殊的”基質(zhì)組織可以通過用源自將被培養(yǎng)的相同類型的組織和/或源自稍后接收根據(jù)三維系統(tǒng)在培養(yǎng)物中生長的細胞和/或組織的特定個體的成纖維細胞接種三維骨架來制備。
[0175]因此，在一個實施方案中，可以培養(yǎng)專門用于特定組織的基質(zhì)細胞。例如，造血組織的基質(zhì)細胞，包括但不限于成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞/單核細胞、脂肪細胞和網(wǎng)狀細胞，可以用于形成三維近匯合基質(zhì)，用于在體外長期培養(yǎng)骨髓。造血基質(zhì)細胞可以容易地通過以低的力例如3000xg離心從骨髓懸浮液中形成的“血沉棕黃層”獲得。在構(gòu)成動脈的內(nèi)壁的基質(zhì)層中，可以加入高比例的未分化的平滑肌細胞以為蛋白提供彈性。肝的基質(zhì)細胞可以包括成纖維細胞、庫柏法細胞、以及血管和膽管內(nèi)皮細胞。同樣地，神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以用作基質(zhì)來支持神經(jīng)細胞和組織的增殖；用于該目的的神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以通過胚胎或成年腦的胰蛋白酶化或膠原酶消化來獲得(Ponten和Westermark, 1980,在Federof, S.Hertz,L.編輯“Advances in Cellular Neurobiology, ^ 第 I 卷，New York, AcademicPress，第209-227頁中)。細胞在三維基質(zhì)細胞培養(yǎng)物中生長可以通過向骨架加入以下物質(zhì)或用這些物質(zhì)包覆支撐物來進一步增強:蛋白(例如，膠原、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維)糖蛋白、葡糖氨基葡聚糖(例如硫酸肝素、硫酸軟骨素_4、硫酸軟骨素_6、硫酸皮膚素、硫酸角蛋白等)、細胞基質(zhì)、和/或其他材料。
[0176]此外，間充質(zhì)干細胞(血統(tǒng)定向或非定向的祖細胞)是用于接種到骨架上的有利的“基質(zhì)”細胞。細胞可以分化為骨細胞、腱和韌帶的成纖維細胞、骨髓基質(zhì)細胞、結(jié)締組織的脂肪細胞和其他細胞、軟骨細胞，這取決于內(nèi)生的或補充的生長以及調(diào)節(jié)因子和其他因子，包括前列腺素、白細胞介素和天然存在的抑素，其調(diào)節(jié)增殖和/或分化。
[0177]成纖維細胞可以容易地通過分解作為成纖維細胞的源的適當?shù)钠鞴倩蚪M織而分離。這可以容易地使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來完成。例如，組織或器官可以用機械方法來分解和/或用消弱在鄰 近細胞之間的連接的消化酶和/或螯合劑處理，使得可以將組織分散成單個細胞的懸浮液，而沒有明顯的細胞破裂。酶促離解可以通過切碎組織和用許多消化酶中的任何單獨地或組合地處理切碎的組織來完成。這些包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、膠原酶、彈性蛋白酶、和/或透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶、鏈酶蛋白酶、分散酶等。
[0178]機械破壞還可以通過許多方法來完成，包括但不限于，僅舉幾個例子，使用研磨機、攪拌機、篩、勻漿器、壓力室或絕緣子(insonator)。對于組織解聚技術(shù)的綜述，參見 Freshney, Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques,第 2 版，A.R.Liss, Inc.，New York, 1987，第 9 章，第 107-126 頁。
[0179]一旦組織已經(jīng)簡化為單個細胞的懸浮液，懸浮液就可以被分為亞群，可以從該亞群獲得成纖維細胞和/或其他基質(zhì)細胞和/或成分。這還可以使用用于細胞分離的標準技術(shù)來完成，包括但不限于，具體細胞類型的克隆和選擇、不需要的細胞的選擇性破壞(陰性選擇)、基于混合種群中的差別的細胞可凝集性的分離、凍-融程序、混合種群中的細胞的差別附著性質(zhì)、過濾、常規(guī)離心和區(qū)帶離心、淘析離心法(逆流離心)、單位重力分離、逆流分布法、電泳和熒光活化細胞分選。對于無性選擇和細胞分離技術(shù)的綜述，參見 Freshney, Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques,第 2 版，A.R.Liss, Inc., New York, 1987，第 11 和 12 章，第 137-168 頁。
[0180]成纖維細胞的分離可以例如如下進行:將新鮮的組織樣品徹底地洗滌并在漢克平衡鹽溶液(HBSS)中切碎以除去血清。將切碎的組織在新制備的離解酶例如胰蛋白酶溶液中溫育1-12小時。在這樣的溫育之后，離解的細胞被懸浮，通過離心做成丸并覆蓋在培養(yǎng)容器上。所有成纖維細胞將在其他細胞之前附著，因此，適當?shù)幕|(zhì)細胞可以被選擇性地分離和生長。然后，分離的成纖維細胞可以生長成合流，從匯合的培養(yǎng)物中提起和接種到三維基質(zhì)上(參見，Naughton等人，1987，J.Med.18 (3和4) 219-250)。用高濃度的基質(zhì)細胞例如約IO6至5X IO7細胞/ml接種三維骨架將導致在較短的時間段內(nèi)建立三維基質(zhì)組織。
[0181 ] 在接種基質(zhì)細胞之后，應(yīng)在適當?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中溫育三維骨架。如前所述的，許多商購的培養(yǎng)基例如RPMI1640、Fisher’ s、Iscove’ s、McCoy’ s等可以適于使用。重要的是，在溫育期期間，三維基質(zhì)細胞培養(yǎng)物被懸浮或漂浮在培養(yǎng)基中以使增殖活性最大化。培養(yǎng)物被定期地“進料”，且回收和加工經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，如下面部分5.6和5.7所描述的。因此，取決于待被培養(yǎng)的組織和所需的膠原類型，可以選擇適當?shù)幕|(zhì)細胞來接種三維基質(zhì)。
[0182]在溫育三維基質(zhì)細胞培養(yǎng)物期間，可以從基質(zhì)釋放增殖的細胞。這些釋放的細胞可以粘住培養(yǎng)容器的壁，在該處它們可以繼續(xù)增殖和形成匯合的單層。這應(yīng)(例如)通過在進料期間除去釋放的細胞，或通過將三維基質(zhì)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)容器來防止或最小化。容器中存在匯合的單層將“停止”細胞在三維基質(zhì)和/或培養(yǎng)物中的生長。除去匯合的單層或?qū)⑴囵B(yǎng)物轉(zhuǎn)移至新容器中的新鮮培養(yǎng)基將恢復三維培養(yǎng)系統(tǒng)的增殖活性。應(yīng)注意，如果需要的話，對經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基進行加工，使得其不包含任何全細胞(除非全細胞用于特殊應(yīng)用)。這樣的除去或轉(zhuǎn)移應(yīng)在具有超過25%合流的基質(zhì)單層的任何培養(yǎng)容器中進行。可選擇地，培養(yǎng)系統(tǒng)可以被攪拌以防止釋放的細胞粘住，或代替地定期地進料培養(yǎng)物，培養(yǎng)系統(tǒng)可以被設(shè)置為使得新鮮的培養(yǎng)基連續(xù)地流過系統(tǒng)。流速可以被調(diào)節(jié)為使在三維培養(yǎng)物內(nèi)的增殖 最大化，和洗出和除去從培養(yǎng)物釋放的細胞，使得它們將不粘住容器的壁并生長至合流。
[0183]其他細胞例如實質(zhì)細胞，可以在三維活基質(zhì)組織上接種和生長。
[0184]b.將另外的細胞接種到細胞培養(yǎng)物中
[0185]一旦細胞培養(yǎng)物已經(jīng)達到特定的生長程度，就可以將另外的細胞接種到細胞培養(yǎng)物中并連同細胞培養(yǎng)物的細胞一起培養(yǎng)。另外的細胞在活組織上在體外生長以形成自然組織的經(jīng)培養(yǎng)的對應(yīng)物，且通過以類似于生理水平的比率將胞外產(chǎn)物加工到培養(yǎng)基中來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。接種物中的高濃度細胞將有利地比低濃度更快地導致在培養(yǎng)物中增加的增殖。
[0186]選擇用于接種的細胞將取決于待被培養(yǎng)的組織，所述組織可以包括但不限于，僅舉幾個例子，骨髓、皮膚、肝、胰腺、腎、神經(jīng)組織、腎上腺、粘膜上皮和平滑肌。這樣的細胞將特有的胞外蛋白例如某些生長因子加工到培養(yǎng)基中，導致優(yōu)化用于某些組織特殊應(yīng)用的培養(yǎng)基。
[0187]例如且不是作為限制，可以在活組織上培養(yǎng)各種上皮細胞。這樣的上皮細胞的實例包括(但不限于)角質(zhì)形成細胞、口腔粘膜和胃腸(G.1.)道細胞。這樣的上皮細胞可以通過以下來分離:根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法酶促處理組織，隨后使這些細胞在培養(yǎng)物中擴展和將上皮細胞應(yīng)用至(例如)三維基質(zhì)支撐物細胞基質(zhì)?；|(zhì)支撐物的存在提供了促進上皮細胞的正常分裂和分化的生長因子和其他蛋白。
[0188]一般而言，該接種物應(yīng)包括該組織的“干”細胞(還稱為“儲備”細胞)；即，產(chǎn)生新細胞的那些細胞，新細胞將成熟為形成組織的各種組分的特殊細胞。
[0189]接種物中使用的實質(zhì)細胞或其他表面層細胞可以從通過使用用于獲得基質(zhì)細胞的上述標準技術(shù)來分解所需的組織而制備的細胞懸浮液獲得。整個細胞懸浮液本身可以用于接種三維活基質(zhì)組織。因此，包含在勻漿內(nèi)的再生細胞將在基質(zhì)上適當?shù)卦鲋?、成熟和分化，而非再生細胞將不會?？蛇x擇地，特定的細胞類型可以使用用于分級基質(zhì)細胞的上述標準技術(shù)從細胞懸浮液的適當部分分離。當“干”細胞或“儲備”細胞可以容易地被分離時，這些可以用于優(yōu)先地接種三維基質(zhì)支撐物。例如，當培養(yǎng)骨髓時，基質(zhì)可以用新鮮的或源自低溫保存樣品的骨髓細胞來接種。當培養(yǎng)皮膚時，三維基質(zhì)可以用黑素細胞和角質(zhì)形成細胞來接種。當培養(yǎng)肝時，三維基質(zhì)可以用肝細胞來接種。當培養(yǎng)胰腺時，三維基質(zhì)可以用胰腺內(nèi)分泌細胞來接種。對于可以用于從各種組織獲得實質(zhì)細胞的方法的綜述，參見，F(xiàn)reshney, Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Technique,第 2 版，A.R.Liss, Inc.，New York, 1987，第 20 章,第 257-288 頁。
[0190]實際上，在接種之前沉積在基質(zhì)基體上的不同比例的各種類型膠原可以影響稍后接種的組織特有細胞的生長。例如，為了造血細胞的最佳生長，基質(zhì)應(yīng)優(yōu)選地在初始基質(zhì)中包含6:3:1的近似比率的膠原類型II1、IV和I。對于三維皮膚培養(yǎng)系統(tǒng)，膠原類型I和III優(yōu)選地被沉積在初始基質(zhì)中。被沉積的膠原類型的比例可以通過選擇加工適當?shù)哪z原類型的成纖維細胞來操縱或增強。這可以使用能夠激活補體且界定特定的膠原類型的適當?shù)耐N型或亞綱的單克隆抗體來完成。這些抗體和補體可以用于不利地選擇表達所需的膠原類型的成纖維細胞?？蛇x擇地，用于接種基質(zhì)的基質(zhì)細胞可以是合成所需的適當?shù)哪z原類型的細胞的混合物。表1中示出各種類型的膠原的分布和來源。
`[0191]表1[0192]
【權(quán)利要求】
1.一種用于制備經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的工藝，所述工藝包括: (a)在足以滿足使細胞在體外生長所需要的營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞以形成經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基和從經(jīng)培養(yǎng)的細胞除去所述經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基； (b)培養(yǎng)酵母細胞； (C)將所述酵母細胞暴露于所述經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基； (d)培養(yǎng)所述酵母細胞以使所述經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基的至少一部分代謝，和； (e)收集經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其 中將步驟(e)的所述收集的經(jīng)代謝的經(jīng)調(diào)節(jié)的生長培養(yǎng)基濃縮、過濾和/或純化。
【文檔編號】C12N1/16GK103820336SQ201310560083
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月12日
【發(fā)明者】J·V·格魯伯, S·饒, R·梅塔, S·蒿蒂 申請人:阿勒根公司, 奧麒個人護理產(chǎn)品公司