感染中四小麥條銹菌新菌系t4的快速分子檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種感染“中四”小麥條銹菌新毒性菌系T4的快速分子檢測(cè)方法，利用189條RAPD隨機(jī)引物在新菌系T4和我國(guó)小麥條銹菌流行菌系CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4以及感染抗條銹病基因Yr26的新菌系V26之間篩選，得到兩個(gè)T4的特異性RAPD標(biāo)記S1311和S1363，將特異性條帶經(jīng)過(guò)回收、純化、克隆、測(cè)序后，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)SCAR引物，成功地將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記T4SP8-1/T4SP8-2（序列為5′GGGCGTGGATGAAGAG3′/5′GGAGCAGAAGCAGGTTT3′）。該標(biāo)記可以在700bp處穩(wěn)定的擴(kuò)增出新菌系T4的特異性條帶。利用本發(fā)明開(kāi)發(fā)的新菌系T4的特異性SCAR標(biāo)記T4SP8-1/T4SP8-2可以實(shí)現(xiàn)大田中T4新菌系的早期快速分子檢測(cè)，了解病菌的變異動(dòng)態(tài)，為監(jiān)測(cè)該菌系及小麥條銹病的防治決策提供可靠的技術(shù)保障和理論依據(jù)。
【專利說(shuō)明】感染中四小麥條銹菌新菌系T4的快速分子檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)中的PCR (Polymerase Chain Reaction)技術(shù)、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)和 SCAR (Sequence Characterized AmplifiedRegions )分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)對(duì)感染小麥條銹菌鑒別寄主和重要抗源“中四”的小麥條銹菌新菌系T4特異性分子標(biāo)記的篩選，開(kāi)發(fā)的一種利用SCAR標(biāo)記在小麥發(fā)病早期快速檢測(cè)新毒性菌系T4的新方法；
【背景技術(shù)】
[0002]小麥條銹病是由小麥條銹菌striformis f.sp.tri(ici)引起的氣傳葉部病害，是世界范圍內(nèi)小麥上最重要的病害之一。我國(guó)是小麥條銹病發(fā)生的重災(zāi)區(qū)，主要分布于西北、西南、華北、淮北等地冬麥區(qū)和西北春麥區(qū)。在流行年份可使小麥減產(chǎn)20-30%,特大流行年份減產(chǎn)50%以上，甚至絕收。1950、1964、1990和2002年4次全國(guó)范圍內(nèi)大流行分別給我國(guó)小麥生產(chǎn)造成60億、32億、18億和13億公斤的產(chǎn)量損失。2002年以來(lái)，由于小麥條銹菌新小種條中32號(hào)(CYR32)和條中33號(hào)(CYR33)的相繼出現(xiàn)和擴(kuò)展，導(dǎo)致小麥條銹病在我國(guó)部分地區(qū)連年成災(zāi)，年均發(fā)生面積6000萬(wàn)畝左右，損失小麥10億公斤以上； 利用抗病品種是防治該病最有效、經(jīng)濟(jì)和對(duì)環(huán)境安全的措施。然而由于小麥條銹菌的高度變異性，抗病品種在大面積推廣應(yīng)用后其抗病性很容易被條銹菌新小種所克服，一般3-5年便會(huì)“喪失”抗病性。新的病菌毒性小種的產(chǎn)生和發(fā)展是引致小麥品種抗條銹性“喪失”的主要原因。由于條銹菌新小種的出現(xiàn)并成為優(yōu)勢(shì)小種，常常造成生產(chǎn)上大面積推廣品種“喪失”抗銹性，導(dǎo)致條銹病大流行。自1950年以來(lái)，我國(guó)先后發(fā)生7-8次大面積主栽品種“喪失”抗銹性而被更替。因此，監(jiān)測(cè)條銹菌新毒性小種的出現(xiàn)，并對(duì)其毒性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)，尋求簡(jiǎn)單、便捷、快速的檢測(cè)方法，對(duì)于超前預(yù)測(cè)新小種在未來(lái)病害發(fā)展中的作用以及有針對(duì)性的進(jìn)行抗條銹育種，實(shí)現(xiàn)病害的持續(xù)控制均具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義；
“中四”是中國(guó)小麥條銹菌生理小種重要鑒別寄主之一，是以普通小麥斤訂aestivum L.( 2n = 6x =42, AABBDD)與中間偃麥草應(yīng) intermedium = 6x
=42，E1E1E2E2XX)經(jīng)有性雜交、選育獲得的異源八倍體小偃麥(AABBDDXX)。具有綜合農(nóng)藝性狀突出、結(jié)實(shí)正常、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)。是多種小麥病害的抗源，尤其對(duì)我國(guó)小麥條銹菌現(xiàn)有所有已知生理小種或致病類型均表現(xiàn)免疫。已成為國(guó)內(nèi)外小麥育種的重要種質(zhì)資源，近年來(lái)以“中四”為親本相繼選育出了數(shù)十個(gè)生產(chǎn)品種或高代品系；
2003年，本課題組從采自陜西省寶雞市太白縣嘴頭鎮(zhèn)小麥品種寶麥I號(hào)田間條銹病自然發(fā)病葉片上分離到能夠穩(wěn)定感染“中四”的新毒性菌系T4，這是我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)能穩(wěn)定感染“中四”的條銹菌新菌系。隨著“中四”小麥作為抗銹資源被廣泛應(yīng)用，我國(guó)未來(lái)將會(huì)培育出以“中四”為抗源背景的一大批抗銹性品種，這些品種作為新的抗銹性品種將被大面積推廣和應(yīng)用。而T4新菌系的出現(xiàn)無(wú)疑對(duì)于以“中四“為血緣的小麥品種的大面積推廣應(yīng)用造成潛在的威脅。因此，監(jiān)測(cè)能夠感染“中四”的小麥條銹菌新菌系T4的變化動(dòng)態(tài)，對(duì)于超前預(yù)測(cè)新菌系的變異動(dòng)態(tài)、指導(dǎo)抗銹育種以及品種合理布局具有重要意義；
然而，傳統(tǒng)的利用鑒別寄主檢測(cè)方法具有工作量大、周期長(zhǎng)、難以進(jìn)行大量標(biāo)樣鑒定、準(zhǔn)確性也易受人員、鑒定條件等外界因素的影響等缺點(diǎn)。而且病菌檢測(cè)往往只有等小麥發(fā)病后才能采集葉片進(jìn)行鑒定檢測(cè)，具有一定滯后性，不適于病菌小種的早期檢測(cè)。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、簡(jiǎn)便、高效的分子檢測(cè)方法能夠克服傳統(tǒng)方法的弊端，對(duì)于該菌系的早期檢測(cè)和病害控制具有重大意義；

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明的目的是針對(duì)傳統(tǒng)利用鑒別寄主法鑒定新毒性小種技術(shù)存在的缺陷和不足，提供一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)小麥條銹菌新毒性菌系T4的分子檢測(cè)方法；
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的技術(shù)方案是一種快速檢測(cè)小麥條銹菌新菌系T4的分子檢測(cè)方法，包括以下步驟:
1.小麥條銹菌新毒性菌系T4特異性引物的篩選和設(shè)計(jì)
采用189條RAPD隨機(jī)引物對(duì)T4進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，篩選出該菌系的特異性條帶S1311和S1363。用DNA純化回收試劑盒對(duì)特異性條帶進(jìn)行回收、純化，然后用pGM-T克隆試劑盒進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆。將帶有目標(biāo)插入片段的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)并將特異性RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記；
2.小麥條銹菌新毒性菌系T4分子檢測(cè)體系的建立
(1)提取條銹菌夏孢子基因組DNA
采用 CTAB/SDS 法提取 T4、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Sull-4、V26 等條銹菌夏孢子的基因組DNA ；
(2)用RAPD分子標(biāo)記進(jìn)行T4特異性引物的篩選
采用 189 條 RAPD 隨機(jī)引物對(duì) T4、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Sull-4、V26 等條銹菌菌系進(jìn)行擴(kuò)增。RAPD 反應(yīng)體系為 15乩:10XReaction Bufferl.5ML、MgCl2 (25mmol/L)
1.2ML、dNTPs (10mmol/L ) 0.3ML、Taq DNA 聚合酶(5 U/ML，F(xiàn)ermentas 公司)0.08ML、弓丨物(10ng/ML) 0.6ML、模板 DNA (50ng/ML) 1ML、ddH20 10.32ML。每次反應(yīng)均設(shè)無(wú)菌去離子水為陰性對(duì)照。擴(kuò)增反應(yīng)在伯樂(lè)S1000 PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 5min ；94°C 30s, 35°C 40s, 72°C 90s，44 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;4°C終止。擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.5% 瓊脂糖凝膠、I X TAE電泳緩沖液電泳分離，以ULTRA-URLET PRODUCTS凝膠成像系統(tǒng)記錄分析RAPD譜型；
結(jié)果:RAPD引物S1311和S1363分別在1000bp和850bp處能穩(wěn)定擴(kuò)增出T4的特異性條帶；
(3)采用DNA純化回收試劑盒對(duì)特異性條帶回收純化
利用DNA純化回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)對(duì)T4的特異性條帶進(jìn)行回收純化；
(4)利用藍(lán)白斑篩選法克隆目的條帶，然后對(duì)目的條帶進(jìn)行測(cè)序
采用PGM-T克隆試劑盒(北京天根生化有限公司)進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，每個(gè)克隆反應(yīng)挑取10個(gè)單克隆提取質(zhì)粒DNA對(duì)純化得到的條帶進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)插入片段的大小。通過(guò)藍(lán)白斑篩選克隆到目的條帶后，取新鮮菌液送北京奧克鼎盛生物技術(shù)有限公司用測(cè)序引物M13R和M13F進(jìn)行雙向測(cè)序；
(5)SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化
依據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)出SCAR標(biāo)記T4SP8-1/T4SP8-2能在T4和其他菌系間穩(wěn)定擴(kuò)增出T4的特異性條帶。T4SP8-1/T4SP8-2引物序列如下:
T4SP8-1: 5' GGGCGTGGATGAAGAG 3'
T4SP8-2: 5' GGAGCAGAAGCAGGTTT 3'
該引物 15 ii L 反應(yīng)體系包括:10 X Reaction Buffer 1.5 y UMgCl2 (25mmol/L)0.9ML、dNTPs (10mmol/L ) 0.3ML、上下游引物(10ng/ML)各 1.0ML、模板 DNA (50ng/ML) 1.5ML、Taq DNA聚合酶(5U/ML, Fermentas公司)0.15ML、ddH20 8.65ML。設(shè)無(wú)菌去離子水為陰性對(duì)照。擴(kuò)增反應(yīng)在伯樂(lè)S1000 PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)擴(kuò)增5min;94°Clmin,50.5°C lmin,72°C 90s，34 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 IOmin ;4°C終止。擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.5% 瓊脂糖凝膠、I X TAE電泳緩沖液電泳分離，以ULTRA-URLET PRODUCTS凝膠成像系統(tǒng)記錄分析RAPD譜型；
結(jié)果:SCAR標(biāo)記T4SP8-1/T4SP8-2大約在700bp處能穩(wěn)定擴(kuò)增出T4的特異性條帶；本發(fā)明所開(kāi)發(fā)的特異性SCAR標(biāo)記對(duì)小麥條銹菌新毒性菌系T4具有很高的特異性，能夠用于提前預(yù)測(cè)田間小麥條銹菌侵染是否是由毒性菌系T4所致，可明顯區(qū)別小麥條銹菌不同生理小種，如目前條銹菌流行菌系CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Sull-4以及感染抗條銹病基因Yr26的新菌系V26等；
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0004]圖1: RAPD隨機(jī)引物S1363擴(kuò)增出的小麥條銹菌新毒性菌系T4的特異性條帶，泳道 1-8 分別為 DL2000 marker、新菌系 T4、Sull-4, V26、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33
圖2:新開(kāi)發(fā)的SCAR標(biāo)記T4SP8-1`/T4SP8-2擴(kuò)增出的小麥條銹菌新毒性菌系T4的特異性條帶，泳道 1-8 分別為 DL2000 marker、新菌系 T4、Sull-4, V26、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33
【具體實(shí)施方式】
[0005]實(shí)施案例
1.樣品米集
2013年9月30日，在西北農(nóng)林科技大學(xué)太白小麥條銹病試驗(yàn)站，分別采集接種過(guò)條銹菌T4、Sull-4、V26、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33但未顯癥的小麥葉片標(biāo)樣，去離子水沖洗小麥葉片，-80°C保存?zhèn)溆茫?br> 2.小麥條銹菌新毒性菌系T4的分子檢測(cè)
(1)采用CTAB法提取小麥葉片樣本基因組DNA；
(2)PCR擴(kuò)增:15 ii L 反應(yīng)體系包括:10XReaction Buffer 1.5 u L,MgCl2(25mmol/L)
0.9ML、dNTPs (10mmol/L ) 0.3ML、Taq DNA 聚合酶(5U/ML，F(xiàn)ermentas 公司)0.15ML、上下游引物(10ng/ML)各 1.0ML、模板 DNA (50ng/ML) 1.5ML、ddH20 8.65ML。設(shè)無(wú)菌去離子水為陰性對(duì)照。擴(kuò)增反應(yīng)在伯樂(lè)S1000 PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 5min ；94°Clmin,50.5°C lmin，72°C 90s，34 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;4°C終止；(3)條帶檢測(cè):PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠、I X TAE電泳緩沖液電泳分析，電泳結(jié)束后用ULTRA-URLET PRODUCTS凝膠成像系統(tǒng)記錄分析；
3.檢測(cè)結(jié)果
接種條銹菌新毒性菌系T4的5個(gè)小麥標(biāo)樣在700bp處均擴(kuò)增出了特異性條帶，而接種其它條銹菌小種葉片、未接種葉片和清水對(duì)照等處理在該位置處均沒(méi)有出現(xiàn)T4的特異性條帶。研究結(jié)果表明，該檢測(cè)體系能夠在小麥條銹菌田間侵染早期檢測(cè)田間帶菌是否是由新毒性菌系T4侵染引起。
【權(quán)利要求】
1.小麥條銹菌新毒性菌系T4的特異性RAPD標(biāo)記的篩選和特異性引物的設(shè)計(jì)，其特征在于: 根據(jù)小麥條銹菌新菌系T4 DNA序列的特性，篩選到兩個(gè)特異性RAPD標(biāo)記S1311 (5/CTGCCACGAG 3')和S1363 (5' GGCTGTGTGG 3')，利用這兩個(gè)引物能穩(wěn)定的擴(kuò)增出條銹菌T4的特異性條帶，經(jīng)過(guò)對(duì)特異性條帶進(jìn)行回收、純化、克隆并測(cè)序，其特異性條帶的長(zhǎng)度分別為999bp和821bp:據(jù)此，設(shè)計(jì)并開(kāi)發(fā)特異性SCAR引物，成功地將特異性RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為小麥條銹菌新菌系T4穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記； 特異性SCAR標(biāo)記的堿基序列:
T4SP8-1:5/ GGGCGTGGATGAAGAG 3'
T4SP8-2:5/ GGAGCAGAAGCAGGTTT 3'。
2.小麥條銹菌新毒性菌系T4快速分子檢測(cè)體系的建立，權(quán)利要求1所述必須遵循以下程序: X提取田間小麥葉片或采集的小麥條銹菌夏孢子基因組DNA ；t:利用以下優(yōu)化體系進(jìn)行擴(kuò)增:15 U L反應(yīng)體系分別在PCR中依次加入:10XReaction Buffer 1.5 u L>25mmol/L 的 MgCl2 0.9ML、lOmmol/L dNTPs 0.3M-L> lOng/M-L的 T4SP8-1 和 T4SP8-2 引物各 1.0ML、50ng/ML 模板 DNA 1.5ML、5U/ML 的 Taq DNA 聚合酶(Fermentas公司)0.15ML、最后用無(wú)菌ddH20補(bǔ)齊至I5ML ； 離心IOSecJf PCR管放入PCR儀中擴(kuò)增； 擴(kuò)增反應(yīng)在伯樂(lè)S1000 PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)擴(kuò)增5min;然后940C I min、50.5 V I min、72°C 90 sec，共 34 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 10 min，4°C終止反應(yīng)，擴(kuò)增完成； PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠、IXTAE電泳緩沖液電泳分析，電泳結(jié)束后用ULTRA-URLET PRODUCTS凝膠成像系統(tǒng)記錄分析；大約在700bp處出現(xiàn)毒性菌系T4的特異性條帶。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK103667451SQ201310563758
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】李強(qiáng), 王保通, 樊玉 申請(qǐng)人:李強(qiáng), 王保通, 西北農(nóng)林科技大學(xué)