一種用于豬病診斷的三重連接探針擴增檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物，三重同步核酸定性檢測試劑，三重連接探針擴增檢測方法。本發(fā)明針對三種病毒核酸的特異性探針雜交后的連接產物進行PCR擴增，能夠同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒等三種混合感染的常見病原，這種多重驗證結點集成一體化設計極大提高了檢測結果的特異性與可靠性，本發(fā)明對原有的多重連接探針擴增檢測技術的關鍵參數進行了調整，使檢測效率顯著提高的同時也降低了檢測成本。
【專利說明】一種用于豬病診斷的三重連接探針擴增檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物核酸分子檢測【技術領域】，特別涉及一種新技術的新領域應用，SP豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒核酸同步多重連接擴增技術檢測方法。 【背景技術】
[0002]動物檢驗檢疫問題成為了近些年國際社會關注的熱點問題,我國加入WTO已逾十年，考慮到技術性貿易壁壘問題與輸入性傳染病風險問題，每年我國對大量進出口畜牧產品的衛(wèi)生質量要求越來越高,要求檢測項目也越來越多，如各種致病性病原體以及人獸共患病病原體等。同時為了確保食品衛(wèi)生安全、保護國民健康安全，必須加強在源頭上對畜產品進行安全性檢測。目前應用于豬患病毒性傳染病的檢測方法有以下幾種:聚合酶鏈式反應(PCR)、病毒分離培養(yǎng)鑒定法、電鏡觀察、酶聯免疫吸附試驗、免疫熒光試驗等。現實中臨床上發(fā)病豬往往以多種病毒混合感染為主，上述方法檢測通量低成本高，操作不便，不利于同時多批量多重感染病原體的檢測。
[0003]多重連接擴增技術(multiplexligation-dependent probe amplification,MLPA)由荷蘭的Dr.Schouten JP于2002年發(fā)明，最初僅應用于醫(yī)學檢測目的，目前MLPA技術已應用于多種領域的研究及基因診斷，如單核苷酸多態(tài)性(SNP)和基因突變檢測、染色體數目異常、遺傳疾病基因缺失重復、基因甲基化檢測、抑癌基因診斷及mRNA分析等。由于MLPA操作簡便、成本低廉、應用領域廣，這幾年來，已有超過上百篇的研究報告發(fā)表，但是在動物疫病檢測領域的應用尚無報道。
[0004]MLPA是將核酸的雜交檢測和PCR鏈式擴增相結合，從而實現靶分子的高效特異性分析。其核心的技術是合成序列特異的長探針和短探針。短探針由兩段核苷酸組成，一段是PCR擴增的通用引物，一段是病毒序列特異的探針。長探針由三段核苷酸組成，除了 PCR擴增的通用引物互補序列和病毒特異性序列外，在兩者之間還加入特定大小的填充序列(指紋序列)。當MLPA的兩種探針結合到彼此相鄰的靶序列上的時候，在連接反應時，長探針就和短探針發(fā)生連接，生成一條兩端分別含有上下游通用引物的全長探針，并在通用引物的擴增之下，使模板成鏈式放大，實現靶分子的高靈敏度檢測，其檢測極限可達3000-6000個靶分子拷貝。
[0005]MLPA并不是擴增病毒特異的靶序列，而是擴增與病毒靶序列結合的探針，換句話說，首先是給每種病毒特異的探針加入特定大小的指紋序列，然后通過通用引物將不同的“指紋”擴增表現出來，最后通過對“指紋”的分析，實現多種核酸的檢測，同時序列特異的兩段探針確保了每種病原的指紋具有高度的特異性。MLPA利用核酸雜交、連接反應和PCR擴增反應，可以在同一試管內檢測多達45種不同核酸序列拷貝數變化。
[0006]該技術主要包括:探針與靶序列的雜交、探針的特異化連接、連接探針的擴增和結果的檢測分析。針對每一個待測靶基因序列，均有一對MLPA探針，其一般由一個短的寡核苷酸片段(短探針)和一個長的寡核苷酸片段(長探針)組成。該技術的特色之一是僅擴增連接完好的探針，而不是擴增樣本靶序列。該技術的擴增環(huán)節(jié)僅需兩條引物，即通用引物UPl和UP2。在所有短探針的5’端均有一段共同序列，該序列與引物UPl的核酸序列相同；在所有長探針的3’端均有一段共同序列，該序列與引物UP2的核酸序列互補?？梢?，所有連接探針的PCR擴增用的是同一對引物。若兩探針連接，則擴增可進行；而若兩探針未連接，則擴增無法進行。各長探針在共同序列和與靶序列互補的序列間有不同長度的填充片段，該片段長度不同使連接后的MLPA探針長度不同，故其擴增片段長度亦不同。一般相臨兩產物的長度相差6~8bp，因此可同時檢測基因組的多種不同靶基因。擴增后進行結果檢測分析比對，得出結論。
【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種能同步檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒核酸的高特異性檢測方法。所述的多重同步核酸定性檢測方法的探針為選自以下病毒的特征片段:豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)和豬偽狂犬病毒(PRV)0本發(fā)明能夠同時檢測三種常見豬混感病毒包括兩種RNA病毒和一種DNA病毒，特異性極高。
[0008]本發(fā)明的一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物，包括如下的序列組:
[0009]I)針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因的探針
[0010]左翼探針Probel05L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTGGCGCTACTCTTGTACCAGATA 3’
[0011]右翼探針Probel05R:5’TACCAACTTCCTTCTGGACACTGTGCCAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’
[0012]2)針對豬瘟病毒E2基因的探針
[0013]左翼探針Probel25L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACA 3’
[0014]右翼探針Probel25R:5’ GCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTGC CAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3，
[0015]3)針對豬偽狂犬病毒TK基因的探針
[0016]左翼探針Probel50L:5’TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGCCAGCAAGATCCAATCTCCTGCGCAACGTCTACGCCAT 3’
[0017]右翼探針Probel50R:5’ GCTGGTCAACACGTCGCGCTACCTGAGGTGCCAGCAAGATCCAAT CTGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3，
[0018]4)通用引物
[0019]正向引物UPl:5' TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT 3'
[0020]反向引物UP2:5' GTGGTATTGGATCGTGCAGAGA 3'
[0021]所述右翼探針的5’端經過磷酸化修飾。
[0022]所述5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT與通用的正向引物UPl序列相同；所述TCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’與通用的反向引物UP2序列反向互補。
[0023]本發(fā)明的一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的三重同步核酸定性檢測試劑，包括MLPA雜交液、MLPA連接液、PCR反應液、RNA/DNA共提液、RT反應液、陽性對照品、陰性對照品、探針混合液、通用引物混合液、氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC處理水；
[0024]MLPA 雜交液包括 SALSA MLPA buffer ；
[0025]MLPA 連接液包括 Ligase_65buffer A, Ligase_65buffer B, Ligase-65 連接酶；
[0026]PCR 反應液包括 2 X Taq Master Mix ；
[0027]RNA/DNA共提液包括苯酚、8_羥基喹啉、異硫氰酸胍、β -巰基乙醇；
[0028]RT 反應液包括 M-MLV5 X Reaction Buffer,200U M-MLV 反轉錄酶、2000U RNase 抑制劑、IOmM dNTP Mix ；
[0029]陽性對照品為含1.0X 108COpy/ml濃度的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因、豬瘟病毒基因E2基因以及豬偽狂犬病毒TK基因的DNA片段；
[0030]陰性對照品為不含高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因、豬瘟病毒E2基因以及豬偽狂犬病毒TK基因的pSURE-Τ重組質粒；
[0031]探針混合液為權利要求1所述的左翼探針、右翼探針；
[0032]通用引物混合液為權利要求1所述的UPl與UP2的混合液。
[0033]所述PCR 反應液是由 Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs 以及 PCR 穩(wěn)定劑和增強劑組成的預混體系，濃度為2X，預配好的PCR混合液中加入了溴芬藍染料(藍色)，反應結束后可直接進行電泳檢測；75%乙醇需使用DEPC處理水配制。
[0034]本發(fā)明的一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的三重連接探針擴增檢測方法，有以下步驟:
[0035]1)將疑似已經感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的發(fā)病豬或死亡豬尸體內的血液、分泌液體以及淋巴結樣品進行核酸提取處理，得到待測樣品；
[0036]2)將待測樣品進行同步反轉錄處理，得到待雜交檢測模板；
[0037]3)將待雜交檢測模板與探針進行雜交處理，得到雜交產物；
[0038]4)將雜交產物進行連接處理，得到連接產物；
[0039]5)將連接產物進行PCR反應處理，得到擴增產物；
[0040]6)將擴增產物進行瓊脂糖凝膠核酸電泳處理，隨后進行凝膠成像分析得到檢測結
果O
[0041 ] 本發(fā)明相比現有技術的有益效果為:1、本發(fā)明能夠同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒等三種混合感染的常見病原。2、本發(fā)明采用針對三種病毒核酸的特異性探針雜交后的連接產物進行PCR擴增，相當于利用了傳統PCR技術校對了長、短探針與目的基因是否同時正確雜交以及二者是否正確連接，這種多重驗證結點集成一體化設計極大提高了檢測結果的特異性與可靠性。3、本發(fā)明約束了原有的多重連接探針擴增檢測技術(MLPA)的擴增譜，以長探針中加入的特定指紋序列為標尺，使擴增后的探針連接產物經凝膠電泳后即可方便地進行結果的判定。4、本發(fā)明針對原有的多重連接探針擴增檢測技術(MLPA)的關鍵參數進行了調整，使檢測效率顯著提高的同時也降低了檢測成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1是MLPA技術原理示意圖；
[0043]圖2是MLPA電泳檢測結果圖。【具體實施方式】
[0044]為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明實施方式做進一步的詳細描述。
[0045]實施例:
[0046]1.用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物的設計與合成
[0047]選擇高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因、豬瘟病毒E2基因以及豬偽狂犬病毒TK基因作為檢測目標基因，通過美國國家生物技術信息中心(NCBI) (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov)，選擇并下載有代表性的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因40條序列、豬瘟病毒基因E2基因40條序列以及豬偽狂犬病毒TK基因20條序列，使用MAGA5.0軟件進行比對分析，在基因區(qū)選擇一段相對保守序列如下所示:
[0048]N0.1 PRRSV ORF5 gene
[0049]5’ GGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTGTGCCAGCAAGATCCAATC 3’ ；
[0050]N0.2 CSFV E2 gene
[0051]5’
[0052]TGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTGCCAGCAAGAT CCAAT 3，；
[0053]N0.3PRV TK gene
[0054]5，
[0055]TGCCAGCAAGATCCAATCTCCTGCGCAACGTCTACGCCATGCTGGTCAACACGTCGCGCTACCTGAGGTGCCAGCAAG ATCCAATCTGTGCCAGCAAGATCCAATCTG 3’
[0056]人工合成引物及 探針如下表:
[0057]
【權利要求】
1.一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物，其特征在于，包括如下的序列組: 1)針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因的探針
左翼探針 Probel05L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTGGCGCTACTCTTGTACCAGATA 3’右翼探針 Probel05R:5’ TACCAACTTCCTTCTGGACACTGTGCCAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’ 2)針對豬瘟病毒E2基因的探針
左翼探針 Probel25L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACA 3’
右翼探針 Probe 125R:5’ GCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTGC CAGCAAGATCCAATCTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3， 3)針對豬偽狂犬病毒TK基因的探針 左翼探針 Probel50L:5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTTTGCCAGCAAGATCCAATCTCCTGCGCAACGTCTACGCCAT 3’
右翼探針 Probe 150R:5’ GCTGGTCAACACGTCGCGCTACCTGAGGTGCCAGCAAGATCCAAT CTGTGCCAGCAAGATCCAATCTGTCTCTGCACGATCCAATACCAC 3， 4)通用引物
正向引物 UP1: 5' TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT 3'` 反向引物 UP2:5' GTGGTATTGGATCGTGCAGAGA 3'。
2.根據權利要求1所述的一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物，其特征在于:所述右翼探針的5’端經過磷酸化修飾。
3.根據權利要求1所述的一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的靶核酸的探針和引物，其特征在于:所述5’ TGGTTCGCTTAGGGTTGGTT與通用的正向引物UPl序列相同；所述TCTCTGCACGATCCAATACCAC 3’與通用的反向引物UP2序列反向互補。
4.一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的三重同步核酸定性檢測試劑，其特征在于:包括MLPA雜交液、MLPA連接液、PCR反應液、RNA/DNA共提液、RT反應液、陽性對照品、陰性對照品、探針混合液、通用引物混合液、氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC處理水； MLPA 雜交液包括 SALSA MLPA buffer ； MLPA 連接液包括 Ligase_65buffer A, Ligase_65buffer B, Ligase-65 連接酶； PCR 反應液包括 2 X Taq Master Mix ； RNA/DNA共提液包括苯酚、8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇； RT反應液包括M-MLV5XReaction Buffer,200U M-MLV反轉錄酶、2000U RNase抑制劑、IOmM dNTP Mix ； 陽性對照品為含1.0X 108COpy/ml濃度的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因、豬瘟病毒基因E2基因以及豬偽狂犬病毒TK基因的DNA片段； 陰性對照品為不含高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因、豬瘟病毒E2基因以及豬偽狂犬病毒TK基因的pSURE-T重組質粒； 探針混合液為權利要求1所述的左翼探針、右翼探針；通用引物混合液為權利要求1所述的UPl與UP2的混合液。
5.根據權利要求4所述的一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的三重同步核酸定性檢測試劑，其特征在于:所述PCR反應液是由Taq DNAPolymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增強劑組成的預混體系，濃度為2X，預配好的PCR混合液中加入了溴芬藍染料，反應結束后可直接進行電泳檢測；75%乙醇需使用DEPC處理水配制。
6.一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的三重連接探針擴增檢測方法，其特征在于有以下步驟: 1)將疑似已經感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒以及豬偽狂犬病毒的發(fā)病豬或死亡豬尸體內的血液、分泌液體以及淋巴結樣品進行核酸提取處理，得到待測樣品； 2)將待測樣品進行同步反轉錄處理，得到待雜交檢測模板； 3)將待雜交檢測模板與探針進行雜交處理，得到雜交產物； 4)將雜交產物進行連接處理，得到連接產物； 5)將連接產物進行PCR反應處理，得到擴增產物； 6)將擴增產物進行瓊脂糖`凝膠核酸電泳處理，隨后進行凝膠成像分析得到檢測結果。
【文檔編號】C12N15/11GK103555861SQ201310564210
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權日:2013年11月11日
【發(fā)明者】高慎陽, 周鐵忠, 查恩輝, 董筱萍, 遲陽 申請人:遼寧醫(yī)學院