環(huán)境微生物快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)境微生物的檢測(cè)方法。１）微生物收集，微生物收集自空氣濾網(wǎng)，２）微生物基因組提取，３）細(xì)菌16SrDNA擴(kuò)增，真菌18SrDNA擴(kuò)增，４）rDNA測(cè)序，５）數(shù)據(jù)分析，包括去污染序列、低質(zhì)量序列，歸并高相似度序列，序列注釋；６）建立該環(huán)境細(xì)菌數(shù)據(jù)庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息；和該環(huán)境真菌數(shù)據(jù)庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息。本發(fā)明尤其適于對(duì)潔凈區(qū)環(huán)境微生物進(jìn)行普查，較常規(guī)基于培養(yǎng)的檢測(cè)技術(shù)更加快捷、準(zhǔn)確、靈敏，檢測(cè)成本和時(shí)間大幅度降低，顯著提高微生物污染監(jiān)測(cè)和控制能力。另一方面，基因測(cè)序數(shù)據(jù)還提供了微生物分子水平的標(biāo)記，對(duì)于追溯和判斷微生物來源，準(zhǔn)確識(shí)別污染源具有重要價(jià)值。
【專利說明】環(huán)境微生物快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001 ] 本發(fā)明涉及一種環(huán)境微生物的檢測(cè)方法，可提高微生物的檢測(cè)范圍、節(jié)省檢測(cè)費(fèi)用、大幅度縮短檢測(cè)時(shí)間。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物是自然界分布最廣泛、數(shù)量最大的一類生物。它們個(gè)體微小、繁殖速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)。一些微生物經(jīng)消化道入侵人體，比如說沙門氏菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌等，它們可造成胃腸道疾病，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成肝、腦、腎臟器損害，甚至死亡。而霉菌的危害在于它所產(chǎn)生的毒素，比如黃曲霉毒素、伏馬菌素等，它們的毒性很強(qiáng)，具有很強(qiáng)的致癌性。另外，微生物及熱原若通過粘膜或血管直接侵入人體，將對(duì)人體健康造成更嚴(yán)重、更直接的危害。因此，在食品及藥品制造過程中，防范微生物污染至關(guān)重要。
[0003]目前，食品和制藥工業(yè)普遍采用潔凈技術(shù)對(duì)生產(chǎn)環(huán)境中的懸浮微粒、微生物、有毒有害氣體進(jìn)行控制。為同時(shí)確保潔凈區(qū)人員的正?；顒?dòng)，亦須使空氣溫度、濕度及壓力在適宜范圍內(nèi)。潔凈廠房及設(shè)施的建造不但要采用不易產(chǎn)塵、便于清潔的建筑材料和結(jié)構(gòu)，而且需對(duì)空氣進(jìn)行調(diào)溫、調(diào)濕和凈化處理，以滿足規(guī)定凈化級(jí)別要求。在這種條件下，生產(chǎn)環(huán)境中最大的產(chǎn)塵源和微生物污染源通常是操作人員、設(shè)備和物料。因此必須使?jié)崈魠^(qū)空氣往復(fù)循環(huán)、動(dòng)態(tài)更新。在潔凈區(qū)，凈化空氣一般來自房間頂部的送風(fēng)口，流經(jīng)操作區(qū)后，攜帶著人員、設(shè)備、設(shè)施和物料脫落的微粒(包括微生物)流向低壓區(qū)域，最后進(jìn)入回風(fēng)口，補(bǔ)充新空氣后，再次進(jìn)入空調(diào)及過濾系統(tǒng)獲得再生。這種有組織的、無紊流的空氣流動(dòng)方式被稱為“單向流”。在回風(fēng)口設(shè)置的濾網(wǎng)，可以攔截室內(nèi)“臟”空氣中懸浮的微生物，真實(shí)完整地反映潔凈區(qū)微生物生態(tài)特征。潔凈技術(shù)不但用于生產(chǎn)活動(dòng)，在食品藥品的檢驗(yàn)，醫(yī)療服務(wù)、科學(xué)研究領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。
[0004]潔凈技術(shù)雖然能極大地降低食品藥品受到微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，但并不是絕對(duì)的無菌環(huán)境，也不能杜絕外來微生物侵入被加工物料和產(chǎn)品。實(shí)際上，食品和口服藥品均允許一定數(shù)量的非致病微生物殘留。即便是無菌藥品，在包裝完成后，通常還要接受滅菌處理。只有非最終滅菌的無菌制品，才要求局部環(huán)境滿足“絕對(duì)無菌”的要求。對(duì)潔凈區(qū)或潔凈室環(huán)境微生物進(jìn)行監(jiān)測(cè)不但是保證產(chǎn)品質(zhì)量的要求，也是國家有關(guān)強(qiáng)制性法規(guī)的要求。潔凈區(qū)實(shí)際上是一個(gè)特殊的生態(tài)環(huán)境，由于人員、設(shè)備、物料和大環(huán)境相對(duì)固定，微生物種群分布相對(duì)穩(wěn)定，但也會(huì)隨季節(jié)、房間消毒措施有規(guī)律地變化。了解微生物的種類及數(shù)量分布信息，掌握其變化規(guī)律，對(duì)于針對(duì)性地防范微生物污染具有重要意義。如生產(chǎn)環(huán)境中是否存在病原微生物；又如在處理淀粉和蛋白質(zhì)含量較高的物料時(shí)，需關(guān)注是否存在某些霉菌；又如在生產(chǎn)熱消毒產(chǎn)品時(shí)，需關(guān)注是否存在耐熱微生物。此外，當(dāng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品受到特定微生物污染時(shí)，生產(chǎn)環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)將幫助技術(shù)人員找到潛在的污染源，進(jìn)而采取有效的預(yù)防措施。另外在微生物檢驗(yàn)時(shí)，環(huán)境而非樣品中的微生物會(huì)造成檢驗(yàn)結(jié)果的失真，如果有檢驗(yàn)環(huán)境背景微生物信息(且具有分子水平的特征信息)，就能對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行甄別。
[0005]然而，我國絕大多數(shù)的食品、藥品生產(chǎn)企業(yè)的微生物檢驗(yàn)?zāi)芰€停留在細(xì)胞水平。這些檢驗(yàn)方法是為適應(yīng)產(chǎn)品放行檢驗(yàn)而建立起來的，在開展微生物污染過程控制的檢驗(yàn)方面普遍存在能力不足的情況。同時(shí)，傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法只能培養(yǎng)環(huán)境中不超過10%的微生物，不僅檢測(cè)時(shí)間長，結(jié)果準(zhǔn)確率差，而且效率低，工作量大。雖然業(yè)界已經(jīng)開發(fā)了一些全自動(dòng)微生物鑒定儀器，但是它們的鑒定范圍受限于已知的微生物數(shù)據(jù)庫。因此傳統(tǒng)方法不能真實(shí)揭示微生物群落的多樣性?？傮w上看，食品藥品工業(yè)對(duì)于微生物污染處于相對(duì)被動(dòng)的地位，不但缺乏對(duì)微生物侵染模式(如微生物種類、數(shù)量和途徑)進(jìn)行調(diào)查的手段，也缺乏量化的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)。實(shí)際生產(chǎn)中一味采用過度消毒(滅菌)措施，不但盲目低效，而且增加了環(huán)境污染和人員安全風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)超標(biāo)產(chǎn)品除了報(bào)廢銷毀，別無它途，也難以對(duì)后續(xù)生產(chǎn)起到指導(dǎo)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為監(jiān)測(cè)潔凈區(qū)微生物的種類和數(shù)量分布情況，提供背景環(huán)境的微生物信息，本發(fā)明提供了一種基于大規(guī)?；驕y(cè)序技術(shù)的環(huán)境微生物快速檢測(cè)方法。
[0007]環(huán)境微生物檢測(cè)方法，所述的環(huán)境為一個(gè)單向空氣流向的環(huán)境，步驟如下:
1)微生物收集，所述的微生物收集自空氣濾網(wǎng)，
2)微生物基因組提取，
3)細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增，真菌18S rDNA擴(kuò)增，
4) rDNA 測(cè)序，
5)數(shù)據(jù)分析,包括去污染序列、低質(zhì)量序列，歸并高相似度序列,序列注釋；
6)建立該環(huán)境細(xì)菌數(shù)據(jù)庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息；和該環(huán)境真菌數(shù)據(jù)庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息。
[0008]優(yōu)選地，所述的環(huán)境為需控制空氣微粒和微生物污染的潔凈區(qū)。
[0009]優(yōu)選地，步驟I )微生物收集的方法如下:定期收取單向流空氣回風(fēng)口的濾網(wǎng)，對(duì)在空氣濾網(wǎng)上的微生物進(jìn)行洗脫后，洗脫液先經(jīng)過紗布進(jìn)行初級(jí)過濾，去除大顆粒干擾物，過濾液再通過0.22 μ m濾膜，最終收集濾膜及其攔截的微生物作為待檢測(cè)樣本。
[0010]優(yōu)選地，步驟2 )微生物基因組提取的方法如下:樣本按照下列方法提取微生物基因組，將收集的微生物離心沉淀后，重懸于無菌PBS中，加入50μ L溶菌酶(10 mg/mL),
6μ L 變?nèi)芫?25000 U/mL), 3 μ L 溶葡球菌酶(4000 U/mL),和 41 μ L ΤΕ50 溶液(10 mMTris.HCL和50 mM EDTA, pH 8.0),37° C消化一小時(shí)；然后加入0.1-mm-直徑的石英砂，在振蕩儀上2100轉(zhuǎn)，振蕩5分鐘，振蕩后提取DNA。
[0011]優(yōu)選地，步驟3 )中，對(duì)于細(xì)菌擴(kuò)增Vl到V3區(qū)域，正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO I)，反向引物序列:TTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO2)，
對(duì)于真菌擴(kuò)V4區(qū)域，正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG (SEQ ID NO 3 )，反向引物序列:ACGGTATCTRATCRTCTTCG (SEQ ID NO 4 )。
[0012]優(yōu)選地，步驟4 )中，rDNA測(cè)序，測(cè)序儀優(yōu)先采用Roche454、Illumina的Miseq,Hiseq 二代測(cè)序儀。
[0013]優(yōu)選地，步驟5)中，對(duì)于拼接完的序列分別提交到greengenes.lbl.gov上的NAST和Bellerophon 3比對(duì)程序，和www.ncb1.nlm.nih.gov上的Nt/Nr庫比對(duì)，過濾掉比對(duì)污染序列，剩余的序列利用BLAST軟件和Greengenes數(shù)據(jù)庫中已知的16S/18S序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，一致性在95%以上的序列注釋為相應(yīng)的系統(tǒng)群，不滿足的則為新的系統(tǒng)群；BLAST序列比對(duì)的具體判斷標(biāo)準(zhǔn)為(a)與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性> 99%，未知菌株鑒定為該種；(b)與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性> 97%，但〈99%，未知菌株鑒定為該屬；(c)如未知菌株序列相似性< 97%，未知菌株不能鑒定為該種或?qū)伲?d)如存在兩個(gè)或兩個(gè)種系以上參照菌株與未知菌株序列相似性^ 99%，且兩者相似性相差< 0.5%，則暫將未知菌株歸為其中相似性較高種系，但不排除未知菌株為另一種的可能性。
[0014]優(yōu)選地，相對(duì)于所述步驟I )搜集的微生物的對(duì)照樣本的收集方法，利用細(xì)菌、真菌培養(yǎng)基，收集了該環(huán)境各個(gè)角落的微生物，包括沉降菌和懸浮菌，將所有的培養(yǎng)基的微生物混合后作為對(duì)照樣本；同時(shí),平板收集的微生物樣本既可以作為對(duì)濾網(wǎng)收集的微生物進(jìn)行有效性評(píng)估，還可以增加微生物的檢測(cè)范圍；濾網(wǎng)收集可以在72小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果，包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物，平板收集晚于濾網(wǎng)收集但得到的菌種可以做進(jìn)一步分析和保藏。
[0015]本發(fā)明的有益效果:在食品和藥品制造行業(yè)，目前仍采用傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的微生物監(jiān)測(cè)方法。菌物采集主要依靠定量空氣浮游菌采樣法、沉降菌法和表面取樣法，需要在潔凈區(qū)多個(gè)位點(diǎn)及多個(gè)時(shí)間采樣。然后分別用適于細(xì)菌和真菌生長的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，要經(jīng)歷疒14天的時(shí)間，才能通過菌落數(shù)量評(píng)價(jià)環(huán)境質(zhì)量。這樣的監(jiān)測(cè)方式不但繁瑣、復(fù)雜，而且對(duì)正常生產(chǎn)會(huì)產(chǎn)生影響，檢驗(yàn)結(jié)果也顯著滯后，且不能精確提供微生物種類信息。
[0016]本發(fā)明提出的基于大規(guī)?；驕y(cè)序技術(shù)的環(huán)境微生物集群分析方法，尤其適于對(duì)潔凈區(qū)環(huán)境微生物進(jìn)行普查，如用于藥品及食品生產(chǎn)和檢驗(yàn)的潔凈廠房或潔凈室、或手術(shù)室。較常規(guī)基于培養(yǎng)的檢測(cè)技術(shù)更加快捷、準(zhǔn)確、靈敏，檢測(cè)成本和時(shí)間大幅度降低，將幫助制藥企業(yè)占據(jù)微生物污染攻防斗爭(zhēng)的主動(dòng)地位，顯著提高微生物污染監(jiān)測(cè)和控制能力。另一方面，基因測(cè)序數(shù)據(jù)還提供了微生物分子水平的標(biāo)記，對(duì)于追溯和判斷微生物來源，準(zhǔn)確識(shí)別污染源具有重要價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0018]圖1是:工作流程圖。
[0019]圖2是:濾網(wǎng)中微生物計(jì)數(shù)結(jié)果。將濾網(wǎng)中收集的微生物涂布在馬鈴薯平板，在48小時(shí)后觀察發(fā)現(xiàn)有較多酵母，未見霉菌?？偩鷶?shù)IO5 Cfu /ml。
[0020]圖3是:可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)結(jié)果。將平板微生物挑取混勻后，涂布在馬鈴薯平板，在48小時(shí)后觀察發(fā)現(xiàn)有較多酵母，未見霉菌，基本與所挑菌落種類一致。
[0021]圖4是:真菌分析維恩圖。表示濾網(wǎng)中的真菌種類完全覆蓋培養(yǎng)皿中的真菌種類。
[0022]圖5是:細(xì)菌分析維恩圖。表示濾網(wǎng)中的細(xì)菌種類能覆蓋絕大多數(shù)完全覆蓋培養(yǎng)皿中的真菌種類。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。
[0024]如圖1所示，本發(fā)明的流程如下: (I)微生物收集
收取回風(fēng)口的空氣濾網(wǎng)，利用無菌PBS對(duì)在濾網(wǎng)上的微生物進(jìn)行洗脫后，洗脫液先經(jīng)過紗布進(jìn)行初級(jí)過濾，去除大顆粒的纖維等干擾物。過濾液再通過0.22 μ m濾膜，最終收集濾膜。作為待檢測(cè)樣本。
[0025](2)微生物基因組提取
兩組樣本，分別按照下列方法提取微生物基因組。將收集的微生物離心沉淀后，重懸于0.5mL無菌PBS中，加入50 μ L溶菌酶(lyzosyme, 10 mg/mL), 6yL變?nèi)芫?mutanolysin, 25000 U/mL; Sigma- Aldrich), 3 μ L 溶葡球菌酶(lysostaphin, 4000U/mL; Sigma- Aldrich),和41 μ L TE50溶液(10 mM Tris.HCL和50 mM EDTA, pH 8.0)，37° C消化一小時(shí)。然后加入0.1-mm-直徑的石英砂，在振蕩儀上2100轉(zhuǎn)，振蕩5分鐘。振蕩后的容易利用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)提取DNA。
[0026](3)細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增，真菌18S rDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增得到不同來源的微生物群落16S/18S rRNA 序列
細(xì)菌檢測(cè)Vl到V3區(qū)域。正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物序列:TTACCGCGGCTGCTGGCAC ；
真菌擴(kuò)增引物X區(qū)域。正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG，反向引物序列:ACGGTATCTRATCRTCTTCG。
[0027]對(duì)于不同來源的樣本，我們用帶有不同Barcode的引物擴(kuò)增，如，對(duì)于某一樣本，我們的擴(kuò)增引物將為:Bact-8F ACAGACAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和 Bact_533RACAGACAGACGGGCGGTGTGTRCA, ACAGACA就為標(biāo)記物，在最終得到的測(cè)序產(chǎn)物中，用于識(shí)別不同來源的樣本。
[0028](4) rDNA測(cè)序:增產(chǎn)物純化，定量后，可采用454高通量測(cè)序儀或者其他類似的二代測(cè)序儀。
[0029](5)對(duì)于測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括去污染序列、低質(zhì)量序列，歸并高相似度序列，序列注釋以及菌種鑒定。
[0030]測(cè)序所得到的結(jié)果將低質(zhì)量的結(jié)果去除后，根據(jù)不同的Barcode對(duì)序列的來源進(jìn)行分類，然后拼接。對(duì)于拼接完的序列分別提交到greengenes.lbl.gov上的NAST和Bellerophon 3比對(duì)程序，和www.ncb1.nlm.nih.gov上的Nt/Nr庫比對(duì)，過濾掉比對(duì)污染序列。剩余的序列利用BLAST軟件和Greengenes數(shù)據(jù)庫中已知的16S/18S序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，一致性在95%以上的序列注釋為相應(yīng)的系統(tǒng)群，不滿足的則為新的系統(tǒng)群。BLAST序列比對(duì)的具體判斷標(biāo)準(zhǔn)為(a )與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性^ 99%，未知菌株鑒定為該種；(b)與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性> 97%，但〈99%，未知菌株鑒定為該屬；(c)如未知菌株序列相似性< 97%，未知菌株不能鑒定為該種或?qū)伲?d)如存在兩個(gè)或兩個(gè)種系以上參照菌株與未知菌株序列相似性^ 99%，且兩者相似性相差< 0.5%，則暫將未知菌株歸為其中相似性較高種系，但不排除未知菌株為另一種的可能性。(e)建立所測(cè)到的微生物的DNA指紋文庫，用于今后的溯源等分析。[0031]6 )建立該環(huán)境細(xì)菌數(shù)據(jù)庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息；和該環(huán)境真菌數(shù)據(jù)庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息。
[0032]實(shí)施例1用測(cè)序方法進(jìn)行空氣濾網(wǎng)微生物鑒定
a、在生物安全柜內(nèi)，用無菌剪刀把每塊濾膜剪成1.8—2.5X4.0-4.5cm，放入無菌大口玻璃瓶內(nèi)，加入約500ml無菌的0.85%生理鹽水，收集洗滌濾膜的菌液。并先用濾布粗過濾，收集的粗濾液。
[0033]b、收集的粗濾液，用0.22Mm的細(xì)菌濾膜抽氣過濾，去濾液，收集濾膜(一旦濾液流出速度慢，就得換過濾膜)，到無菌試劑瓶內(nèi)，加入約100ml無菌的0.85%生理鹽水，用力震蕩洗滌濾膜。
[0034]C、收集濾膜洗脫液，按常規(guī)方法取樣，10倍稀釋法進(jìn)行細(xì)菌，真菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)，并進(jìn)行培養(yǎng)。霉菌未檢出；酵母較多，未計(jì)數(shù)；總菌數(shù)IO5 Cfu /ml。培養(yǎng)結(jié)果如圖2所示:
d、其余的濾膜洗脫液經(jīng)11000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去掉上清液，用少量0.85%生理鹽水洗下沉淀的菌體，裝入1.5ml無菌的離心管內(nèi)，貼上2013-05_q2，放入_20°C冰箱。
[0035]e、將收集的微生物離心沉淀后，重懸于0.5mL無菌PBS中，加入50 μ L溶菌酶(lyzosyme, 10 mg/mL), 6 μ L 變?nèi)芫?mutanolysin, 25000 U/mL; Sigma- Aldrich),
3μ L溶葡球菌酶(lysostaphin, 4000 U/mL; Sigma- Aldrich),和 41 μ L ΤΕ50 溶液(10mM Tris.HCL和50 mM EDTA, pH 8.0),37° C消化一小時(shí)。然后加入0.1im-直徑的石英砂，在振蕩儀上2100轉(zhuǎn)，振蕩5分鐘。振蕩后的容易利用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)提取DNA。
[0036]f、擴(kuò)增得到不同來源的微生物群落16S/18S rRNA序列，采用454高通量測(cè)序儀。
[0037]g、對(duì)于測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、菌種鑒定，結(jié)果如下表1 (真菌，由于18S rDNA鑒定除真菌外，還有動(dòng)物、植物等，但在此不做表述)和表2 (細(xì)菌，主要鑒定到屬，但其序列特征可以保證其很好的溯源性)。
[0038]表1空氣濾網(wǎng)微生物鑒定真菌鑒定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種環(huán)境微生物檢測(cè)方法，其特征在于，所述的環(huán)境為一個(gè)單向空氣流向的環(huán)境，步驟如下: .1 )微生物收集，所述的微生物收集自空氣濾網(wǎng)， . 2)微生物基因組提取， 3)細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增，真菌18S rDNA擴(kuò)增， . 4) rDNA 測(cè)序， .5)數(shù)據(jù)分析,包括去污染序列、低質(zhì)量序列，歸并高相似度序列,序列注釋； .6)建立該環(huán)境細(xì)菌數(shù)據(jù)庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息；和該環(huán)境真菌數(shù)據(jù)庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的環(huán)境為需控制空氣微粒和微生物污染的潔凈區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)微生物收集的方法如下:定期收取單向流空氣回風(fēng)口的濾網(wǎng)，對(duì)在空氣濾網(wǎng)上的微生物進(jìn)行洗脫后，洗脫液先經(jīng)過紗布進(jìn)行初級(jí)過濾，去除大顆粒干擾物，過濾液再通過0.22 μ m濾膜，最終收集濾膜及其攔截的微生物作為待檢測(cè)樣本。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)微生物基因組提取的方法如下:樣本按照下列方法提取微生物基因組，將收集的微生物離心沉淀后，重懸于無菌PBS中，加入50μ L溶菌酶(10 mg/mL), 6 μ L變?nèi)芫?25000 U/mL)，3 μ L溶葡球菌酶(4000 U/mL)，和 41 μ L ΤΕ50 溶液(10 mM Tris.HCL 和 50 mM EDTA, pH 8.0) ,37° C 消化一小時(shí)；然后加入0.1-mm-直徑的石英砂，在振蕩儀上2100轉(zhuǎn)，振蕩5分鐘，振蕩后提取DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，對(duì)于細(xì)菌擴(kuò)增Vl到V3區(qū)域，正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO I)，反向引物序列:TTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO 2)， 對(duì)于真菌擴(kuò)增V4區(qū)域，正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG (SEQ ID NO 3 )，反向引物序列:ACGGTATCTRATCRTCTTCG (SEQ ID NO 4 )。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，rDNA測(cè)序，測(cè)序儀優(yōu)先采用Roche454、Illumina 的 Miseq, Hiseq 二代測(cè)序儀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中，對(duì)于拼接完的序列分別提交到 greengenes.lbl.gov 上的 NAST 和 Bellerophon 3 比對(duì)程序，和 www.ncb1.nlm.nih.gov上的Nt/Nr庫比對(duì),過濾掉比對(duì)污染序列，剩余的序列利用BLAST軟件和Greengenes數(shù)據(jù)庫中已知的16S/18S序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，一致性在95%以上的序列注釋為相應(yīng)的系統(tǒng)群，不滿足的則為新的系統(tǒng)群；BLAST序列比對(duì)的具體判斷標(biāo)準(zhǔn)為(a)與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性> 99%，未知菌株鑒定為該種；(b)與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性> 97%，但〈99%，未知菌株鑒定為該屬；(c)如未知菌株序列相似性< 97%，未知菌株不能鑒定為該種或?qū)伲?d)如存在兩個(gè)或兩個(gè)種系以上參照菌株與未知菌株序列相似性> 99%，且兩者相似性相差< 0.5%，則暫將未知菌株歸為其中相似性較高種系，但不排除未知菌株為另一種的可能性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，相對(duì)于所述步驟I)搜集的微生物的對(duì)照樣本的收集方法，利用細(xì)菌、真菌培養(yǎng)基，收集了該環(huán)境各個(gè)角落的微生物，包括沉降菌和懸浮菌，將所有的培養(yǎng)基的微生物混合后作為對(duì)照樣本；同時(shí)，平板收集的微生物樣本既可以作為對(duì)濾網(wǎng)收集的微生物進(jìn)行有效性評(píng)估，還可以增加微生物的檢測(cè)范圍；濾網(wǎng)收集可以在72小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果，包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物，平板收集晚于濾網(wǎng)收集但得到的菌種可以做 進(jìn)一步分析和保藏。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103627800SQ201310564815
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】陳歡, 劉靂, 郭紅櫻, 張遐耘, 張啟坤, 方序, 錢兵 申請(qǐng)人:浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司