一種重組卡介苗rBCG::Rv3425的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程和卡介苗【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種結(jié)核桿菌的重組卡介苗。目前全球廣泛使用的唯一的結(jié)核病疫苗是BCG。本發(fā)明的重組卡介苗，是將結(jié)核桿菌rv3425基因重組表達(dá)于卡介苗BCG中而構(gòu)建獲得，記為rBCG::Rv3425。這種新的重組卡介苗免疫小鼠后，小鼠外周血中CD4+，CD8+T淋巴細(xì)胞的比例均比BCG組明顯增加，CD4+，CD8+T淋巴細(xì)胞在抗結(jié)核免疫中有重要作用。因此，重組卡介苗rBCG::Rv3425可以用于結(jié)核分枝桿菌的預(yù)防。
【專利說明】—種重組卡介苗rBCG:: Rv3425
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和卡介苗【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種結(jié)核桿菌的重組卡介苗?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]結(jié)核病是世界三大傳染病之一，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，2012年全球新發(fā)860萬結(jié)核病病例，因結(jié)核病死亡人數(shù)130萬。結(jié)核病已成為全球頭號(hào)傳染病殺手。
[0003]我國結(jié)核病疫情較嚴(yán)重，是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，同時(shí)也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病嚴(yán)重流行的國家之一。2011年我國第五次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果分析，我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬，占全球發(fā)病的14.3%，位居全球第2位。
[0004]卡介苗(BCG)是目前唯一可用的結(jié)核病疫苗，可以有效預(yù)防粟粒型結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎。但是其對(duì)成人保護(hù)效果有限，復(fù)種無效。在隨機(jī)臨床實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)BCG表現(xiàn)出不一致的保護(hù)效果(保護(hù)效果從0%-80%浮動(dòng))。因此，研制新型結(jié)核疫苗迫在眉睫。
[0005]多種類型的新型疫苗已被廣泛研究，包括重組BCG疫苗、營養(yǎng)缺陷型結(jié)核分枝桿菌疫苗、蛋白質(zhì)多肽疫苗、DNA疫苗、以病毒為載體的結(jié)核亞單位疫苗等。然而經(jīng)檢索，目前與本發(fā)明相似的疫苗尚未有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種比目前市售卡介苗性能更佳的重組卡介苗。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述重組卡介苗的制備方法。
[0008]本發(fā)明提供的重組卡介苗，是將結(jié)核桿菌器基因重組表達(dá)于卡介苗BCG中而構(gòu)建獲得，記為rBCG::Rv3425。
[0009]本發(fā)明的疫苗中，將來源于標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv中完整的基因插入到穿梭質(zhì)粒PMV261中，通過電轉(zhuǎn)重組入BCG中實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)。
[0010]本發(fā)明中，重組表達(dá)的RV3425抗原(PPE57)位于結(jié)核分枝桿菌的RDll區(qū)，NCBI中基因號(hào)NC_000962.3，蛋白號(hào):YP_177971.1。編碼該抗原的基因位于H37Rv基因組3842239...3842769之間，基因全長531bp，編碼的Rv3425蛋白長度為176aa，分子量19855.1Da0該基因在BCG中缺失，可以用于結(jié)核病的血清學(xué)診斷。依據(jù)該抗原的上述性質(zhì)，本發(fā)明將該抗原重組表達(dá)于BCG中，構(gòu)建了重組表達(dá)Rv3425的重組卡介苗。
[0011]本發(fā)明還提供上述重組卡介苗的制備方法，具體步驟為:
(1)擴(kuò)增器基因；
(2)用同樣的酶雙酶切器基因和穿梭質(zhì)粒pMV261，將二者通過T4連接酶連接，形成質(zhì)粒;
(3)將步驟(2)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增并表達(dá)；
(4)分離步驟(3)獲得的重組質(zhì)粒，用電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化BCG感受態(tài)，利用pMV261質(zhì)粒上攜帶的卡那霉素抗性篩選重組rBCG::Rv3425陽性克隆。
[0012]本發(fā)明中，雙酶切使用的酶是EcoR I和Sal I。利用報(bào)告基因GFP重組檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EcoR I作為重組基因表達(dá)起始位點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)抗原的高效表達(dá)。
[0013] 本發(fā)明中，使用的穿梭質(zhì)粒pMV261載體,還可以使用整合型質(zhì)粒pMV361等。
[0014]本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
[0015]本發(fā)明中，常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌等。
[0016]本發(fā)明疫苗具有下列優(yōu)勢(shì):
重組表達(dá)了 BCG中缺失的抗原Rv3425，改善了 BCG缺失重要保護(hù)性抗原的缺陷。
[0017]研究發(fā)現(xiàn)，免疫6-8周齡C57BL/6雌性小鼠后，相對(duì)于BCG，本發(fā)明重組rBCG::Rv3425可以顯著提高小鼠外周血中^4+,^8+ T淋巴細(xì)胞的比例，⑶4+，⑶8+ T淋巴細(xì)胞在抗結(jié)核免疫過程中均有重要作用。因此，該重組rBCG::Rv3425可以成為一種有效的新的重組BCG疫苗用于結(jié)核分枝桿菌感染的預(yù)防。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1.PCR驗(yàn)證重組rBCG::Rv3425 中重組情況。Lanel:DNA Marker。Lane2_8:從卡那霉素抗性平板上挑取的7個(gè)菌落。使用引物為PMV261質(zhì)粒上的通用引物。從圖中可以看出，克隆2，3，4，7均攜帶有重組Rv3425基因，表明Rv3425成功轉(zhuǎn)化入BCG中。
[0019]圖2.重組rBCG::Rv3425可以促進(jìn)小鼠外周血中⑶4+ T細(xì)胞比例增加。取免疫8周后的小鼠外周血，經(jīng)過紅細(xì)胞裂解液處理后去除紅細(xì)胞，直接進(jìn)行流式抗體染色，計(jì)數(shù)⑶4+T細(xì)胞的比例。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn):免疫8周后，重組rBCG::Rv3425可以刺激外周血中⑶4+T細(xì)胞數(shù)量的增加，相對(duì)于BCG免疫組和未經(jīng)免疫的PBS對(duì)照組相比均差異顯著。
[0020]圖3.重組rBCG::Rv3425可以促進(jìn)小鼠外周血中⑶8+ T細(xì)胞比例增加。取免疫8周后的小鼠外周血，經(jīng)過紅細(xì)胞裂解液處理后去除紅細(xì)胞，直接進(jìn)行流式抗體染色，計(jì)數(shù)⑶8+ T細(xì)胞的比例。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn):免疫8周后，重組rBCG::Rv3425可以刺激外周血中⑶8+T細(xì)胞數(shù)量的增加，相對(duì)于未經(jīng)免疫的PBS對(duì)照組相比差異顯著。
[0021]圖4.流式染色結(jié)果表明重組rBCG::Rv3425可以促進(jìn)小鼠外周血中⑶4+和⑶8+T細(xì)胞比例上升，各組選取一只代表小鼠進(jìn)行比較。
【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明中未特定標(biāo)注的試劑和條件均采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的常規(guī)產(chǎn)品和方法。
[0023]實(shí)施例1重組rBCG::Rv3425的制備
1.1結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組DNA的制備
結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)在7H9 Broth培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周，80°C，2小時(shí)滅活。用細(xì)菌DNA(小量)抽提試劑盒抽提基因組DNA。因結(jié)核菌的細(xì)胞壁厚，細(xì)菌的消化時(shí)間延長至3到5小時(shí)。
[0024]1.2結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株器基因的擴(kuò)增
根據(jù)基因及載體多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)如下: rv3425S:
5' -^gaattc ATGCATCCAATGATACCAGC-3’ EcoR I (SEQ.1D.NOl)
rv3425A:5' -kigtcgac Ctacccgcccctgtagatct-S' Sai I (seq.1d.N02)
PCR反應(yīng)體系(全式金pfu試劑盒):
【權(quán)利要求】
1.一種重組卡介苗，其特征在于，是將結(jié)核桿菌器基因重組表達(dá)于卡介苗BCG中而構(gòu)建獲得，記為rBCG::Rv3425。
2.如權(quán)利要求1所述重組卡介苗的制備方法，其特征在于，具體步驟為: (1)擴(kuò)增器基因； (2)用同樣的酶雙酶切器基因和穿梭質(zhì)粒pMV261，將二者通過T4連接酶連接，形成質(zhì)粒; (3)將步驟(2)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增并表達(dá)； (4 )分離步驟(3 )獲得的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BCG感受態(tài)以獲得所述重組卡介苗。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，雙酶切使用的酶是EcoRI和Sal I。
4.如權(quán)利要求2所述的制 備方法，其特征在于，使用的載體是pMV261。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103589676SQ201310564900
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】王洪海, 徐穎, 楊恩卓, 李光華, 宋娜 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)