一種白僵菌的分離純化方法【專利摘要】本發(fā)明涉及白僵菌種屬鑒定、分離純化應(yīng)用【
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】，公開了一種分離純化白僵菌的方法。本發(fā)明對培養(yǎng)基進(jìn)行了科學(xué)的優(yōu)化和改進(jìn)，基于科學(xué)配方的培養(yǎng)基并結(jié)合培養(yǎng)裝置覆蓋物的改進(jìn)實(shí)現(xiàn)了簡單、快捷、有效地對白僵菌進(jìn)行分離純化。本發(fā)明方法操作簡單，快速，適用分離純化白僵菌的樣品很廣泛，能夠很好地達(dá)到分離純化目的，且操作成本很低，對環(huán)境無污染?！緦＠f明】一種白僵菌的分離純化方法【
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】[0001]本發(fā)明涉及白僵菌種屬鑒定、生物防治、家蠶白僵病防控等應(yīng)用【
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】，更具體地，涉及一種白僵菌的分離純化方法。【
背景技術(shù)：
】[0002]白僵菌iBeauveriabassiana)現(xiàn)在歸為蟲草科(Cordycipitaceae),蟲草屬{Cordyceps')的重要真菌,早在1816年意大利的科學(xué)家Bassi(1835)從白僵蠶中分離出來。[0003]白僵菌可侵入15個(gè)目149個(gè)科521個(gè)屬的700多種昆蟲及螨類(李增智.中國蟲生真菌研究與應(yīng)用(第一卷).北京:學(xué)術(shù)期刊出版社，1988)。由于白僵菌具有符合生物制劑的一些基本要求、即對溫血?jiǎng)游锖椭参餆o害、容易培養(yǎng)、致病力強(qiáng)、防治害蟲效果好和廣譜等優(yōu)點(diǎn)，寄主廣泛，高度致病性與適應(yīng)性，使得其菌種在農(nóng)、林害蟲的生物防治中得到廣泛運(yùn)用，同時(shí)也是經(jīng)濟(jì)昆蟲家蠶等的重要病原菌之一，一直影響著蠶桑生產(chǎn)的健康穩(wěn)定發(fā)展。此外，白僵蠶作為我國傳統(tǒng)的中藥，在臨床上的應(yīng)用也相當(dāng)廣泛。因此建立分離純化白僵菌方法尤為重要。[0004]目前，對于白僵菌的分離純化，國內(nèi)外均有技術(shù)報(bào)道。白僵菌為有絲真菌，可按照傳統(tǒng)真菌劃線分離純化，但該方法操作工作繁瑣，要轉(zhuǎn)接多次才能將白僵菌分離。為改進(jìn)，國內(nèi)外研究人員開發(fā)了針對白僵菌的選擇性培養(yǎng)基，例如Martin(MartinJP.Useofacid,rosebengal，andstreptomycinintheplatemethodforestimatingsoilfung1.SoilScience,1950)在培養(yǎng)基中添加孟加拉紅(osebengale)和牛膽汁達(dá)到了對雜菌一定程度的抑制；Boerema(BoeremaGHetl.SomenotablefungusinfectionsI1.VerslagenvandePlantenziektenkundigeDienstteWageningen，1963)用櫻桃浸出液制成選擇性培養(yǎng)基，但對雜菌的抑制效果不理想；Veen等(VeenKH，F(xiàn)erronP.AselectivemediumfortheisolationofBeauveriatenellaandofMetarrhiziumanisopliae.Journalofinvertebratepathology，1966)利用改良的Martin氏培養(yǎng)基成功地分離了球孢白僵菌和綠僵菌，但白僵菌在此種培養(yǎng)基上生長緩慢，不易鑒別；Doberski等(DoberskiJW，TribeHT.1solationofentomogenousfungifromelmbarkandsoilwithreferencetoecologyofBeauveriabassianaandMetarhiziumanisopliae.TransactionsoftheBritishMycologicalSociety,1980),利用結(jié)晶紫和放線菌酮可對白僵菌具有較好的選擇特異性；Beilharz等(BeilharzVC.etl.Dodine:aselectiveagentforcertainsoilfung1.TransactionsoftheBritishMycologicalSociety，1982)設(shè)計(jì)了一種以多果定(dodine)為抑菌劑的選擇性培養(yǎng)基，具有良好的分離效果；Chase等(ChaseAR.etl.SelectiveisolationoftheentomopathogenicfungiBeauveriabassianaandMetarhiziumanisopliaefromanartificialpottingmedium.FloridaEntomologist,1986)優(yōu)化培養(yǎng)基條件，在燕麥培養(yǎng)基中加入多果定、苯菌靈和結(jié)晶紫能將白僵菌從其他真菌中進(jìn)行有效分離；島津光明(ShimazuM，SatoH.Mediaforselectiveisolationofanentomogenousfungus,Beauveriabassiana.Appliedentomologyandzoology，1996)利用白僵菌能在很寬pH范圍內(nèi)生長的特性，制成營養(yǎng)貧瘠的堿性培養(yǎng)基，得到較好的分離效果；國內(nèi)武覲文等(武覲文，高宗慶，姚俊梅.培養(yǎng)真菌的試劑松膏和松膏培養(yǎng)基.菌物學(xué)報(bào)，1985)利用松樹針葉提取物一松膏來抑制細(xì)菌、放線菌等微生物生長以此來促進(jìn)真菌生長，但特異性不夠。王濱等(王濱，樊美珍，李增智.球孢白僵菌選擇性培養(yǎng)基的篩選.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000)選用25%Sportak乳油(含25%Prochloraz),77%Cocide可濕性粉劑(含77%氫氧化銅)、5%菌毒清水劑(含5%氨基酸型內(nèi)吸性殺菌劑)代替多果定和放線菌酮，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想；史紅霞等(史紅霞，胡明龍，閻峻.球孢白僵菌選擇性培養(yǎng)基的篩選和檢測應(yīng)用.浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2002)針對寄生在球果花蠅的白僵菌，選用孟加拉紅、放線菌酮、氯霉素作為抑菌劑，得到較好的分離；依據(jù)白僵菌存在一定的寄主?；?，蔡國貴(蔡國貴.剛竹毒蛾白僵菌優(yōu)良菌株篩選及生產(chǎn)應(yīng)用研究.林業(yè)科學(xué)，2003、柳杉毛蟲高毒力白僵菌Bbd3菌株的篩選及應(yīng)用.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2006)向傳統(tǒng)培養(yǎng)基加入剛竹毒蛾或柳杉毛蟲蟲干粉，能夠?yàn)榍秩雱傊穸径昊蛄济x的白僵菌提供專性營養(yǎng)；徐文靜等(徐文靜，尹唯凰，張正坤，等.防治玉米螟高效球孢白僵菌新菌株篩選.吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011)應(yīng)用加入蛋白胨的PDA培養(yǎng)基對侵入玉米螟的白僵菌進(jìn)行純化；王韜遠(yuǎn)等(王韜遠(yuǎn)，徐文靜，張正坤，等.球孢白僵菌分離培養(yǎng)基的篩選及應(yīng)用.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013)向PPDA培養(yǎng)基中添加多果定、頭孢霉素、硫酸卡那霉素能夠?qū)﹄s菌進(jìn)行有效的抑制，篩選出針對檢測白僵菌在田間的菌落含量的專性培養(yǎng)基。[0005]綜上所述，雖然現(xiàn)有技術(shù)針對選擇性培養(yǎng)基做出了大量的研究，只有使用價(jià)格昂貴的多果定或放線菌酮作為抑菌劑的分離效果比較好，但實(shí)際應(yīng)用成本過高；且放線菌酮致癌，影響人體健康?，F(xiàn)有技術(shù)的不足限制了上述技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用，不能解決目前對白僵菌分離純化的普遍需求。[0006]目前缺乏一種簡易、安全、高效、成本較低的分離純化白僵菌方法來適應(yīng)實(shí)際應(yīng)用的需求?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有白僵菌分離純化方法的技術(shù)不足，建立了一種簡易、安全、高效、成本較低的分離純化白僵菌的方法。[0008]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):提供一種白僵菌的分離純化方法，將白僵菌的孢子液均勻涂布于選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得分離純化的白僵菌菌絲和分生孢子；所述選擇性培養(yǎng)基的組成是:在每1000mL滅菌處理的PDA培養(yǎng)基中加入以下各組分:2%~2.5%的去氧膽酸鈉溶液20mL,0.1%~0.3%的孟加拉紅3.3mL,以上所述百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量百分比濃度，臨使用前加入104U/mL~IO6U/mL的硫酸鏈霉素溶液3.3mL。[0009]每一個(gè)所述PDA培養(yǎng)基(15~20mL)含有660U硫酸鏈霉素，0.8%去氧膽酸鈉，0.007%孟加拉紅。[0010]所述PDA培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，自來水1000mL,用IMNaOH或IMHCL調(diào)節(jié)pH值至6。[0011]優(yōu)選地，待培養(yǎng)基凝固后，在無菌操作下用鑷子將無菌玻璃紙覆蓋在瓊脂平板上，將白僵菌的孢子液均勻涂布于無菌玻璃紙上。[0012]所述玻璃紙為賽璐玢材料，是一種用纖維制成的透明薄膜，培養(yǎng)皿大小，滅菌后使用。[0013]其中，白僵菌的孢子液制備、涂布孢子液、培養(yǎng)和純化培養(yǎng)的方法可以參照本【
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】的常規(guī)。優(yōu)選地，在涂布孢子液時(shí)，本發(fā)明是制備得到的孢子液在培養(yǎng)基上用無菌涂布棒涂布均勻，使孢子液均勻分散于整個(gè)培養(yǎng)基的平板表面，然后再用該涂布棒，連續(xù)涂布第2個(gè)或第3個(gè)平板，可以很好地防止菌落重疊，保證培養(yǎng)基易于出現(xiàn)單菌落。[0014]更為具體地，本發(fā)明白僵菌的分離純化方法包括以下步驟:51.制備孢子液:用無菌接種環(huán)從白僵蠶或感染了白僵菌的昆蟲體表面挑取2~3環(huán)分生孢子粉于無菌水中，振蕩使孢子充分散開；52.制備平板:將滅菌處理的PDA培養(yǎng)基放涼至50~60°C，加入去氧膽酸鈉、孟加拉紅、硫酸鏈霉素溶液；待培養(yǎng)基凝固后，在無菌操作下用鑷子將無菌玻璃紙覆蓋在瓊脂平板上；53.將SI制備的孢子液均勻涂布于平板；取200μL制備的孢子液于所述平板上，用無菌涂布棒涂布均勻，使孢子液均勻分散于整個(gè)平板表面，然后再用該涂布棒，連續(xù)涂布第2個(gè)或第3個(gè)平板，其目的防止菌落重疊，這使得培養(yǎng)基易于出現(xiàn)單菌落。[0015]S4.培養(yǎng)；將S3涂布了孢子液的平板倒置于26土2°C、濕度為92土5%環(huán)境中培養(yǎng)3~7d;挑選菌絲生長旺盛、孢子多的典型菌落至1.5mL離心管中，離心管中有ImL無菌昆蟲生理鹽水和適量玻璃珠，振蕩均勻后取200μL涂布在貼有玻璃紙的平板上，倒置于26土2°C，濕度為92±5%培養(yǎng)3~7d;所述無菌昆蟲生理鹽水為質(zhì)量百分比濃度為6.5%氯化鈉(NaCL)水溶液，其中加有體積比百分比濃度為0.1%的吐溫-80，即每1000mL昆蟲生理鹽水中加入ImL吐溫-80。[0016]S5.待菌絲長滿，將玻璃紙揭下，即可得到分離純化的白僵菌菌絲和分生孢子。[0017]進(jìn)一步地，本發(fā)明在SI之前還包括對采集的病原進(jìn)行處理的步驟:將自然感染或人工感染得到的白僵蠶用75%(v/v)乙醇棉球進(jìn)行蠶體表面消毒，然后將它放入無菌培養(yǎng)皿中，皿中放一團(tuán)用無菌水浸濕的棉球，置于26°C培養(yǎng)3~5d,待蠶體表面長出白色絨毛菌絲和分生孢子后再進(jìn)行菌種分離；優(yōu)選地，S2所述平板的配制方法如下:521.準(zhǔn)備以下試劑:硫酸鏈霉素濃度為IO4~106U/mL(用無菌水配制，無需高壓滅菌)；去氧膽酸鈉質(zhì)量百分比濃度為2%~2.5%，孟加拉紅質(zhì)量百分比濃度為0.1%~0.3%，高壓滅菌備用；522.將200g馬鈴薯去皮，切成小塊，加入1000mL水煮爛(煮沸20~30min，能用玻璃棒戳破即可)，用4層紗布過濾，加入20g瓊脂和20g葡萄糖后，再補(bǔ)足水分至1000mL,使用IMNaOH或IMHCL將培養(yǎng)基的pH調(diào)至6.0，121°C下滅菌20min，再加入S21準(zhǔn)備好的去氧膽酸鈉20mL及3.3mL硫酸鏈霉素和3.3mL孟加拉紅。[0018]本發(fā)明所述白僵菌的分離純化方法更適用于從感染了白僵菌的家蠶分離純化白僵菌。[0019]本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明提供了一種適用于白僵菌分離純化的選擇性培養(yǎng)基，以去氧膽酸鈉、硫酸鏈霉素和孟加拉紅聯(lián)用獲得了很好的技術(shù)效果，適宜濃度和使用量的抗生素以及表面活性劑共同發(fā)揮協(xié)同作用，能夠有效抑制細(xì)菌、霉菌的生長，不影響白僵菌的生長，更為快捷地將白僵菌分離純化出來。[0020]本發(fā)明不使用致癌的放線菌酮，克服了其影響人體健康的不利，是一種安全的分離純化方法。[0021]本發(fā)明成本較低，按照目前市場價(jià)考察，現(xiàn)有技術(shù)采用的多果定是580~590元/g，而本發(fā)明采用的去氧膽酸鈉7元/g，硫酸膽酸鈉3元/g，孟加拉紅1.4元/g，大大降低成本。[0022]從培養(yǎng)基上收集分離菌絲和分生孢子也非常困難，易混雜別的雜菌，造成污染。本發(fā)明創(chuàng)造性地使用一種玻璃紙，所使用的玻璃紙是一種再生纖維素，作為半透膜，它的分子間隙存在透氣性，白僵菌能從培養(yǎng)基吸取生長所需的營養(yǎng)，正常生長。待白僵菌長到所需程度就可將玻璃紙揭下，就能很方便快捷地將菌絲及分生孢子與培養(yǎng)基分離，以備白僵菌DNA抽提或分生孢子的純化或其他應(yīng)用。且玻璃紙?jiān)显从谔烊?，在環(huán)境下易分解，不污染環(huán)境。[0023]綜上所述，本發(fā)明分離純化白僵菌方法簡易、安全、高效、成本較低，具有很好的實(shí)際應(yīng)用前景?！緦＠綀D】【附圖說明】[0024]圖1以添加硫酸鏈霉素等針對白僵菌分離的培養(yǎng)基。[0025]圖2普通PDA培養(yǎng)基對白僵蠶的白僵菌進(jìn)行分離純化的結(jié)果。[0026]圖3培養(yǎng)基貼有玻璃紙收集白僵菌菌絲和分生孢子。[0027]圖4將白僵蠶置于26°C培養(yǎng)3~5天后待蠶體表面長出白色絨毛菌絲和分生孢子。【具體實(shí)施方式】[0028]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的方法和設(shè)備為本領(lǐng)域常規(guī)方法和設(shè)備，采用的試劑除非特別說明，為本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】常規(guī)的試劑。[0029]實(shí)施例1對采集的病原進(jìn)行處理:將自然感染的白僵蠶(也可以采用常規(guī)手段人工感染的白僵蠶)用75%(v/v)乙醇棉球進(jìn)行蠶體表面消毒，然后將它放入無菌培養(yǎng)皿中(皿中放一團(tuán)用無菌水浸濕的棉球)，置于26°C培養(yǎng)3~5天(d)，待蠶體表面長出白色絨毛菌絲和分生孢子后再進(jìn)行菌種分離；51.制備孢子液:用無菌接種環(huán)從蠶體表面挑取2~3環(huán)分生孢子粉于盛有50mL無菌水的三角瓶中(內(nèi)含無菌玻璃珠)，用漩渦振蕩5min，使孢子充分散開；52.制備平板:521.準(zhǔn)備以下試劑:硫酸鏈霉素濃度為1000U/mL(用無菌水配制，無需高壓滅菌，臨用前加入);去氧膽酸鈉質(zhì)量百分比濃度為2%，，孟加拉紅質(zhì)量百分比濃度為0.1%，高壓滅菌備用；522.將200g馬鈴薯去皮，切成小塊，加入1000mL水煮爛(煮沸20~30min，能用玻璃棒戳破即可)，用4層紗布過濾，加入20g瓊脂和20g葡萄糖后，再補(bǔ)足水分至1000mL，使用IMNaOH或IMHCL將培養(yǎng)基pH調(diào)至6.0，121°C下滅菌20min。[0030]將滅菌處理的PDA培養(yǎng)基放涼至50~60°C，加入2%去氧膽酸鈉20ml/L；0.1%孟加拉紅3.3mL/L;硫酸鏈霉素溶液(1000U/mL)3.3mL/L，；另將未添加去氧膽酸鈉和硫酸鏈霉素的PDA平板作為對照；53.涂布孢子液:取200uL孢子液于平板上用無菌涂布棒涂布均勻，使孢子液分散于整個(gè)平板表面，然后再用該涂布棒，連續(xù)涂布第2個(gè)第3個(gè)平板，將平板倒置于26°C，濕度為95%培養(yǎng)3~7d;54.挑選菌絲生長旺盛、孢子多的典型菌落入1.5mL內(nèi)有Iml無菌加有0.1%吐溫-80的昆蟲生理鹽水和適量玻璃珠的離心管中，振蕩均勻；55.取200μL涂布于貼在含有硫酸鏈霉素等抗生素的平板上的玻璃紙上，倒置于260C、濕度為95%環(huán)境中培養(yǎng)3~7d;待菌絲長滿，可將玻璃紙揭下，即可得到分離純化的白僵菌菌絲和分生孢子，見附圖1和附圖3所示；將普通PDA培養(yǎng)基分離的白僵菌涂布在普通PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，見附圖2所示。由附圖1和附圖3所示可知，在添加抗生素的培養(yǎng)基上，未出現(xiàn)霉菌和細(xì)菌，菌落呈淡粉色，易于分辯；由附圖2所示普通培養(yǎng)基在第一次分離白僵菌時(shí)會有霉菌及其他雜菌。[0031]實(shí)施例2對采集的病原進(jìn)行處理:將感染了自然感染或人工感染白僵菌的蠶蛹用75%(v/v)乙醇棉球進(jìn)行表面消毒，然后將它放入無菌培養(yǎng)皿中，皿中放一團(tuán)用無菌水浸濕的棉球，置于26°C培養(yǎng)3~5天(d)，待蠶體表面長出白色絨毛菌絲和分生孢子后再進(jìn)行菌種分離；51.制備孢子液:用無菌接種環(huán)從蠶體表面挑取2~3環(huán)分生孢子粉于盛有50mL無菌水的三角瓶中(內(nèi)含無菌玻璃珠)，用漩渦振蕩5min，使孢子充分散開；52.制備平板:521.準(zhǔn)備以下試劑:硫酸鏈霉素濃度為10000U/mL(用無菌水配制，無需高壓滅菌，臨用前加入);去氧膽酸鈉質(zhì)量百分比濃度為2.5%，，孟加拉紅質(zhì)量百分比濃度為0.2%，高壓滅囷備用；522.將200g馬鈴薯去皮，切成小塊，加入1000mL水煮爛(煮沸20~30min，能用玻璃棒戳破即可)，用4層紗布過濾，加入20g瓊脂和20g葡萄糖后，再補(bǔ)足水分至1000mL，使用IMNaOH或IMHCL將培養(yǎng)基pH調(diào)至6.0，121°C下滅菌20min。[0032]將滅菌處理的PDA培養(yǎng)基放涼至50~60°C，加入2.5%去氧膽酸鈉20ml/L;0.2%孟加拉紅3.3mL/L;硫酸鏈霉素溶液(10000U/mL)3.3mL/L,;另將未添加去氧膽酸鈉和硫酸鏈霉素的PDA平板作為對照；53.涂布孢子液:取200uL孢子液于平板上用無菌涂布棒涂布均勻，使孢子液分散于整個(gè)平板表面，然后再用該涂布棒，連續(xù)涂布第2個(gè)第3個(gè)平板，將平板倒置于26°C，濕度為95%培養(yǎng)3~7d;54.挑選菌絲生長旺盛、孢子多的典型菌落入1.5mL內(nèi)有Iml無菌加有0.1%吐溫-80的昆蟲生理鹽水和適量玻璃珠的離心管中，振蕩均勻；55.取200μL涂布于貼在含有硫酸鏈霉素等抗生素的平板上的玻璃紙上，倒置于26°C、濕度為95%環(huán)境中培養(yǎng)3~7d;待菌絲長滿，可將玻璃紙揭下，即可得到分離純化的白僵菌菌絲和分生孢子。[0033]實(shí)施例3S1.將用于生物防治制成的含有白僵菌孢子的生物農(nóng)藥(廣州生物防治站隨機(jī)選取提供，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可采用類似的含有白僵菌孢子的生物農(nóng)藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn))稀釋成質(zhì)量百分比濃度為I或10%的稀釋液。[0034]S2.制備平板；521.準(zhǔn)備以下試劑:硫酸鏈霉素濃度為100000U/mL(用無菌水配制，無需高壓滅菌，臨用前加入)；去氧膽酸鈉質(zhì)量百分比濃度為2.2%，，孟加拉紅質(zhì)量百分比濃度為0.25%，高壓滅菌備用；522.將200g馬鈴薯去皮，切成小塊，加入1000mL水煮爛(煮沸20~30min，能用玻璃棒戳破即可)，用4層紗布過濾，加入20g瓊脂和20g葡萄糖后，再補(bǔ)足水分至1000mL，使用IMNaOH或IMHCL將培養(yǎng)基pH調(diào)至6.0，121°C下滅菌20min。[0035]將滅菌處理的PDA培養(yǎng)基放涼至50~60°C，加入2.2%去氧膽酸鈉20ml/L；0.25%孟加拉紅3.3mL/L;硫酸鏈霉素溶液(100000U/mL)3.3mL/L,;另將未添加去氧膽酸鈉和硫酸鏈霉素的PDA平板作為對照；53.涂布孢子液:取200uL生物農(nóng)藥稀釋液于平板上用無菌涂布棒涂布均勻，使孢子液分散于整個(gè)平板表面，然后再用該涂布棒連續(xù)涂布第2個(gè)第3個(gè)平板，將平板倒置于260C，濕度為95%培養(yǎng)3~7d;54.挑選菌絲生長旺盛、孢子多的典型菌落入1.5mL內(nèi)有Iml無菌加有0.1%吐溫-80的昆蟲生理鹽水和適量玻璃珠的離心管中，振蕩均勻；55.取200μL涂布于貼在含有硫酸鏈霉素等抗生素的平板上的玻璃紙上，倒置于26°C、濕度為95%環(huán)境中培養(yǎng)3~7d;待菌絲長滿，可將玻璃紙揭下，即可得到分離純化的白僵菌菌絲和分生孢子。[0036]按照目前市場價(jià)考察，本發(fā)明實(shí)施例1、2、3中使用的去氧膽酸鈉7元/g，硫酸膽酸鈉3元/g，孟加拉紅1.4元/g，而現(xiàn)有技術(shù)采用的多果定是580~590元/g，本發(fā)明大大降低分離純化的成本。[0037]經(jīng)檢測，本發(fā)明分離純化得到的白僵菌菌絲和分生孢子中不含其他雜菌(細(xì)菌、霉菌)，白僵菌菌絲茂密和分生孢子呈球狀或卵圓形，個(gè)別出現(xiàn)健康的芽體。本發(fā)明從培養(yǎng)基上收集分離菌絲和分生孢子非常方便快捷。【權(quán)利要求】1.一種分離純化白僵菌的方法，其特征在于，是將白僵菌的孢子液均勻涂布于選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得分離純化的白僵菌菌絲和分生孢子；所述選擇性培養(yǎng)基的組成是:在每1000mL滅菌處理的PDA培養(yǎng)基中加入以下各組分:2%~2.5%的去氧膽酸鈉溶液20mL，0.1%~0.3%的孟加拉紅3.3mL,以上所述百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量百分比濃度，臨使用前加入IO4U/mL~106U/mL的硫酸鏈霉素溶液3.3mL。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述分離純化白僵菌的方法，其特征在于，所述PDA培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，自來水1000mL,用IMNaOH或IMHCL調(diào)節(jié)pH值至6。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述分離純化白僵菌的方法，其特征在于，在將白僵菌的孢子液均勻涂布于選擇性培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基凝固后，在無菌操作下將無菌玻璃紙覆蓋在瓊脂平板上。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述分離純化白僵菌的方法，其特征在于，將白僵菌的孢子液均勻涂布于選擇性培養(yǎng)基上的方法是將孢子液在培養(yǎng)基上用無菌涂布棒涂布均勻，然后再用該涂布棒連續(xù)涂布另一個(gè)平板。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述分離純化白僵菌的方法，其特征在于，包括以下步驟:（51.制備孢子液:用無菌接種環(huán)從白僵蠶或感染了白僵菌的昆蟲體表面挑取2~3環(huán)分生孢子粉于無菌水中，振蕩使孢子充分散開；（52.制備平板:將滅菌處理的PDA培養(yǎng)基放涼至50~60°C，加入去氧膽酸鈉、孟加拉紅、硫酸鏈霉素溶液；待培養(yǎng)基凝固后，在無菌操作下用鑷子將無菌玻璃紙覆蓋在瓊脂平板上；（53.將SI制備的孢子液均勻涂布于平板；（54.培養(yǎng)；將S3涂布了孢子液的平板倒置于26±2°C、濕度為92±5%環(huán)境中培養(yǎng)3~7d;挑選菌絲生長旺盛、孢子多的典型菌落至1.5mL離心管中，離心管中有ImL無菌昆蟲生理鹽水和玻璃珠，振蕩均勻后取200μL涂布在貼有玻璃紙的平板上，倒置于26±2°C，濕度為92±5%培養(yǎng)3~7d;所述無菌昆蟲生理鹽水為質(zhì)量百分比濃度為6.5%氯化鈉水溶液，其中加有體積比濃度為0.1%的吐溫-80；（55.待菌絲長滿，將玻璃紙揭下，即可得到分離純化的白僵菌菌絲和分生孢子。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述分離純化白僵菌的方法，其特征在于，在SI之前還包括對采集的病原進(jìn)行處理的步驟，即將自然感染或人工感染得到的白僵蠶用體積百分比濃度為75%的乙醇棉球進(jìn)行蠶體表面消毒，然后將其放入無菌培養(yǎng)皿中，皿中放一團(tuán)用無菌水浸濕的棉球，置于26°C培養(yǎng)3~5d，待蠶體表面長出白色絨毛菌絲和分生孢子后再進(jìn)行菌種分離。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述分離純化白僵菌的方法，其特征在于，S2所述平板的配制方法如下:（521.準(zhǔn)備以下試劑:硫酸鏈霉素濃度為IO4~106U/mL;去氧膽酸鈉質(zhì)量百分比濃度為（2%~2.5%，孟加拉紅質(zhì)量百分比濃度為0.1%~0.3%，高壓滅菌備用；（522.將馬鈴薯去皮，切成小塊，加水煮爛，過濾，加入瓊脂和葡萄糖后，補(bǔ)足水分，pH調(diào)至6.0，滅菌后加入S21準(zhǔn)備好的去氧膽酸鈉、硫酸鏈霉素和孟加拉紅。【文檔編號】C12N1/14GK103571760SQ201310566645【公開日】2014年2月12日申請日期:2013年11月13日優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日【發(fā)明者】劉吉平,李香霖申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)