一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法，通過(guò)將雙親短肽與重組酶進(jìn)行融合表達(dá)獲得熱穩(wěn)定性的提高的重組酶。其中優(yōu)選的雙親短肽的序列為DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDWLKAFYDKVAEKLKEAF。該方法具有效果顯著、工藝簡(jiǎn)單、便于推廣。本發(fā)明為快速提高工業(yè)酶熱穩(wěn)定性提高了新的方法和思路。
【專利說(shuō)明】一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法，特別是一種利用雙親短肽融合表達(dá)提高重組酶的熱穩(wěn)定性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雙親短肽是具有親水和親油能力的小分子肽，廣泛存在于膜蛋白及脂肪代謝相關(guān)酶類(lèi)的結(jié)構(gòu)中。其雙親的特點(diǎn)能夠幫助酶分子與疏水性底物結(jié)合、實(shí)現(xiàn)酶分子的定位等。
[0003]生物活性酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用，而提高酶的熱穩(wěn)定性是工業(yè)酶的研究重點(diǎn)之一。目前，提高酶熱穩(wěn)定性的方法主要包括:1.定向進(jìn)化:通過(guò)定點(diǎn)突變，隨即突變，飽和突變等技術(shù)，篩選得到熱穩(wěn)定的突變株；2.從嗜熱微生物中篩選熱穩(wěn)定性的酶。但是，這些方法并不適用于所有酶分子熱穩(wěn)定性改造中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法，通過(guò)在重組酶的N端或C端融合表達(dá)雙 親短肽實(shí)現(xiàn)酶熱穩(wěn)定性的提高。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題提供如下技術(shù)方案:
[0006]第一步雙親短肽基因的獲得
[0007]根據(jù)雙親短肽的氨基酸序列，化學(xué)合成相應(yīng)的DNA序列，并將其克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-22b (+)的Nde I和Nco I酶切位點(diǎn)之間上，構(gòu)建成為pET_22b (+) /AP質(zhì)粒；
[0008]第二步融合雙親短肽的重組酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0009]將重組酶基因克隆至pET_22b(+)/AP質(zhì)粒的Nco I和Hind III位點(diǎn)之間。構(gòu)建成為表達(dá)融合雙親短肽的重組酶表達(dá)質(zhì)粒pET-22b (+) /AP-enzyme。
[0010]第三步融合雙親短肽的重組酶表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0011]將重組質(zhì)粒pET_22b (+)/AP-enzyme 轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌(E.coli BL21(DE3)),構(gòu)建高效表達(dá)目的酶的誘導(dǎo)型大腸桿菌基因工程菌。
[0012]菌株經(jīng)培養(yǎng)表達(dá)目的酶的方法為:
[0013]培養(yǎng)基組成(g/L):
[0014]種子培養(yǎng)基:蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉5 ；
[0015]發(fā)酵培養(yǎng)基:將下列組分溶解在0.9L水中:蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。；
[0016]各組分溶解后高壓滅菌；冷卻到60 °C，再加100mL滅菌的170mmol/LKH2P04/0.72mol/L Κ2ΗΡ04 的溶液(2.31g 的 KH2P04 和 12.54gK2HP04 溶在足量的水中，使終體積為100mL ;高壓滅菌或用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌)；
[0017]培養(yǎng)方法:種子培養(yǎng)，挑取工程菌單菌落接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)12h ;發(fā)酵培養(yǎng)，按10%的接種量接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養(yǎng)溫度37°C，當(dāng)0D6(I(I達(dá)到0.6時(shí)，將培養(yǎng)溫度降為16°C，同時(shí)加入終濃度為1.0mM的誘導(dǎo)劑IPTG。
[0018]目的酶熱穩(wěn)定的測(cè)定方法:
[0019]將目的酶分別應(yīng)用疏水層析、離子交換層析等分離手段，得到電泳純的目的酶。將目的酶在一定溫度下保溫，測(cè)定酶活相比初始未保溫時(shí)損失50%所需要的時(shí)間(T1/2)。
[0020]本發(fā)明提供了一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法，應(yīng)用雙親短肽融合表達(dá)重組酶能夠提高目的重組酶的熱穩(wěn)定性。該方法具有效果顯著、工藝簡(jiǎn)單、便于推廣。本發(fā)明為快速提高工業(yè)酶熱穩(wěn)定性提高了新的方法和思路。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照常見(jiàn)的分子克隆手冊(cè)所述的條件進(jìn)行操作。
[0022]材料和方法:所用限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，PCR試劑，DNA Marker等均購(gòu)于TaKaRa寶生物公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109，引物，質(zhì)粒提取試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)于上海生工生物工程公司。
[0023]實(shí)施例1:雙親短肽的氨基酸序列并克隆至質(zhì)粒pET_22b (+)
[0024]1AEAEAKAKAEAEAKAK
[0025]2.VNYGNGVSCSKTKCSVNWGQAFQERYTAGTNSFVSGVSGVASGAGSIGRR
[0026]3.DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVEPLRADWLKAFYDKVAEKLKEAF
[0027]4.DWLKAFYDKVAEKLKEAFGLLPVLEDWLKAFYDKVAEKLKEAF
[0028]5.DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDWLKAFYDKVAEKLKEAF
[0029]6.DWLKAFYDKVAEKLKEAFNGGARLADWLKAFYDKVAEKLKEAF
[0030]按照以上氨基酸序列通過(guò)化學(xué)合成DNA序列，并克隆至質(zhì)粒pET_22b (+)等到質(zhì)粒pET-22b(+)/AP
[0031]實(shí)施例2:重組質(zhì)粒pET_22b (+) /AP-enzyme的構(gòu)建
[0032]將目的酶基因克隆至表達(dá)載體pET_22b(+)/AP的Nco I和Hind III位點(diǎn)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法如下:
[0033](1)無(wú)菌狀態(tài)下取感受態(tài)細(xì)胞200 μ L置于無(wú)菌的微量離心管中；
[0034](2)每管加入1-2 μ L重組質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30min ；
[0035](3)42°C熱休克90s (準(zhǔn)確)，不要搖動(dòng)離心管；
[0036](4)快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中，使細(xì)胞冷卻l_2min ；
[0037](5)每管加入無(wú)抗生素的普通LB培養(yǎng)液800 μ L ;
[0038](6)用無(wú)菌鋪菌器將200 μ L菌液鋪于含氨芐青霉素的瓊脂平板,37°C平放20min直至液體被吸收，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜，觀察。
[0039]挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明連接成功。
[0040]實(shí)施例3:融合雙親短肽的重組酶表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0041]感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法如下:
[0042](1)無(wú)菌狀態(tài)下取感受態(tài)細(xì)胞200 μ L置于無(wú)菌的微量離心管中；
[0043](2)每管加入1-2 μ L重組質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30min ；
[0044](3)42°C熱休克90s (準(zhǔn)確)，不要搖動(dòng)離心管；[0045](4)快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中，使細(xì)胞冷卻l_2min ；
[0046](5)每管加入無(wú)抗生素的普通LB培養(yǎng)液800 μ L ;
[0047](6)用無(wú)菌鋪菌器將200 μ L菌液鋪于含氨芐青霉素的瓊脂平板，37°C平放20min直至液體被吸收，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜，觀察。
[0048]挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒驗(yàn)證，證明轉(zhuǎn)化成功。
[0049]實(shí)施例4:發(fā)酵生產(chǎn)融合雙親短肽的脂肪氧合酶
[0050]脂肪氧合酶基因序列如Genebank N0:PA119所示，根據(jù)實(shí)施例2，實(shí)施例3所述方法得到融合雙親短肽的重組脂肪氧合酶的表達(dá)菌株，以該菌株作為種子發(fā)酵生產(chǎn)重組脂肪氧合酶。
[0051]培養(yǎng)基組成(g/L):
[0052]種子培養(yǎng)基:蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉5。
[0053]發(fā)酵培養(yǎng)基:將下列組分溶解在0.9L水中:蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。
[0054]各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60 °C，再加100mL滅菌的170mmol/LKH2P04/0.72mol/L Κ2ΗΡ0χ 的溶液(2.31g 的 KH2P04 和 12.54g K2HP04 溶在足量的水中，使終體積為100mL。高壓滅菌或用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌)。
[0055] 培養(yǎng)方法:種子培養(yǎng)，挑取工程菌單菌落接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)12h ;發(fā)酵培養(yǎng)，按10%的接種量接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養(yǎng)溫度37°C，當(dāng)0D6(I(I達(dá)到0.6時(shí)，將培養(yǎng)溫度降為16°C，同時(shí)加入終濃度為1.0mM的誘導(dǎo)劑IPTG，發(fā)酵24h。
[0056]將發(fā)酵液15000rpm離心lOmin得到菌體,將菌體溶解于150mM Tris-Hcl, pH7.5的緩沖液中，并依次通過(guò)疏水層析、離子交換層析得到電泳純的重組酶。在50°C下測(cè)定重組酶的熱穩(wěn)定性，如表1所示:
[0057]表1.融合雙親短肽提高脂肪氧合酶的熱穩(wěn)定性，以未融合雙親短肽的為對(duì)照
[0058]
| 對(duì)照~[I |2 [3 [4 [5 [6
Tl/2min(50°C )~ 10 18 39 38 22 252~187
[0059]實(shí)施例5:發(fā)酵生產(chǎn)融合雙親短肽的堿性淀粉酶
[0060]以實(shí)施例2，實(shí)施例3所述方法得到融合雙親短肽的重組堿性淀粉酶的表達(dá)菌株，以該菌株作為種子發(fā)酵生產(chǎn)重組堿性淀粉酶。堿性淀粉酶基因序列如GenebankN0:HV220894.1 所示。
[0061]培養(yǎng)基組成(g/L):
[0062]種子培養(yǎng)基:蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉5。
[0063]發(fā)酵培養(yǎng)基:將下列組分溶解在0.9L水中:蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。
[0064]各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60 °C，再加lOOmL滅菌的170mmol/LKH2P04/0.72mol/L Κ2ΗΡ04 的溶液(2.31g 的 KH2P04 和 12.54gK2HP04 溶在足量的水中，使終體積為lOOmL。高壓滅菌或用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌)。[0065]培養(yǎng)方法:種子培養(yǎng)，挑取工程菌單菌落接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)12h ;發(fā)酵培養(yǎng)，按10%的接種量接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養(yǎng)溫度37°C，當(dāng)0D6(I(I達(dá)到0.6時(shí)，將培養(yǎng)溫度降為16°C，同時(shí)加入終濃度為1.0mM的誘導(dǎo)劑IPTG，發(fā)酵24h。
[0066]將發(fā)酵液15000rpm離心lOmin得到菌體,將菌體溶解于150mM Tris-Hcl, pH7.5的緩沖液中，并依次通過(guò)疏水層析、離子交換層析得到電泳純的重組酶。在50°C下測(cè)定重組酶的熱穩(wěn)定性，如表2所示:
[0067]表2.融合雙親短肽提高堿性淀粉酶的熱穩(wěn)定性，以未融合雙親短肽的為對(duì)照
[0068]
【權(quán)利要求】
1.一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于將雙親短肽與重組酶進(jìn)行融合表達(dá)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述雙親短肽融合在重組酶的N端或者C端。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于雙親短肽的序列為:AEAEAKAKAEAEAKAK。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103740662SQ201310567945
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月10日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 陸信曜, 劉松, 張娟 申請(qǐng)人:江南大學(xué)