一種高效表達(dá)米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶的基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶的基因工程菌及其應(yīng)用，是將基因S2導(dǎo)入畢氏酵母（Pichia?pastoris）進(jìn)行高效表達(dá)；所述基因S2編碼一種新的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶，核苷酸序列如以下1）或2）所示：1）其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1，SEQ?ID?NO.2所示核苷酸序列；2）在1）限定的核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有編碼有活性的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的核苷酸序列。所得重組酶具有脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性以及耐酸性環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，對提高啤酒，葡萄酒，果汁飲品等非生物穩(wěn)定性具有明顯效果，具有重大應(yīng)用潛力。
【專利說明】一種高效表達(dá)米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶的基因工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的酵母工程菌及其應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白酶是具有催化蛋白水解生成胨、腙、多肽、氨基酸的一大類酶。蛋白酶按作用方式可分為內(nèi)外肽酶；按活性中心分為絲氨酸蛋白酶，巰基蛋白酶，金屬蛋白酶和羧基蛋白酶；按照蛋白酶來源分為植物，動物，微生物蛋白酶。其中絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有機(jī)體中起著重要而廣泛的生理作用。絲氨酸蛋白酶家族成員非常龐大，分為81類，例如胰臟分泌的消化胰酶蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、糜蛋白酶、血液凝固中的凝血酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶以及氨肽酶等都屬于絲氨酸蛋白酶家族。絲氨酸蛋白酶活性部位都含有Ser、His、Asp,并具有相同的催化機(jī)制,但是他們與底物結(jié)合部位的差異決定了各自對底物的專一性，正由于這種結(jié)構(gòu)上微小變化，從而引起其在功能上的差異。并且，由于絲氨酸蛋白酶在結(jié)構(gòu)上全為β蛋白，核心結(jié)構(gòu)由兩個非常相似的結(jié)構(gòu)域(N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域)，這兩個結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致它們在功能和進(jìn)化上的作用差異。脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶，也稱脯氨酰內(nèi)肽酶(proline specificendoprotease, prolyl endopeptidase,簡稱PEP) [EC.3.4.21.26]或腦氨酸寡妝酶，屬于絲氨酸蛋白酶中一種新的家族，該家族能專一性地水解多肽中脯氨酸殘基的羧基端肽鍵，含有典型的絲氨酸蛋白酶家族的G-X-S-X-G/A高度保守序列，但是活性位點(diǎn)Ser周圍的氨基酸殘基和其他典型的絲氨酸蛋白不同，而且與已知的絲氨酸蛋白酶家族(包括胰蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，羧肽酶Y)相比，在一級結(jié)構(gòu)上同源性很低。
[0003]脯氨酸(Pro)是唯一具有亞氨結(jié)構(gòu)的氨基酸，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)影響了與其它氨基酸形成肽鍵時的空間構(gòu)象。脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶對Pro在多肽中的位置和成鍵的構(gòu)型都有很強(qiáng)的專一性，且能夠特異性`水解小分子量多肽中脯氨酸羧基端肽鍵。因此，可以應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥、多肽工業(yè)等領(lǐng)域；同時可以作為一種分子生物學(xué)的工具酶，應(yīng)用于蛋白質(zhì)序列測定，肽譜分析、特異位點(diǎn)的酶切、肽鏈的修飾以及加工等。
[0004]特別地，在食品工業(yè)方面，由于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以為特定人群提供營養(yǎng)補(bǔ)充，因此有廣泛的市場效應(yīng)。來自乳清產(chǎn)品特別受歡迎的原因在于其極好的口感及良好的可溶性。但是，目前這些酪蛋白水解產(chǎn)物還未獲得廣泛的流行，缺乏市場滲透力的主要原因在于酪蛋白水解過程中所產(chǎn)生的苦味，這種出現(xiàn)苦味的情況代表了一個技術(shù)問題，目前在食品工業(yè)上還沒有解決。但是可以確定的是苦味通常是很多蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，研究表明，苦味和幾個特別的苦味肽相關(guān)，而不是大量的普遍的苦味肽。Matoba發(fā)現(xiàn)水解氨基酸C末端或N末端位置的肽類可以出現(xiàn)較少的苦味，而水解氨基酸涉及肽鍵兩端的肽類的苦味則更多。酪蛋白富含疏水性氨基酸尤其是脯氨酸，Caprralla發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物顯著脫苦味伴隨著疏水肽類出現(xiàn)的選擇性降解。眾所周知，包含脯氨酸殘基的肽鍵很難被已知可購買的工業(yè)用酶切開。脯氨酸殘基在肽的羧基末端的高發(fā)生率與低的苦味相關(guān)，并且證明了羧基末端脯氨酸殘基預(yù)期的高發(fā)生率只能用高濃度的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶來實(shí)現(xiàn)。
[0005]因此，在食品工業(yè)中，脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶不僅在解除直接與抑制苦味相關(guān)的苦味肽獲得優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物應(yīng)用顯示出了無以倫比的優(yōu)越性，還在不直接與抑制苦味相關(guān)，比如將減少食物蛋白質(zhì)的變應(yīng)原性；減緩所得生面團(tuán)制作面包的腐?。簧筛缓彼岬碾淖鳛楦鞣N食物或營養(yǎng)產(chǎn)品的理想添加劑，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)利用。尤其引人注目的是，該酶還可以用于啤酒釀造，解決啤酒實(shí)際生產(chǎn)過程中的冷混濁問題。主要是因?yàn)榇篼湹鞍踪|(zhì)中富含脯氨酸序列很豐富，且在他們非發(fā)芽的形式時谷類蛋白質(zhì)是極其難以降解成生產(chǎn)適當(dāng)?shù)目砂l(fā)酵的麥芽汁所必需的游離氨基酸。
[0006]目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶主要有:一是來自于動物的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶類。二是來自于植物的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶類。它們主要存在于菠菜，蘑菇菌類等，主要是雙孢子蘑菇。三是來自于微生物的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶。目前已在細(xì)菌如腦膜敗血性黃桿菌屬，黃單胞菌屬，嗜水氣單胞菌，產(chǎn)氣單胞菌屬，假單胞菌屬，假平胞菌莢膜，鹽生鹽桿菌和曲霉中發(fā)現(xiàn)該酶的存在，并且克隆得到編碼腦膜敗血性黃桿菌屬(Genbank:M81461.1),嗜水氣單胞菌(Genbank:D14005.1),產(chǎn)氣單胞菌(Genbank:AF065429)，假平胞菌莢膜(Genbank:ABO10298)，黃色粘球菌(Genbank: ABF89794)以及煙曲霉(Genbank: XM744168 )和黑曲霉(Genbank: AX458699 )的核苷酸序列，然而，除假平胞菌屬，鹽生鹽桿菌和黑曲霉外，其他六種微生物都屬于病原性微生物。
[0007]近年來，脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的研究成為熱點(diǎn)，因其在食品行業(yè)上具有誘人的應(yīng)用前景毋庸置疑，已經(jīng)引起了越來越多國內(nèi)外食品研究工作者們的青睞。國外已有商業(yè)酶應(yīng)用在啤酒行業(yè)中，以抑制瓶裝啤酒中混濁的形成，雖然商品酶價格十分昂貴，但在國內(nèi)仍舊處于壟斷地位。究其原因在于食品安全級微生物產(chǎn)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶自然酶活較低，分離純化困難，基因工程菌研究很少，從而限制了對其生理功能和性質(zhì)的研究，相應(yīng)地，國內(nèi)對該酶的研究也非常滯后，并未建立相關(guān)的研究體系。
[0008]米曲霉是美國食`品藥品管理機(jī)構(gòu)認(rèn)定的生物安全菌，從米曲霉中提取脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶應(yīng)用于藥品食品行業(yè)安全可靠。然而，迄今為止，即使在95年有日本專利顯示從產(chǎn)醬油米曲霉菌株中發(fā)現(xiàn)具有脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性，但是國內(nèi)外有關(guān)米曲霉脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶編碼序列和制備方法的未見任何報道。因此，研究新型米曲霉脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶基因并實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)具有重要研究意義和應(yīng)用價值。本研究根據(jù)黑曲霉(Genbank:AX458699)和煙曲霉(Genbank:EDP53789)來源的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)引物，從篩選獲得的米曲霉中成功調(diào)取獲得米曲霉的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶基因序列，發(fā)現(xiàn)其與黑曲霉(Genbank: AX458699 )和煙曲霉(Genbank:EDP53789)來源的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶蛋白序列的同源性分別僅為19.5%和21%，并驗(yàn)證了其脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶功能與應(yīng)用價值。進(jìn)一步通過在NCBI上進(jìn)行BLASTp相似性檢索,發(fā)現(xiàn)已報道全基因組測序的米曲霉Aspergillus oryzae RIB40中機(jī)器自動注釋的基因Genbank:ΧΜ_001825944.2與本研究調(diào)取基因序列一致，但是該條目基因Genbank:ΧΜ_001825944.2被預(yù)測為絲氨酸蛋白酶，未做其它任何相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高效表達(dá)米曲霉脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的酵母工程菌，是將蛋白酶基因S2導(dǎo)入Pichia pastoris得到的酵母工程菌；
[0010]所述基因S2的序列一種新的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶基因以及基于畢赤酵母密碼子偏愛性的重組內(nèi)切脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶基因序列，其特征在于其核苷酸序列如以下I)或2)所示:
[0011]I)其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2所示核苷酸序列；
[0012]2)在I)限定的核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有編碼有活性的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的核苷酸序列。
[0013]所述畢氏酵母為GS115，KM71或SMD1168，其中優(yōu)選GS115。
[0014]所述基因編碼的蛋白質(zhì)及含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、基因工程菌、表達(dá)載體或克隆載體均屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0015]本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種高產(chǎn)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的重組畢赤酵母工程菌及其構(gòu)建、表達(dá)方法。
[0016]所述高產(chǎn)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的重組畢赤酵母的構(gòu)建方法為選取重組畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9-S2，以畢赤酵母GSl 15為宿主進(jìn)行表達(dá)，具體步驟如下:
[0017](I)提取米曲霉A.0ryzae (中國微生物菌種庫保藏編號:CICC40214)總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，以所獲得cDNA為模板，利用簡并引物gl和g2進(jìn)行PCR擴(kuò)增保守區(qū)，經(jīng)過NCBI，EMBL數(shù)據(jù)庫比對，找 出同源性最高的序列；然后以所得序列為模板，利用引物g3和g4通過PCR擴(kuò)增得到1743bp的米曲霉全長脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶；
[0018](2)設(shè)計(jì)引物g5和g6,利用PCR向A.0ryzae脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的DNA編碼框5’和3’兩側(cè)分別引入SnaBI和Not I限制性酶切位點(diǎn)(不帶信號肽)；(下劃線顯示)；
[0019](3)選取畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9-S2，將重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9-S2轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15，通過G418抗生素平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子并測序驗(yàn)證；
[0020]所述PCR引物
[0021]gl:5-RASMTWSRYATYASGGRA-3
[0022]g2:5-SVBYCBCYMBRGRKMANRNTB-3
[0023]g3:5/ -ATGAACCTAGAAAAATTTGTTGACGAGCTG-3/ ，
[0024]g4:5' -TTACTGGATGATATCCATCGGCCGCATC-3,
[0025]g5:5’-CGGTACGTATTGGGGT TGTTTAGAGG-3’
[0026]g6:5，-CCGCGGCCGCCTACATCACCGCCCCCTTTG-3，
[0027]所述重組菌生產(chǎn)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的步驟為:將電轉(zhuǎn)化線性化重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-S2的陽性重組畢赤酵母GS115/pPIC9-S2在20-30 V、100-250rpm條件下培養(yǎng)至0D6QQ=2.0-6.0,隨后轉(zhuǎn)入10-28°C培養(yǎng)并加入終濃度為0.1-2.0%的甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)30-120h，轉(zhuǎn)速 100-250rpm。
[0028]本發(fā)明首次從A.0ryzae中分離、鑒定了脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶基因，由于A.0ryzae野生菌株的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶表達(dá)水平低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)化應(yīng)用要求，因此選用畢赤酵母重組表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶能大幅提高其產(chǎn)量，使更易達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用要求。本發(fā)明利用畢赤酵母GS115成功構(gòu)建了一株高可溶性表達(dá)A.0ryzae脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶蛋白的酵母工程菌，并對表達(dá)的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶蛋白進(jìn)行了純化。所得重組酶對酸性、高溫和酶抑制劑均有很好的耐受性。
[0029]本發(fā)明對純化獲得的重組脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶進(jìn)行了最適作用pH、pH穩(wěn)定性、最適作用溫度及溫度穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明該脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶以Z-Gly-Pro-pNA為底物時,最適作用pH為5.0,最適作用溫度為40°C ;結(jié)果還顯示該脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶PH穩(wěn)定性及溫度穩(wěn)定性都非常好。
[0030]本發(fā)明要解決的另外一個技術(shù)問題是提供上述重組脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶在提高啤酒，葡萄酒，果汁飲品等非生物穩(wěn)定性中的應(yīng)用，尤其是對提高啤酒非生物穩(wěn)定性的應(yīng)用。
[0031]本發(fā)明分析了純化的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶對啤酒非生物穩(wěn)定性的影響，數(shù)據(jù)表明試驗(yàn)樣(添加脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶)的非生物穩(wěn)定性指標(biāo)(冷混濁)優(yōu)于對照樣，6+1冷熱混濁實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠達(dá)到相應(yīng)的貨架期要求，并且成品啤酒貯存期間(六周)對照組的起始濁度和貯存過程中的濁度增加明顯高于試驗(yàn)組。以上數(shù)據(jù)表明該重組脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶具有很好提高啤酒非生物穩(wěn)定性的效果，具有較大應(yīng)用潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為PCR擴(kuò)增的A.0ryzae脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶基因S2、蛋白質(zhì)序列的功能區(qū)預(yù)測及BLASTp相似性檢索部分結(jié)果；(A)M:DL2000Marker ；1:脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶基因S2 ;(B) A.0ryzae脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶蛋白序列保守功能區(qū)預(yù)測。
[0033]圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的信號肽預(yù)測結(jié)果圖；
[0034]圖3是本發(fā)明實(shí)施例2的利用“同源建?！狈A(yù)測及其軟件分析的米曲霉脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶功能結(jié)構(gòu)圖示；
[0035]圖4是本發(fā)明實(shí)施例3的pPIC9-S2酶切鑒定圖；
[0036]圖5是本發(fā)明實(shí)施例3的pPIC9-S2SDS-PAGE及native-SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。
[0037]圖6是脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶應(yīng)用于提高啤酒非生物穩(wěn)定性的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
[0039]下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些 實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0040]在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0041]實(shí)施例1A.0ryzae脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶基因的獲得
[0042]根據(jù)產(chǎn)氣單胞菌(Genbank:AF065429)，假平胞菌莢膜(Genbank: AB010298)，黃色粘球菌(Genbank:ABF89794)以及煙曲霉(Genbank:XM744168)和黑曲霉(Genbank:AX458699)來源的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)簡并引物如下:
[0043]gl:5-RASMTWSRYATYASGGRA-3 ；
[0044]g2:5-SVBYCBCYMBRGRKMANRNTB-3 ；
[0045]以米曲霉cDNA為模板，gl和g2為引物進(jìn)行PCR后，得到1000bp的產(chǎn)物片段，將產(chǎn)物進(jìn)行測序后，在NCBI比對后，發(fā)現(xiàn)其均與A.0ryzae蛋白酶基因(Sequence ID:ΧΜ_001825944.2)的保守序列同源性較高。
[0046]進(jìn)而，我們根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已公開的A.0ryzae蛋白酶基因(Sequence ID:ΧΜ_001825944.2)序列，重新設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR，其步驟如下:
[0047]根據(jù)NCBI公共數(shù)據(jù)庫的序列信息設(shè)計(jì)5’端和3’端引物，以米曲霉I號菌株的cDNA為模板，采用RT-PCR的方法獲得米曲霉脯氨酸內(nèi)切蛋白的全長編碼序列S2。
[0048]1.引物設(shè)計(jì)(下劃線為酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)為保護(hù)堿基，有效序列為酶切位點(diǎn)后序列)
[0049]g3:5 ’ -CGGTACGTAATGCGTTTCGACCTCTTTCTAAT-3，(SEQ ID.3)
[0050]g4:5? -CCGCGGCCGCCTACTACATCACCGCCCCCTTTGTTAT-3，(SEQ ID.4)
[0051]2.RT-PCR
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種高效表達(dá)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的酵母工程菌，其特征在于是將基因S2導(dǎo)入畢氏酵母(Pichia pastoris)進(jìn)行高效表達(dá)；所述基因S2編碼一種新的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶，核苷酸序列如以下I)或2)所示: 1)其核苷酸序列為SEQID N0.1，SEQ ID N0.2所示核苷酸序列；
2)在I)限定的核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有編碼有活性的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于所述畢氏酵母為GS115，KM71或SMDl168。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述畢氏酵母優(yōu)選GS115。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述酵母工程菌的方法，其步驟如下: (1)設(shè)計(jì)引物，利用PCR獲得基因S2序列，并對其密碼子進(jìn)行改造； (2)通過雙酶切、連接將蛋白酶基因S2插入到表達(dá)質(zhì)粒pPIC9，pPIC3K，pPIC9K，PA0815和或pPICZ α系列及其類似載體； (3)將步驟2)獲得的載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，ΚΜ71或SMDl168，獲得酵母工程菌，通過G418抗生素平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行測序驗(yàn)證。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于優(yōu)選載體及宿主組合為PPIC9和畢赤酵母GS115。
6.以權(quán)利要求1所述酵母工程菌生產(chǎn)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的方法，其步驟如下: Cl)將權(quán)利要求1獲得的酵母工程菌在20-30 °c、100-250rpm條件下培養(yǎng)至OD600=2.0-6.0 ； (2)隨后轉(zhuǎn)入20-30°C培養(yǎng)并加入終濃度為0.1-1.0%的甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)30-120h，轉(zhuǎn)速100-250rpmo
7.—種權(quán)利要求1所述酵母工程菌在提高啤酒，葡萄酒，果汁飲品及其他非生物穩(wěn)定性產(chǎn)品的應(yīng)用。
【文檔編號】A23L2/84GK103602605SQ201310568071
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】喻曉蔚, 徐巖, 康超 申請人:江南大學(xué)