雞傳染性喉氣管炎病毒的雞胚培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供雞傳染性喉氣管炎病毒的雞胚培養(yǎng)方法，將雞傳染性喉氣管炎病毒株用病毒稀釋液做5倍稀釋?zhuān)鳛樵海侔?0-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度稀釋?zhuān)謩e取0.2mL經(jīng)絨毛尿囊膜接種10日齡SPF雞胚；雞胚于37℃、56%相對(duì)濕度孵化148h，無(wú)菌收集72～148h死亡雞胚，3500r/min離心20min，取上清液，用于下次傳代，共傳3代。無(wú)菌收集72～148h死亡雞胚，將病變的尿囊液及絨毛尿囊膜置于研磨器，逐漸加入尿囊液，充分研磨，4000r/min離心30min，上清液即為病毒液，-20℃保存。本技術(shù)具有取材容易、效率高、速度快、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】雞傳染性喉氣管炎病毒的雞胚培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)，特別涉及一種雞傳染性喉氣管炎病毒的雞胚培養(yǎng)方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]雞傳染性喉氣管炎(Avianinfectious laryngotracheitis, AILT)是一種急性、高度接觸傳染性呼吸道疾病，該病由皰疹病毒科-α皰疹病毒亞科的喉氣管炎病毒(ILTV)引起，傳播快，臨床特征是伸頸、張口呼吸、咳血痰，死亡率增高和產(chǎn)蛋下降。天然感染的主要途徑是上呼吸道和眼結(jié)膜。自然感染的潛伏期6~12d。氣管內(nèi)接種2~4d即可發(fā)病。病程一般為10~14d。易感雞群發(fā)病率可達(dá)90%~100%，死亡率達(dá)20%~30%，有合并感染時(shí)可高達(dá)50%以上，造成養(yǎng)雞業(yè)的嚴(yán)重?fù)p失。
[0004]目前病毒的培養(yǎng)方法主要有自然宿主、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(易感動(dòng)物)接種、傳代培養(yǎng)、雞胚接種或細(xì)胞培養(yǎng)等。其中雞胚接種培養(yǎng)技術(shù)比組織培養(yǎng)容易成功，也比接種動(dòng)物的來(lái)源容易，無(wú)飼養(yǎng)管理及隔離等的特殊要求，且雞胚一般無(wú)病毒隱性感染，因此是常用的一種培養(yǎng)病毒的方法，此方法可用于某些病毒的分離、增殖、毒力滴定、中和試驗(yàn)及生產(chǎn)疫苗等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明技術(shù)為雞傳染性 喉氣管炎病毒(ILTV)的雞胚培養(yǎng)方法，包括以下步驟: 將雞傳染性喉氣管炎病毒株用病毒稀釋液(為每ImL滅菌生理鹽水含鹽酸環(huán)丙沙星
進(jìn)行5倍稀釋?zhuān)鳛樵?，再?0' 10_2、10' 10_4、IO-5的梯度稀釋?zhuān)缓蟀?個(gè)梯度稀釋的0.2mL病毒液經(jīng)絨毛尿囊膜，分別接種于10日齡SPF雞胚。以及
雞胚在數(shù)字智能化孵化機(jī)中37°C、56%相對(duì)濕度下孵化，3h翻蛋一次。48小時(shí)棄去死亡雞胚，觀察至148小時(shí)，詳細(xì)記錄死亡與存活數(shù)。無(wú)菌收集72~148小時(shí)死亡雞胚，3500r/min離心20 min，取上清液，用于下次傳代培養(yǎng)。
[0006]如此重復(fù)三次，共傳3代。無(wú)菌收集72~148小時(shí)死亡雞胚。將發(fā)生病變的尿囊液及絨毛尿囊膜置于組織研磨器中，逐漸加入尿囊液，充分研磨，4000r/ min離心30 min,取上清液，即為ILTV病毒液(種子液)，-20°C保存。
[0007]其主要特點(diǎn)是:
(1)雞胚的來(lái)源比自然宿主、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(易感動(dòng)物)和細(xì)胞等材料更容易獲得，無(wú)飼養(yǎng)管理及隔離等的特殊要求，且雞胚一般，培養(yǎng)的成本低；
(2)接種方法簡(jiǎn)便易行，SPF雞胚無(wú)雜菌，無(wú)病毒隱性感染，培養(yǎng)純度高，培養(yǎng)時(shí)間短。
[0008](3)病毒繁殖速度快，擴(kuò)增量大。
[0009]總之，本技術(shù)發(fā)明具有取材容易、效率高、速度快、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)?？捎糜陔u傳染性喉氣管炎病毒的分離、增殖、毒力滴定、中和試驗(yàn)及生產(chǎn)疫苗等?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1是本技術(shù)發(fā)明雞傳染性喉氣管炎病毒的雞胚培養(yǎng)方法的流程圖
[0010]【具體實(shí)施方式】
1.病毒稀釋
將雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)標(biāo)準(zhǔn)株用病毒稀釋液進(jìn)行5倍稀釋?zhuān)鳛樵?。再?0' 10_2、10' 10' 10_5的梯度稀釋后接種雞胚。
[0011]2.雞胚接種與培養(yǎng)條件
采用FT-K數(shù)字智能化孵化機(jī)。所用SPF雞胚為自行孵化，取10日齡雞胚35枚，分為7組。每個(gè)雞胚分別接毒10_1、10_2、10_3、10_4、10_5梯度的病毒稀釋液0.21^，每個(gè)稀釋梯度用5枚雞胚，其余5枚雞胚作為對(duì)照組接種生理鹽水。37°C、56%相對(duì)濕度下孵化，3h翻蛋一次。棄去48h內(nèi)死亡雞胚，觀察148h，詳細(xì)記錄死亡與存活數(shù)。無(wú)菌收集72~148h死亡雞胚，3500r/min離心，取上清液，作為種子液，_20°C保存待用。
[0012]3.雞胚半數(shù)致死量(ELD50)
按Reed-Menuch氏法計(jì)算ILTV的雞胚半數(shù)致死量(ELD50)。
[0013]距離比值=(66.7%-50%) / (66.7%_33.3%) =0.50。
[0014]Lg EID50=-2+0.50 X (-1) =-2.50。
[0015]EID50=I(T2 5ciA).2mL。
[0016]該毒株的毒價(jià)為ID50 = 10_2 5°/0.2mL,可以引起雞胚148小時(shí)內(nèi)半數(shù)發(fā)生死亡，據(jù)此確定該病毒對(duì)雞胚的感染劑量為每只IO-1UO-2U(T3A)J mL。
[0017]剖檢雞胚可見(jiàn)絨毛尿囊膜(CAM)水腫、增厚，有數(shù)量不等、大小不一、不透明的灰白色痘斑，胚體表面出血等ILT的特征性病變。
[0018]4.效價(jià)測(cè)定
病毒種子液用滅菌生理鹽水(每Iml含青霉素和鏈霉素各2000u)做ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'Κ3稀釋?zhuān)臃N10日齡雞胚，進(jìn)行雞胚傳代培養(yǎng)，孵化條件同上，離心后取上清液，_20°C保存。
[0019]重復(fù)上述過(guò)程，進(jìn)行第二次傳代培養(yǎng)，離心后取上清液，用于下次傳代培養(yǎng)，如此重復(fù)三次，共傳3代 。棄去48h內(nèi)死亡雞胚，觀察148h，詳細(xì)記錄死亡與存活數(shù)。無(wú)菌收集72~148h死亡雞胚，將發(fā)生病變的尿囊液及絨毛尿囊膜置于組織研磨器中，逐漸加入尿囊液，充分研磨，4000r/ min離心30 min，取上清液，即為ILTV病毒液(種子液)，_20°C保存。
[0020]分離病毒的滴度為1(T5_7ID50。
【權(quán)利要求】
1.本技術(shù)發(fā)明“雞傳染性喉氣管炎病毒的雞胚培養(yǎng)方法”，包括以下步驟: 將雞傳染性喉氣管炎病毒株用病毒稀釋液(稀釋液為每IrnL滅菌生理鹽水含鹽酸環(huán)丙沙星IOyg)進(jìn)行5倍稀釋?zhuān)鳛樵?；再按Ι?ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—5的梯度稀釋?zhuān)缓蟀?個(gè)梯度稀釋的0.2mL病毒液經(jīng)絨毛尿囊膜，分別接種于10日齡SPF雞胚。
2.以及雞胚在數(shù)字智能化孵化機(jī)中37°C、56%相對(duì)濕度下孵化，3h翻蛋一次；48小時(shí)棄去死亡雞胚，觀察至148小時(shí)，詳細(xì)記錄死亡與存活數(shù)；無(wú)菌收集72~148小時(shí)死亡雞胚，3500r/min離心20 min，取上清液，用于下次傳代培養(yǎng)，共傳3代；無(wú)菌收集72~148小時(shí)死亡雞胚，將發(fā)生病變的尿囊液及絨毛尿囊膜置于組織研磨器中，逐漸加入尿囊液，充分研磨，4000r/ min離心30 min，取上清液，即為ILTV病毒液(種子液)，-20°C保存。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103614343SQ201310570209
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月16日
【發(fā)明者】魏鎖成, 鞏轉(zhuǎn)娣, 張繼瑜 申請(qǐng)人:魏鎖成, 鞏轉(zhuǎn)娣, 張繼瑜