循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物及醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及一種將血液樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞從混合細(xì)胞群體中高純度分離出來的系統(tǒng)。所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，包括樣品準(zhǔn)備模塊、進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片、釋放模塊和收集模塊，所述樣品準(zhǔn)備模塊用于將血液處理為檢測樣品，所述進(jìn)樣模塊用于將檢測樣品注入第一微流控芯片，所述第一微流控芯片用于提取檢測樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，所述釋放模塊用于使循環(huán)腫瘤細(xì)胞脫離第一微流控芯片獲得采集樣品，所述收集模塊用于收集采集樣品。本發(fā)明提供的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有系統(tǒng)簡單，易于實(shí)現(xiàn)；成本更低；操作簡單，自動化程度高。
【專利說明】循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物及醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及一種將血樣中循環(huán)腫瘤細(xì)胞從混合細(xì)胞群體中高純度分離出來的系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]稀有細(xì)胞是指生物樣本中存在的數(shù)量稀少卻具有重要生物學(xué)功能或臨床檢測意義的細(xì)胞，如人外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、被病毒感染的細(xì)胞，孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞，以及實(shí)體腫瘤中的腫瘤干細(xì)胞等。由于稀有細(xì)胞數(shù)量極其稀少，在大量背景細(xì)胞的干擾下通常無法直接進(jìn)行檢測，因此必須發(fā)展高效、快速的將稀有細(xì)胞從復(fù)雜生物樣本中分離出來的方法與設(shè)備。
[0003]人外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是一類具有代表性的稀有細(xì)胞，它是指自發(fā)或因診療操作由腫瘤病灶播散進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，并在一定條件下可發(fā)展為腫瘤轉(zhuǎn)移性病灶(Racila E, Euhus D, Weiss AJ, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.1998, 95, 4589-4594; Pantel K，Brakenhoff RH, Nat.Rev.Cancer2004, 4，448-456 ; Zhe XN, Cher ML, Bonfil RD, Am.J.CancerRes.2011, I,740-751;Butler TP,Gullino PM,Cancer Res.1975，35，512-516)。由于超過90%的癌癥死亡是由轉(zhuǎn)移造成的(Mehlen P，Puisieux A, Nat.Rev.Cancer2006, 6, 449 - 458),而循環(huán)腫瘤細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移灶的直接來源(DawoodS,Cristofanilli M, Curr.Treat Options Oncol.2007, 8, 89-95;Fidler IJ, Nat.Rev.Cancer2003, 3，453 - 458)，因此循環(huán)腫瘤細(xì)胞是一種具有重大生物學(xué)意義和臨床價(jià)值的稀有細(xì)胞，從血液中檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞越來越引起人們的重視。但是，循環(huán)腫瘤細(xì)胞在外周血中含量極少，每IOmL血液可能僅含幾個(gè)到幾十個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，卻有高達(dá)約I億個(gè)白細(xì)胞和 500億個(gè)紅細(xì)胞(Zh e XN, Cher ML, Bonfil RD, Am.J.Cancer Res.2011，1，740-751)，在數(shù)量巨大的背景細(xì)胞的干擾下無法對循環(huán)腫瘤細(xì)胞直接檢測，這種檢測包括基因突變、表面標(biāo)志物、細(xì)胞活性、分泌蛋白譜以及力學(xué)性質(zhì)等，所以將循環(huán)腫瘤細(xì)胞從外周血中分離出來成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測前的必須的步驟。
[0004]國際上已有多家公司致力于開發(fā)循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離與分析系統(tǒng)，其中唯一被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的產(chǎn)品是強(qiáng)生公司的CellSearch?系統(tǒng)被批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌與前列腺癌的預(yù)后評估、無進(jìn)展生存期和總生存期的預(yù)測。我國國家食品藥品管理局在2012年8月批準(zhǔn)CellSearch?系統(tǒng)用于乳腺癌的預(yù)后評估。CellSearch?系統(tǒng)通過免疫磁珠從血液中捕獲CTC，并通過對細(xì)胞核以及細(xì)胞表面標(biāo)志物的多重染色進(jìn)行確認(rèn)并計(jì)數(shù)，然后根據(jù)7.5毫升外周血中檢測到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行預(yù)后評估。其他開發(fā)循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離與分析系統(tǒng)的公司包括Rarecell (德國)、ScreenCell (法國)、Abnova (中國臺灣)、Clearbridge (新加坡)、Cytotrack (美國)、Cynvenio Biosystems (美國)、ApoCell (美國)、FLUXION (美國)、Epic Science (美國)、Silicon Biosystems (意大利)、AndaGen (德國)等。[0005]目前從人外周血中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法主要可分為兩類，這兩類方法同時(shí)也代表了從復(fù)雜生物學(xué)樣品中分離稀有細(xì)胞的主要策略。一類方法是基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血液中其他細(xì)胞物理性質(zhì)的差異，如密度、大小、軟硬程度等的不同實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞與其他細(xì)胞的分離；另一類方法主要基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血液中其他細(xì)胞表面標(biāo)志物的差異，基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原，通過固定在基底表面或磁性顆粒上的針對循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的抗體或核算適配體實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲并與血液中其他細(xì)胞實(shí)現(xiàn)分離。CellSearch系統(tǒng)對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離就是基于這種方法。
[0006]近年來通過將微流控技術(shù)與抗體捕獲相結(jié)合發(fā)展出了一系列的循環(huán)腫瘤細(xì)胞芯片捕獲技術(shù)，可以保持CTC的活性，為了提高其微通道的捕獲效率，目前的研究重點(diǎn)均集中在微通道表面的形狀上，如微柱陣列芯片(Nagrath S，Sequist LV, Maheswaran S，et a
1.Nature2007, 450, 1235-1239;Maheswaran S,Sequist LV, Nagrath S, et al.N.Engl.J.Med.2008，359，366-377)、表面具有周期性凹凸結(jié)構(gòu)“魚骨型”芯片(Stott SL, HsuC-H, Tsukrov DI, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2010，107，18392-18397)等。
[0007]但是，以上技術(shù)和系統(tǒng)目前仍存在以下缺陷:
[0008]I)捕獲到循環(huán)腫瘤細(xì)胞的純度較低，存在大量白細(xì)胞的非特異性吸附，需要通過特異性染色鑒別循環(huán)腫瘤細(xì)胞，耗時(shí)且容易出現(xiàn)假陽性；
[0009]2)捕獲到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞往往被固定在芯片表面，無法釋放進(jìn)行后續(xù)的檢測。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]目前，我們研發(fā)出了一種能夠解決以上問題的分離方法:主要是對捕獲抗體進(jìn)行修飾，具體是標(biāo)記上標(biāo)記多核苷酸形成抗體-單鏈標(biāo)記多核苷酸復(fù)合物，微流控芯片內(nèi)負(fù)載有與標(biāo)記多核苷酸互補(bǔ)的單鏈固定多核苷酸。抗體與循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原結(jié)合，標(biāo)記多核苷酸與固定多核苷酸特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈核苷酸結(jié)構(gòu)，從而從樣品中捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞并固定到微流控芯片的微通道表面。所述標(biāo)記多核苷酸或固定多核苷酸中包含光敏基團(tuán)，在一定波長的紫外光照射下即可斷裂，因此在原有分離方法的基礎(chǔ)上，通過紫外光照射切斷雙鏈核苷酸來釋放被固定在微通道表面的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并進(jìn)行收集。增加的釋放模塊使循環(huán)腫瘤細(xì)胞的后續(xù)檢測成為可能，另外通過捕獲釋放兩個(gè)過程分別將不吸附的物質(zhì)和非特異性吸附的白細(xì)胞與循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離，大大提高了其純度。該方法目前還沒有相適應(yīng)的系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)。
[0011]基于以上研究成果，本發(fā)明提供了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，能夠從血液樣品中高效捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并解決分離系統(tǒng)存在嚴(yán)重的非特異性吸附、無法收集捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測的問題。
[0012]本發(fā)明的技術(shù)方案是:所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，包括樣品準(zhǔn)備模塊、進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片、釋放模塊和收集模塊，所述樣品準(zhǔn)備模塊用于將血液處理為檢測樣品，所述進(jìn)樣模塊用于將檢測樣品注入第一微流控芯片，所述第一微流控芯片用于提取檢測樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，所述釋放模塊用于使循環(huán)腫瘤細(xì)胞脫離第一微流控芯片獲得采集樣品，所述收集模塊用于收集采集樣品。
[0013]優(yōu)選地是，所述檢測樣品是全血首先經(jīng)抗凝處理或紅細(xì)胞裂解處理，然后與抗體-單鏈標(biāo)記多核苷酸復(fù)合物混合孵育獲得的樣品?？贵w-單鏈標(biāo)記多核苷酸復(fù)合物可以在三維空間中與血樣中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞重復(fù)的接觸和結(jié)合，與現(xiàn)有技術(shù)中通過微流控芯片負(fù)載的抗體去結(jié)合來比，結(jié)合效率大大提高。
[0014]優(yōu)選地是，所述第一微流控芯片的微通道表面上負(fù)載有單鏈固定多核苷酸，所述固定多核苷酸與檢測樣品上的單鏈標(biāo)記多核苷酸可特異性結(jié)合，所述單鏈標(biāo)記多核苷酸或固定多核苷酸中包含可被特征波長紫外光切斷的光敏基團(tuán)。與現(xiàn)有技術(shù)中通過負(fù)載抗體的磁珠來捕獲，并通過磁場固定在微通道內(nèi)的方式相比，通過固定多核苷酸和標(biāo)記多核苷酸的特異性結(jié)合來固定，洗脫分離時(shí)的損失大大降低。
[0015]優(yōu)選地是，還包括第二微流控芯片，所述第二微流控芯片用于提取采集樣品中的殘余白細(xì)胞，并將剔除白細(xì)胞后的樣品導(dǎo)入收集模塊。進(jìn)一步提高采集樣品中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的純度。
[0016]優(yōu)選地是，所述第一微流控芯片與第二微流控芯片的入口通過微管連接，所述微管上設(shè)置閥門。從第一微流控芯片中流出攜帶釋放的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的采集樣品通過微管進(jìn)入第二微流控芯片內(nèi)，在第二微流控芯片中將其中殘留的白細(xì)胞捕獲。
[0017]優(yōu)選地是，所述第二微流控芯片的微通道表面負(fù)載有針對白細(xì)胞表面特異性抗原的白細(xì)胞捕獲抗體，所述采集樣品流經(jīng)第二微流控芯片時(shí)，其中殘留的白細(xì)胞表面抗原與負(fù)載的白細(xì)胞捕獲抗體結(jié)合，將白細(xì)胞固定在第二微流控芯片的微通道內(nèi)。這樣使得采集樣品中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的純度進(jìn)一步提聞。
[0018]優(yōu)選地是，所述進(jìn)樣模塊為樣品注射器件，所述釋放模塊為發(fā)射紫外光光源，所述樣品注射器件出口與第一微流控芯片的進(jìn)樣口相接，所述發(fā)射紫外光光源設(shè)置在第一微流控芯片的微通道上。
[0019]樣品注射器件可以為注射器、自動化注射器和恒流泵的一種或者一種以上的組
口 o·[0020]本領(lǐng)域技術(shù)人員都清楚微流控芯片一般包括進(jìn)樣口、微通道、洗脫液貯液池、廢液收集器和各部分之間的閥門，還可以根據(jù)需要設(shè)置更多檢測需要的原料貯液池等。
[0021]優(yōu)選地是，所述第一微流控芯片和第二微流控芯片的微通道表面上設(shè)置微結(jié)構(gòu)，所述微結(jié)構(gòu)為周期性的微柱陣列結(jié)構(gòu)、周期性表面凹凸的魚骨型結(jié)構(gòu)、沉積的納米線或沉積的納米帶。
[0022]優(yōu)選地是，還包括控制模塊，所述控制模塊用于控制進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片、第二微流控芯片、釋放模塊以及收集模塊的工作。
[0023]優(yōu)選地是，所述控制模塊為計(jì)算機(jī)或單片機(jī)。
[0024]本發(fā)明提供的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn):
[0025]I)系統(tǒng)簡單，易于實(shí)現(xiàn)。在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上增加釋放模塊即可克服嚴(yán)重的非特異性吸附問題，增加的第二微流控芯片更可以進(jìn)一步提高收集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的純度；
[0026]2)成本更低。商業(yè)化系統(tǒng)，如CellSearch的細(xì)胞捕獲系統(tǒng)，系統(tǒng)復(fù)雜，成本高昂，與之相比本發(fā)明提供的技術(shù)方案成本低廉，更易于市場推廣；
[0027]3)操作簡單，自動化程度高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是本發(fā)明所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)一【具體實(shí)施方式】的結(jié)構(gòu)示意圖；[0029]圖2是本發(fā)明所述第一微流控芯片、第二微流控芯片和微管的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0030]圖中所示:
[0031]1-注射器,2-微管,21-第一單向閥,3-第一微流控芯片,31-第一微通道,32-進(jìn)樣口，33-第一廢液收集器，34-第一出液口，35-第一閥門，4-第二微流控芯片，41-第二微通道，42-第二廢液收集器，43-第二閥門，44-進(jìn)液口，45-第二出液口，5-紫外燈，6-循環(huán)腫瘤細(xì)胞收集器，61-第二單向閥，7-計(jì)算機(jī)。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細(xì)描述:
[0033]如圖1所示，本發(fā)明所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)包括樣品準(zhǔn)備模塊、進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片3、第二微流控芯片4、釋放模塊、收集模塊和控制模塊。
[0034]所述樣品準(zhǔn)備模塊用于將血液處理為檢測樣品，所述檢測樣品是將1000個(gè)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞HCTl 16用細(xì)胞膜紅色熒光探針DiI染成紅色，然后與I毫升經(jīng)抗凝處理的健康人的全血或者經(jīng)過紅細(xì)胞裂解的全血混合，同時(shí)加入I微升lmg/ml抗體-單鏈標(biāo)記多核苷酸復(fù)合物，將混合物置于搖床上共同充分孵育半小時(shí)獲得的樣品。其中所述抗體-單鏈標(biāo)記多核苷酸復(fù)合物是上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM,購自美國R&D Systems公司)與單鏈標(biāo)記多核苷酸(SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3序列見表1，由生工生物合成)混合后置于搖床上共同充分孵育半小時(shí)獲得。所述單鏈標(biāo)記多核苷酸(SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3)序列終包括可被波長為365nm的紫外光切斷的光敏基團(tuán)-PC spacer。
[0035]所述進(jìn)樣模塊包括注射器I。
[0036]如圖1和2所示，所述第一微流控芯片3包括第一微通道31、設(shè)置在第一微通道31 一端的進(jìn)樣口 32、設(shè)置在第一微通道31另一端的第一出液口 34、與第一出液口 34相連的第一廢液收集器33,第一廢液收集器33與第一微通道31之間的第一閥門35。
[0037]所述第一微通道31的表面設(shè)有微結(jié)構(gòu)，所述微結(jié)構(gòu)為周期性表面凹凸的魚骨型結(jié)構(gòu)(制作方法 JAL Wang, S.T.; Liu, K.; Liu, J.A.et al,.Angew.Chem.1nt.Ed.2011,50, 3084-3088 )，其中“魚骨”寬度為35 y m，水平夾角為45度，周期性間隔為100 u m, 一組共20條“魚骨”。
[0038]所述第一微通道31的魚骨結(jié)構(gòu)表面上負(fù)載有固定多核苷酸SEQ ID N0.1(序列見表1)。
[0039]如圖1和2所示，所述第二微流控芯片4包括第二微通道41、設(shè)置在第二微通道41 一端的進(jìn)液口 44、設(shè)置在第二微通道41另一端的第二出液口 45、與第二出液口 45相連的第二廢液收集器42以及第二微通道41與第二廢液收集器42之間的第二閥門43。
[0040]所述第二微通道41的結(jié)構(gòu)與第一微通道31相同的“魚骨”結(jié)構(gòu)。
[0041]所述第二微通道41的魚骨結(jié)構(gòu)表面上負(fù)載白細(xì)胞捕獲抗體，所述白細(xì)胞捕獲抗體是針對白細(xì)胞表面抗原CD45的抗體(購自美國R&D Systems公司)。
[0042]如圖2所示，所述第一微流控芯片3與第二微流控芯片4之間設(shè)置微管2，所述微管2 —端與第一微流控芯片3的第一出液口 34相連，另一端與第二微流控芯片4的進(jìn)液口44相連，所述微管2上設(shè)置第一單向閥21。
[0043]所述釋放模塊為紫外燈5 (購自美國Cole-Parmer公司，功率為40W，功率密度為1.19mW/cm2)，所述紫外燈5設(shè)置在第一微通道31上方。
[0044]所述收集模塊為循環(huán)腫瘤細(xì)胞收集器6，所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞收集器6與第二微通道41相通，所述第二微通道41與循環(huán)腫瘤細(xì)胞收集器6之間設(shè)置第二單向閥61。
[0045]所述控制模塊為計(jì)算機(jī)7，所述計(jì)算機(jī)7分別與注射器1、紫外照明燈5、第一單向閥21、第二單向閥61、第一閥門35和第二閥門43相連。
[0046]表1
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，包括樣品準(zhǔn)備模塊、進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片、釋放模塊和收集模塊，所述樣品準(zhǔn)備模塊用于將血液處理為檢測樣品，所述進(jìn)樣模塊用于將檢測樣品注入第一微流控芯片，所述第一微流控芯片用于提取檢測樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，所述釋放模塊用于使循環(huán)腫瘤細(xì)胞脫離第一微流控芯片獲得采集樣品，所述收集模塊用于收集采集樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測樣品是全血首先經(jīng)抗凝處理或紅細(xì)胞裂解處理，然后與抗體-單鏈標(biāo)記多核苷酸復(fù)合物混合孵育獲得的樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述第一微流控芯片的微通道表面上負(fù)載有單鏈固定多核苷酸，所述固定多核苷酸與檢測樣品上的單鏈標(biāo)記多核苷酸可特異性結(jié)合，所述單鏈標(biāo)記多核苷酸或固定多核苷酸中包含可被特征波長紫外光切斷的光敏基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3任一所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述釋放模塊為發(fā)射紫外光光源，所述發(fā)射紫外光光源設(shè)置在第一微流控芯片的微通道上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，還包括第二微流控芯片，所述第二微流控芯片用于提取采集樣品中的殘余白細(xì)胞，并將剔除白細(xì)胞后的樣品導(dǎo)入收集模塊。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述第一微流控芯片與第二微流控芯片的入口通過微管連接，所述微管上設(shè)置閥門。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述第二微流控芯片的微通道表面負(fù)載有針對白細(xì)胞表面特異性抗原的白細(xì)胞捕獲抗體，所述采集樣品流經(jīng)第二微流控芯片時(shí)，其中殘留的白細(xì)胞表面抗原與負(fù)載的白細(xì)胞捕獲抗體結(jié)合，將白細(xì)胞固定在第二微流控芯片的微通道內(nèi)。·
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述第一微流控芯片和第二微流控芯片的微通道表面上設(shè)置微結(jié)構(gòu)，所述微結(jié)構(gòu)為周期性的微柱陣列結(jié)構(gòu)、周期性表面凹凸的魚骨型結(jié)構(gòu)、沉積的納米線或沉積的納米帶。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，還包括控制模塊，所述控制模塊用于控制進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片、第二微流控芯片、釋放模塊以及收集模塊的工作。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述控制模塊為計(jì)算機(jī)或單片機(jī)。
【文檔編號】C12M1/00GK103589629SQ201310571949
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】李小衛(wèi) 申請人:上?？滴⒔】悼萍加邢薰?br>