一種直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法，包括以下制備步驟：1）木葡萄糖酸醋桿菌菌泥；2）制備菌懸液；3）制備保護劑；4）菌懸液與保護劑混均；5）冷凍干燥；本發(fā)明直投式木葡萄酸醋桿菌發(fā)酵劑為干粉，水分活度在1%～3%，在4℃可保存3個月，在-20℃可保存18個月。本發(fā)明方法中以木葡萄糖酸醋桿菌的產(chǎn)物NATA為載體添加了脫脂乳、谷氨酸等為保護劑，同時NATA為多糖類，將木葡萄糖酸醋桿菌包裹著，具有很好的保護作用。另外，以木葡萄糖酸醋桿菌產(chǎn)物為載體作為保護劑，最后碾碎成粉狀，可以節(jié)約成本。
【專利說明】一種直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑及其制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體的是涉及一種直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑及其制備方法。【背景技術(shù)】[0002]纖維素是由D-葡萄糖以β_1，4糖苷鍵連接而成的鏈狀多糖高分子，是由 100-15000個葡萄糖單位形成的不同聚合度的長直鏈結(jié)晶纖維素聚合成的微纖絲單晶實體。纖維素是和人類生活最密切的材料，也是植物光合作用的主要產(chǎn)物之一，廣泛存在于樹木，棉花等植物中，也有少量存在于細菌和個別低級動物中，如某些海洋生物被囊綱的外膜能產(chǎn)動物纖維素，也有些細菌能以異養(yǎng)方式產(chǎn)高純度的胞外纖維素。能合成纖維素的微生物有醋酸菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobaeterium)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、無色桿菌屬(Achromobacter)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligcncs)、氣桿菌屬 (Aerobacter),固氮菌屬(Azotobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)和八疊球菌屬(Sarcina) 等的某些種，它們合成的纖維素統(tǒng)稱為細菌纖維素。目前能大批量工業(yè)化生產(chǎn)的是醋酸菌纖維素，它是由醋酸菌屬中的木葡萄糖酸醋桿菌、醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)、產(chǎn)醋醋桿菌(Acetobacteracotigenum)、巴氏醋桿菌(Acetobacter pastcurianum)產(chǎn)生的，其中木葡萄糖酸醋桿菌是合成纖維素能力最強的細菌[0003]木葡萄糖酸醋桿菌，根據(jù)《伯杰氏鑒定細菌手冊》，它屬于原核生物界細菌門下的革蘭氏陰性好氧桿菌和球菌中的假單細胞菌目假單細胞菌科醋酸桿菌屬。寬0.6-0.Sum, 長1.0-4.0um，以單個，成對或者鏈狀存在。它的菌落外觀呈圓形，不透明，突起，淡棕色，表面粗糙，大小一般在l_2mm，振蕩培養(yǎng)呈菌絲狀，靜置培養(yǎng)在表面形成不溶性的纖維素凝膠膜(細菌纖維素)。[0004]細菌纖維素主要應用于造紙工業(yè)、生物醫(yī)學、聲學器材和食品領(lǐng)域等。 Nata de coco (ΝΑΤΑ,椰纖果)是由木葡萄糖酸醋桿菌在液體有機基質(zhì)乳菠蘿，蘋果渣廢物，番茄汁， 椰子水等表面形成的細菌纖維素，在食品領(lǐng)域主要應用于果凍，罐頭，飲料等加工領(lǐng)域，也可以加入到口香糖、香腸等中改善口感和食品特性，也可作為腸衣和某些食品的骨架，是一種重要的新型食品基料。[0005]目前椰纖果發(fā)酵廠所使用的發(fā)酵菌種主要是傳統(tǒng)的木葡萄糖酸醋桿菌液體發(fā)酵齊?，均未進行過正式鑒定。菌種一般來自于科研機構(gòu)或企業(yè)相互間傳送，來源復雜退化現(xiàn)象嚴重，且在使用過程中容易感染雜菌、退化、生產(chǎn)效率低和保質(zhì)期短等缺點，對椰纖果生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化程度有一定的限制。近年來，低溫干燥技術(shù)發(fā)展迅速，研究開發(fā)新型木葡萄糖酸醋桿菌劑，簡化發(fā)酵椰纖果產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝，解決雜菌污染，菌種退化等現(xiàn)象，是目前椰纖果生產(chǎn)企業(yè)較迫切的需求。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的 目的是提供了生產(chǎn)效率高、保質(zhì)期長、應用時無需活化，無需擴培等預處理工作，可以直接添加到基質(zhì)中進行發(fā)酵的直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑及其制備方法。[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:提供一種直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法，包括以下制備步驟:[0008]I)木葡萄糖酸醋桿菌菌泥[0009]a、將先選育產(chǎn)細菌纖維素能力強的木葡萄糖醋酸桿菌，在120°C~130°C滅菌 20~30分鐘后的活化培養(yǎng)基上活化接種；活化溫度20°C~60°C，活化時間24~62小時；[0010]b、挑選單菌落在120°C~130°C滅菌20~30分鐘后的種子培養(yǎng)基中擴大細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20°C~60°C，培養(yǎng)時間24~62小時；獲得木葡萄糖酸醋桿菌液體菌種；優(yōu)選所述種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時間為30小時。[0011]C、將木葡萄糖酸醋桿菌液體菌種在4°C~8°C，以1000g~8000g離心速率，離心 10~30分鐘，收集細胞，獲得木葡萄糖酸醋桿菌菌泥；優(yōu)選所述木葡萄糖酸醋桿菌液體菌種在4°C，以7000g離心速率，離心10分鐘。[0012]2)制備菌懸液[0013]將步驟I)獲得的木葡萄糖酸醋桿菌菌泥用0.01~0.5mol/L, pH6.5~ρΗ7.5的 PBS緩沖液制備成菌懸液；[0014]3)制備保護劑[0015]將脫脂奶粉、海藻糖，蔗糖，乳糖，谷氨酸，甘氨酸，明膠，甘露醇分別用PBS緩沖液調(diào)制；脫脂奶粉、海藻糖，蔗糖，乳糖，谷氨酸，甘氨酸，明膠，甘露醇與PBS緩沖液的重量體積比分別為5~40%，5~20%，5~20%，5~20%，I~5%，I~5%，5~10%，I~5% ;調(diào)制后獲得以下八種保護劑:脫脂乳5~40%，海藻糖5~20%，蔗糖5~20%，乳糖5~20%，谷氨酸I~5%，甘氨酸I~5%，明膠5~10%，甘露醇I~5% ;優(yōu)選保護劑為脫脂乳10%，谷氨酸 1%的一種或兩種。[0016]4)菌懸液與保護劑混均[0017]a、將步驟2)的菌懸液與步驟3)的保護劑以1:2~5的體積比混勻，獲得菌懸液與保護劑的混合物；所述保護劑為脫脂乳5~40%，海藻糖5~20%，蔗糖5~20%，乳糖5~ 20%,谷氨酸I~5%,甘氨酸I~5%,明膠5~10%,甘露醇I~5%的一種或幾種混合；優(yōu)選所述菌懸液與保護劑以1:4的體積比混均。[0018]b、將菌懸液與保護劑的混合物放4°C~5°C冰箱I~2小時；[0019]5)冷凍干燥[0020]a、將步驟4)獲得的菌懸液與保護劑的混合物放-18~_55°C低溫冰箱冷凍2~ 12小時直至完全凍結(jié)；獲得木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑樣品；[0021]b、將木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑樣品用凍干機冷凍干燥，真空度為0.2MPa以下，干燥時間24~48小時，獲得直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑。[0022]所述活化培養(yǎng)基含 有(NH4)2SO4, MgS04、瓊脂，以自然發(fā)酵2天的椰子水，蒸餾水，PH5.0的固體培養(yǎng)基；該固體培養(yǎng)基中液體由椰子水和蒸餾水組成，椰子水與蒸餾水體積比為9:1;所述(NH4)2SO4, MgS04、瓊脂與該固體培養(yǎng)基中液體的重量體積比分別為0.2%, 0.05%, 2%。[0023]所述種子培養(yǎng)基含有蔗糖，(NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4,自然發(fā)酵5~7天的椰子水，pH4.0的液體培養(yǎng)基；所述該液體培養(yǎng)基中液體由椰子水構(gòu)成；蔗糖，(NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4與椰子水的重量體積比分別為5%，0.3%,0.2%,0.05%。[0024]所述PBS緩沖液的濃度為0.01~0.5mol/L ；pH為6.5~ρΗ7.5。[0025]所述木葡萄糖醋酸桿菌菌泥為木葡萄糖酸醋桿菌菌體及其產(chǎn)物NATA (細菌纖維素)。[0026]一種直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑，利用直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法獲得。[0027]上述方法適用所有目前纖維素發(fā)酵工廠使用的木葡萄糖酸醋桿菌。[0028]上述方法制備的直投式木葡萄酸醋桿菌發(fā)酵劑為干粉，水分活度在1%~3%，在 4°C可保存3個月，在-20°C可保存18個月。本發(fā)明方法中以木葡萄糖酸醋桿菌的產(chǎn)物NATA 為載體添加了脫脂乳、谷氨酸等為保護劑，同時NATA為多糖類，將木葡萄糖酸醋桿菌包裹著，具有很好的保護作用。另外，以木葡萄糖酸醋桿菌產(chǎn)物為載體作為保護劑，最后碾碎成粉狀，可以節(jié)約成本。[0029]本發(fā)明的木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑應用時無需活化，擴培等預處理工作，可以直接添加到基質(zhì)中進行發(fā)酵。[0030]本發(fā)明的木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑可以應用所有的發(fā)酵椰纖果產(chǎn)業(yè)，及細菌纖維素產(chǎn)業(yè)，也可以聯(lián)合酵母，乳酸菌等能夠共生的菌類應用于其他產(chǎn)業(yè)，如紅茶飲料?！揪唧w實施方式】[0031]實施例1[0032]一種直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法包括以下步驟:[0033]I)將斜面保存的木葡萄糖酸醋桿菌在活化培養(yǎng)基上劃線30°C培養(yǎng)，挑取單菌落在同樣的條件下活化三代，挑取單菌落在裝有100ml種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶內(nèi)30°C條件下第一次擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)時間48h ;獲得木葡萄糖酸醋桿菌液體菌種；[0034]2)將步驟I)獲得的木葡萄糖酸醋桿菌液體菌種按2%(V/V)的接種量接種到250ml 含有100ml的種子培養(yǎng)基中進行第二次擴培，溫度為30°C，培養(yǎng)時間為28h ；[0035]3)將步驟2)得到的液體按照2% (V/V)的接種量接種到250ml含有100ml的種子培養(yǎng)基中每隔2h進行活菌計數(shù)，確定木葡萄糖酸醋桿菌的對數(shù)生長期；[0036]4)將步驟I)得到的木葡萄糖酸醋桿菌液體菌種按照2% (V/V)的接種量分別接種到24份250ml含有100ml的種子培養(yǎng)基中，待木葡糖醋酸桿菌處于生長對數(shù)期后，將含有菌種的種子培養(yǎng)基在在4°C，7000g，離心10分鐘，收得率95.8%，收集含有NATA (細菌纖維素)的木葡萄糖酸醋桿菌菌泥，計算菌懸液的體積并進行平板計數(shù)；[0037]5)將步驟4)得到的木葡萄糖酸醋桿菌菌泥用0.01mol/L, pH7.0的PBS緩沖液制備成菌懸液，菌懸液分別與保護劑以1:4(V:V)混合，保護劑分別為脫脂乳10%，海藻糖5%， 蔗糖5%，乳糖5%，谷氨酸1%，甘氨酸1%，明膠5%，甘露醇1% ；[0038]6)將步驟5)得到的含有保護劑的菌懸液放4°C冰箱I小時后，放_35°C低溫冰箱內(nèi)凍結(jié)12小時；[0039]7)將步驟6)獲得的冰凍物裝上凍干機，在_40°C，0.2Mpa真空冷凍干燥36h，制得八種直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑；[0040]8)將上述八種直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑碾碎成粉狀；[0041]9)將步驟8)獲得的八種粉狀直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑用經(jīng)過高溫滅菌后的脫脂乳10%進行復水，復水后分別計算八種發(fā)酵劑的細胞存活率。復水是將無菌的脫脂乳10%添加到直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑中10分鐘；所述活菌計數(shù)的培養(yǎng)基含有 (NH4)2SO4, MgS04、瓊脂，以自然發(fā)酵2天的椰子水，蒸餾水，pH5.0的固體培養(yǎng)基；該固體培養(yǎng)基中液體由椰子水和蒸餾水組成，椰子水與蒸餾水體積比為9:1;所述(NH4)2SO4, MgSO4, 瓊脂與該固體培養(yǎng)基中液體的重量體積比分別為0.2%, 0.05%，2%。[0042]計算細胞存活率是按公式(I)計算細胞存活率:[0043]存活率=AcZA1X 100 %[0044]式中:[0045]Atl—凍干前的活菌數(shù)(ImL菌液的活菌數(shù)，CFU / mL)[0046]A1—凍干后的活菌數(shù)(ImL菌液的活菌數(shù)CFU / mL)。[0047]平板計數(shù)后活菌率最高的是脫脂乳和谷氨酸。[0048]該實施例1中通過了冷凍干燥將獲得的發(fā)酵劑粉末與含同濃度的含菌量的液體發(fā)酵劑同時用IOml經(jīng)過滅菌處理的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵14天，對比椰鮮果濕重。
【權(quán)利要求】
1.一種直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于包括以下制備步驟:1)木葡萄糖酸醋桿菌菌泥a、將先選育產(chǎn)細菌纖維素能力強的木葡萄糖醋酸桿菌，在120°C~130°C滅菌20~30 分鐘后的活化培養(yǎng)基上活化接種；活化溫度20°C~60°C，活化時間24~62小時；b、挑選單菌落在120°C~130°C滅菌20~30分鐘后的種子培養(yǎng)基中擴大細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20°C~60°C，培養(yǎng)時間24~62小時；獲得木葡萄糖酸醋桿菌液體菌種；C、將木葡萄糖酸醋桿菌液體菌種在4°C~8°C，以1000g~8000g離心速率，離心10~ 30分鐘，收集細胞，獲得木葡萄糖酸醋桿菌菌泥；2)制備菌懸液將步驟I)獲得的木葡萄糖酸醋桿菌菌泥用0.01~0.5mol/L, pH6.5~pH7.5的PBS 緩沖液制備成菌懸液；3)制備保護劑將脫脂奶粉、海藻糖，蔗糖，乳糖，谷氨酸，甘氨酸，明膠，甘露醇分別用PBS緩沖液調(diào)制；脫脂奶粉、海藻糖，蔗糖，乳糖，谷氨酸，甘氨酸，明膠，甘露醇與PBS緩沖液的重量體積比分別為5~40%，5~20%，5~20%，5~20%，I~5%，I~5%，5~10%，I~5% ;調(diào)制后獲得以下八種保護劑:脫脂乳5~40%，海藻糖5~20%，蔗糖5~20%，乳糖5~20%，谷氨酸 I~5%，甘氨酸I~5%，明膠5~10%，甘露醇I~5% ；4)菌懸液與保護劑混均a、將步驟2)的菌懸液與步驟3)的保護劑以1:2~5的體積比混勻，獲得菌懸液與保護劑的混合物；所述保護劑為脫脂乳5~40%，海藻糖5~20%，蔗糖5~20%，乳糖5~20%， 谷氨酸I~5%,甘氨酸I~5%,明膠5~10%,甘露醇I~5%的一種或幾種混合； b、將菌懸液與保護劑的混合物放4°C~5°C冰箱I~2小時；5)冷凍干燥a、將步驟4)獲得的菌懸液與保護劑的混合物放-18~_55°C低溫冰箱冷凍2~12小時直至完全凍結(jié)；獲得木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑樣品；b、將木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑樣品用凍干機冷凍干燥，真空度為0.2MPa以下，干燥時間24~48小時，獲得直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑。
2.如權(quán)利要求1所述的直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于:所述活化培養(yǎng)基含有(NH4)2SO4, MgS04、瓊脂，以自然發(fā)酵2天的椰子水，蒸餾水，pH5.0的固體培養(yǎng)基；該固體培養(yǎng)基中液體由椰子水和蒸餾水組成，椰子水與蒸餾水體積比為9:1;所述 (NH4)2SO4, MgSO4、瓊脂與該固體培養(yǎng)基中液體的重量體積比分別為0.2%, 0.05%，2%。
3.如權(quán)利要求1所述的直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基含有蔗糖，(NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4,自然發(fā)酵5~7天的椰子水，pH4.0的液體培養(yǎng)基；所述該液體培養(yǎng)基中液體由椰子水構(gòu)成；蔗糖，(NH4)2SO4,KH2PO4,MgSO4與椰子水的重量體積比分別為5%, 0.3%, 0.2%, 0.05%。
4.如權(quán)利要求1所述的直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時間為30小時。
5.如權(quán)利要求1所述的直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于:所述木葡萄糖酸醋桿菌液體菌種在4°C，以7000g離心速率，離心10分鐘。
6.如權(quán)利要求1所述的直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于:所述PBS緩沖液的濃度為0.01~0.5mol/L ；pH為6.5~ρΗ7.5。
7.如權(quán)利要求1所述的直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于:所述保護劑為脫脂乳10%，谷氨酸1%的一種或兩種。
8.如權(quán)利要求1所述的直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于:所述菌懸液與保護劑以1:4的體積比混均。
9.如權(quán)利要求1所述的直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于:所述木葡萄糖醋酸桿菌菌泥為木葡萄糖酸醋桿菌菌體及其產(chǎn)物ΝΑΤΑ。
10.一種直投式木葡萄糖`酸醋桿菌發(fā)酵劑，其特征在于利用權(quán)利要求1所述的直投式木葡萄糖酸醋桿菌發(fā)酵劑的制備方法獲得。
【文檔編號】C12N1/20GK103602617SQ201310572308
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】陳衛(wèi)軍, 顏巧麗, 鄧福明, 王揮, 趙松林 申請人:文昌中椰科技有限公司