一種檢測環(huán)境雌激素的重組酵母及其構(gòu)建方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測環(huán)境雌激素的重組酵母及其構(gòu)建方法和用途,該重組酵母含有酵母表達質(zhì)粒和酵母報告質(zhì)粒;所述的酵母表達質(zhì)粒包含序列如SEQ?ID?No.1所示的唐魚雌激素受體基因TERα;所述的酵母報告質(zhì)粒,其載體是pMP206,載體上連接序列如SEQ?ID?No.4所示的唐魚卵黃蛋白原基因啟動子2。本發(fā)明用唐魚雌激素受體構(gòu)建表達質(zhì)粒,用唐魚卵黃蛋白原啟動子連接報告基因構(gòu)建報告質(zhì)粒。唐魚對生存環(huán)境的變化反應(yīng)靈敏,是用生物方法監(jiān)測環(huán)境雌激素污染的一個極好的魚類生物標記物,而卵黃蛋白原又是一個很好的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的生物標志物。用唐魚的雌激素受體和唐魚卵黃蛋白原啟動子構(gòu)建重組酵母測評系統(tǒng),其在靈敏度上會有很大提高。
【專利說明】一種檢測環(huán)境雌激素的重組酵母及其構(gòu)建方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域,具體涉及一種檢測環(huán)境雌激素的重組酵母及其構(gòu)建方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]激素是生物內(nèi)分泌細胞分泌的高效生物活性物質(zhì),具有低濃度、高效力的特點。
[0003]環(huán)境激素是指環(huán)境中存在的,能夠模擬天然激素的作用,對生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)等產(chǎn)生嚴重影響的某些有毒化合物。
[0004]環(huán)境雌激素是最主要的一類環(huán)境激素,是生殖障礙、生殖系統(tǒng)畸形、發(fā)育異常、代謝紊亂以及某些惡性腫瘤發(fā)病率增加的主要原因之一。由于環(huán)境雌激素種類多、危害大、分布廣、作用機制復雜,其對生物體與環(huán)境的危害逐步被人們所重視。因此建立快速、靈敏、高效、低成本的針對環(huán)境雌激素的檢測方法已成為當務(wù)之急。
[0005]目前環(huán)境雌激素的檢測方法主要有化學分析方法和生物學檢測方法。
[0006]化學分析方法主要為一些色譜及質(zhì)譜法,儀器昂貴,操作復雜,對樣品的前處理過程要求非常高,檢測樣品較單一,具有一定的應(yīng)用局限性。
[0007]而生物學檢測方法中,重組基因酵母檢測法較為常見,主要是用人雌激素受體基因構(gòu)建表達質(zhì)粒,用雌激素效應(yīng)元件序列片段連接報告基因構(gòu)建報告質(zhì)粒。這不利于與一些在體實驗、胚胎致畸實驗和種群生態(tài)實驗等相互印證。
【發(fā)明內(nèi)容】
`[0008]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足,本發(fā)明的首要目的在于提供一種檢測環(huán)境雌激素的重組酵母。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供上述的檢測環(huán)境雌激素的重組酵母的構(gòu)建方法。
[0010]本發(fā)明的再一目的在于提供上述的檢測環(huán)境雌激素的重組酵母的用途。
[0011]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
[0012]一種檢測環(huán)境雌激素的重組酵母,含有酵母表達質(zhì)粒和酵母報告質(zhì)粒。
[0013]所述的酵母表達質(zhì)粒包含序列如SEQ ID N0.1所示的唐魚雌激素受體基因TERa。在表達載體中插入的是唐魚雌激素受體基因,能夠更好地受唐魚卵黃蛋白原啟動子的調(diào)控。
[0014]所述的酵母報告質(zhì)粒,其載體是pMP206,載體上連接序列如SEQ ID N0.4所示的唐魚卵黃蛋白原基因啟動子2 (promoter2)0 pMP206是常用的附加型酵母載體,其上帶有氨芐青霉素的抗性基因(Amp1O和營養(yǎng)缺陷型標記URA3基因,可以分別作為大腸桿菌和酵母系統(tǒng)中的篩選標記;同時還帶有一個編碼(6-半乳糖苷酶的全長LacZ報告基因,基本啟動子為細胞色素氧化酶基因啟動子(CYCl),該啟動子上游有可用于插入待研究的外源性基因的惟一酶切位點Hind III和Pst I,因此可將唐魚卵黃蛋白原啟動子序列插入其上游,從而構(gòu)建報告質(zhì)粒。因為本發(fā)明的唐魚卵黃蛋白原基因啟動子序列上含有雌激素反應(yīng)元件ERE,因此能特異性地對雌激素刺激產(chǎn)生反應(yīng)。
[0015]所述的酵母是酵母菌株AH109(MATa型),AH109是帶有營養(yǎng)缺陷篩選標記的菌株。
[0016]所述的酵母表達質(zhì)粒,其載體優(yōu)選pGADI7。PGADI7是常用的附加型酵母載體,其上攜帶的氨芐青霉素的抗性基因(Amp1O和營養(yǎng)缺陷型標記LEU2可以分別作為大腸桿菌和酵母系統(tǒng)中的篩選標記。
[0017]所述的環(huán)境雌激素是雌二醇,優(yōu)選17-0雌二醇。
[0018]上述的檢測環(huán)境雌激素的重組酵母的構(gòu)建方法,包括以下步驟:
[0019](I)將唐魚雌激素受體基因TERa序列連接到載體上,構(gòu)建表達質(zhì)粒;
[0020](2)將唐魚卵黃蛋白原基因啟動子2 (promoter2)序列連接到載體pMP206上,構(gòu)建報告質(zhì)粒pMP206/pr2 ;
[0021](3)將上述的表達質(zhì)粒和報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母細胞,得到檢測環(huán)境雌激素的重組酵母。
[0022]上述的重組酵母可用于檢測環(huán)境雌激素,包括以下步驟:
[0023]將上述的重組酵母置于添加有CuSO4的液體SD培養(yǎng)基中,加入待測樣品,30°C下振蕩培養(yǎng)18h,測定3 -半乳糖苷酶活性,根據(jù)3 -半乳糖苷酶活性的變化計算待測樣品中雌激素的含量;
[0024]所述的液體SD培養(yǎng)基不含亮氨酸(Leu)和尿嘧啶(Ura),其中CuSO4的質(zhì)量體積濃度是0.1%。
[0025]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有`如下的優(yōu)點及效果:
[0026]目前已建立的檢測雌激素的重組酵母測評系統(tǒng)主要是用人雌激素受體基因片段構(gòu)建表達質(zhì)粒,用雌激素效應(yīng)元件序列片段連接報告基因構(gòu)建報告質(zhì)粒。而環(huán)境雌激素易在水體環(huán)境中匯集,對水生生物危害嚴重,不斷有關(guān)于雄魚雌性化的相關(guān)報道。唐魚是我國土著淡水魚,易飼養(yǎng),且對生存環(huán)境的變化反應(yīng)靈敏,是用生物方法監(jiān)測環(huán)境雌激素污染的一個極好的魚類生物標記物。而卵黃蛋白原又是一個很好的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的生物標志物,利用魚類卵黃蛋白原作為環(huán)境雌激素的生物標記物的研究對于環(huán)境資源和生物資源的保護具有重要意義。本發(fā)明用唐魚雌激素受體基因片段構(gòu)建表達質(zhì)粒,構(gòu)建受唐魚卵黃蛋白原啟動子調(diào)控的酵母報質(zhì)粒。用唐魚的雌激素受體和唐魚卵黃蛋白原啟動子構(gòu)建重組酵母測評系統(tǒng),其在靈敏度上會有很大提高。同時可與唐魚的在體卵黃蛋白原實驗、胚胎致畸實驗和種群生態(tài)實驗相互印證,可構(gòu)建一套以唐魚為實驗動物的完整的檢測及評價環(huán)境雌激素效應(yīng)物質(zhì)的技術(shù)體系。同時,本發(fā)明以重組酵母檢測雌激素的方法,靈敏度高、重復性好,可應(yīng)用于環(huán)境、食品中雌激素的檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1是17-0雌二醇誘導重組酵母的劑量-效應(yīng)曲線。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述,但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0029]唐魚雌激素受體基因TERa和唐魚卵黃蛋白原基因啟動子2 (promoted)都已被克隆,其序列分別如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.4所示。
[0030]實施例1
[0031]一種檢測環(huán)境雌激素的重組酵母的構(gòu)建方法,包括以下步驟:
[0032]( I)表達質(zhì)粒的構(gòu)建:
[0033]以唐魚雌激素受體基因TER a的cDNA序列(SEQ ID N0.1)為模板,設(shè)計合成特異性引物:
[0034]h游引物為 5’ -AGAATTCATGGTGATGTCTGGAGGGCA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0035]下游引物為5’ -ACTCGAGTTAGGTATCTGGACTTTGGCTAA-3’ (SEQ ID N0.3)
[0036]引物兩端分別設(shè)計EcoRI和XhoI酶切位點(下劃線所示),PCR擴增得到TER a基因完整的ORF片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化并回收后,與克隆載體pMD18-T連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒,命名為pMP18_T/TERa。pMP18_T/TERa經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切,膠回收目的片段TERa并與酵母附加型表達載體PGADI7連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒,命名為pGADI7/TERa。
[0037](2)報告質(zhì)粒pMP206/pr2的構(gòu)建:
[0038]以唐魚卵黃蛋白原基因啟動子2 (promoter2)序列(SEQ ID N0.4)為模板,設(shè)計2對引物:
[0039]外圍引物:
[0040]上游引物5,-C`AAGTAAAGACAATGAGATAGGGAC-3,(SEQ ID N0.5)
[0041]下游引物5’ -TTGATTGTATGGATGATGGATGCAC-3’ (SEQ ID N0.6)
[0042]內(nèi)周引物:
[0043]上游引物5’ -AAAGCTTGTAAAGACAATGAGATAGGGACAGGACC-3,(SEQ ID N0.7)
[0044]下游引物5’ -ACTGCAGTAGACCAGGGAAACATGAACGTGCCAAA-3’ (SEQ ID N0.8)
[0045]PCR擴增含有ERE序列的promoter2片段。將PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18_T連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒,命名為pMD18-T/pr2。pMD18_T/pr2經(jīng)Hind III和Pst I雙酶切,膠回收目的片段并與酵母附加型表達載體PMP206連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒,命名為pMP206/pr2。
[0046](3 )將表達質(zhì)粒pGADI7/TER a轉(zhuǎn)染酵母菌株AH109:
[0047]表達質(zhì)粒pGADI7/TERa用醋酸鋰(LiAC)方法轉(zhuǎn)染入AH109酵母細胞,用D/_Leu選擇培養(yǎng)基篩選出陽性克隆。經(jīng)常規(guī)篩選和鑒定確定質(zhì)粒pGADI7/TERa已成功轉(zhuǎn)染至酵母菌中,將此酵母菌株命名為AHpTERa。
[0048](4 )將pMP206/pr2報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染重組酵母AHpTER a:
[0049]將pMP206/pr2質(zhì)粒用醋酸鋰(LiAC)方法轉(zhuǎn)入AHpTER a重組酵母細胞,用SD/-Leu/-Ura選擇培養(yǎng)基篩選出陽性克隆,經(jīng)常規(guī)篩選和鑒定確定,確認重組酵母構(gòu)建成功,并命名為AHptER a /pr2。
[0050]實施例2
[0051]以實施例1得到的重組酵母AHptERa/pr2測定樣品中環(huán)境雌激素(17-3雌二醇,簡稱E2)的含量,包括以下步驟:
[0052](I)重組酵母菌株的誘導培養(yǎng)
[0053]挑取重組酵母AHptER a /pr2的單克隆到添加有CuSO4的液體SD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),至OD6tltl讀數(shù)為0.1-0.4時,加入系列待測樣品(含有不同濃度17-0雌二醇的DMSO溶液),30°C的恒溫振蕩器里振蕩培養(yǎng)18h,測定并記錄培養(yǎng)液的0D600值;所述的液體SD培養(yǎng)基不含亮氨酸(Leu)和尿嘧啶(Ura),其中CuSO4的質(zhì)量體積濃度是0.1%。
[0054]分別取ImL系列待測樣品的培養(yǎng)液置于1.5mL離心管中,14000rpm離心,去上清,加入ImL Z緩沖液,再離心并棄上清。加入IOOul Z緩沖液重懸沉淀。即為已誘導完畢的重組酵母AHptER a /pr2。
[0055](2)酶活測定及繪圖
[0056]分別在每個裝有已誘導完畢的重組酵母AHptERa/pr2的離心管中加入IOOuL
IXuniversal lysis buffer ULB裂解液進行細胞裂解,振蕩裂解5_10min,離心lmin,取上
清作顯色反應(yīng)。
[0057]96孔板各孔中依次加入待測上清液,每孔加入IOOul ONPG底物溶液,將孔板置于微孔板振蕩器上在室溫下進一步恒溫培養(yǎng),立即開始計時,當溶液都變黃時(即OD405=0.3-0.7時),取出96孔培養(yǎng)板,在酶標儀上測定405nm波長下的吸光度,計算酶活力繪圖,如圖1示。空白是以非轉(zhuǎn)染細胞(即AH109酵母細胞)進行本實施例步驟(1)- (2)的操作后測定的。
[0058]根據(jù)吸光值和酵母菌濃度計算P -半乳糖苷酶的酶活,計算公式為:
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測環(huán)境雌激素的重組酵母,其特征在于含有酵母表達質(zhì)粒和酵母報告質(zhì)粒; 所述的酵母表達質(zhì)粒包含序列如SEQ ID N0.1所示的唐魚雌激素受體基因TERa ; 所述的酵母報告質(zhì)粒,其載體是PMP206,載體上連接序列如SEQ ID N0.4所示的唐魚卵黃蛋白原基因啟動子2; 所述的酵母是酵母菌株AH109。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測環(huán)境雌激素的重組酵母,其特征在于:所述的酵母表達質(zhì)粒,其載體為PGADT7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測環(huán)境雌激素的重組酵母,其特征在于:所述的環(huán)境雌激素是雌二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測環(huán)境雌激素的重組酵母,其特征在于:所述的環(huán)境雌激素是17-0雌二醇。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的檢測環(huán)境雌激素的重組酵母的構(gòu)建方法,其特征在于包括以下步驟: (1)將唐魚雌激素受體基因TERa序列連接到載體上,構(gòu)建表達質(zhì)粒; (2)將唐魚卵黃蛋白原基因啟動子2序列連接到載體pMP206上,構(gòu)建報告質(zhì)粒pMP206/pr2 ; (3)將上述的表達質(zhì)粒和報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母細胞,得到檢測環(huán)境雌激素的重組酵母。
6.權(quán)利要求1-4任一項所述的重組酵母在檢測環(huán)境雌激素中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組酵母在檢測環(huán)境雌激素中的應(yīng)用,其特征在于包括以下步驟: 將權(quán)利要求1-4任一項所述的重組酵母置于添加有CuSO4的液體SD培養(yǎng)基中,加入待測樣品,30°C下振蕩培養(yǎng)18h,測定(6-半乳糖苷酶活性,根據(jù)(6-半乳糖苷酶活性的變化計算待測樣品中雌激素的含量; 所述的液體SD培養(yǎng)基不含亮氨酸和尿嘧啶,其中CuSO4的質(zhì)量體積濃度是0.1%。
【文檔編號】C12N1/19GK103555601SQ201310574108
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】馬廣智, 陳美玲, 武佳韻, 凌源智, 劉琳, 黃儒強, 陳世文, 吳萍萍, 尹艷艷, 章凌霄, 黃中豪, 曾健輝, 孔繁茂, 朱寶君 申請人:華南師范大學