一種磷酸轉(zhuǎn)移酶基因PhoC(I)及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種磷酸轉(zhuǎn)移酶基因PhoC(I)及其制備方法與應(yīng)用。磷酸轉(zhuǎn)移酶基因PhoC(I)，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。以具有磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的菌為篩選庫，設(shè)計引物，然后采用限制性內(nèi)切酶EcoRI隨機切基因組以篩選獲得具有磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的磷酸轉(zhuǎn)移酶基因PhoC(I)。本發(fā)明的磷酸轉(zhuǎn)移酶基因PhoC(I)較PCR擴增到的磷酸轉(zhuǎn)移酶基因序列(PhoC?II)多了一段基因序列。利用該基因PhoC(I)制備的重組菌的酶活比采用PCR擴增所得基因PhoC(II)的重組菌酶活大大提升。所得重組菌以整細胞高效催化肌苷、鳥苷合成呈味核苷酸二鈉（I+G）。不僅底物轉(zhuǎn)化率高、專一性強，后續(xù)提取工藝也簡單方便，可以用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種磷酸轉(zhuǎn)移酶基因PhoC(I)及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的篩選、克隆表達及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]
【權(quán)利要求】
1.磷酸轉(zhuǎn)移酶基因PhoC(I)，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的磷酸轉(zhuǎn)移酶基因PhoC(I)的制備方法，其特征在于包括如下步驟:以具有磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的菌為篩選庫，設(shè)計引物:
PhoC-upper:5’-CTGCGAATTCTTTGCGCTGGTTCCCGCCGGCAATGA-3’
phoC-lower:5’ -GGGM￡￡IICTAATTTCGCTGTTTCGCAAACTCGTC-3’ ； 然后采用限制性內(nèi)切酶EcoRI隨機切基因組以篩選獲得具有磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的磷酸轉(zhuǎn)移酶基因PhoC(I)。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述具有磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的菌為產(chǎn)氣腸桿菌、蟑螂埃希氏菌或摩氏摩根菌。
4.含有權(quán)利要求1所述磷酸轉(zhuǎn)移酶基因PhoC(I)的磷酸轉(zhuǎn)移酶重組菌，其特征在于由如下步驟制備而成:將磷酸轉(zhuǎn)移酶基因PhoC(I)分別以pUC19，pBluscript II SK(+)或PET28為表達載體，在BL21 (DE3)、ToplO或JM109宿主中進行表達。
5.權(quán)利要求4所述磷酸轉(zhuǎn)移酶重組菌的表達方法，其特征在于:發(fā)酵的培養(yǎng)基每1000mL 包含以下成分:NaC125g，NaH2PO4.2H208g, MgSO4.7H205g, (NH4)2S048g,酵母抽提物15g，蛋白胨20g，葡萄糖35g ;發(fā)酵至OD為3-10時，需要添加0.2-0.5mM的誘導(dǎo)劑IPTG或質(zhì)量濃度為0.2-0.5%的乳糖，誘導(dǎo)開始后葡萄糖的濃度控制在0.5-1.8% ;發(fā)酵溫度在20-37°C，誘導(dǎo)溫度在15-34°C之間。
6.利用權(quán)利要求4所述磷酸轉(zhuǎn)移酶重組菌催化肌苷、鳥苷合成肌苷酸和鳥苷酸的方法，其特征在于，溫度為20-35°C，pH值為3.5-6.0。
【文檔編號】C12N15/10GK103642823SQ201310574198
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】蔡友華, 嚴杰能, 鄭彩珠, 李紅, 徐珍珍 申請人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司