一種以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素高效價菌株及培養(yǎng)基的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素高效價菌株及培養(yǎng)基的方法，該篩選方法是在以植物油為主要碳源的分離平板培養(yǎng)基中加入羅丹明B，然后涂布弗氏鏈霉菌孢子懸浮液進行平板培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后挑選菌落水解圈直徑與菌落直徑比大的單菌落，將該單菌落一部分接斜面，另一部分接搖瓶培養(yǎng)基考察效價。本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加羅丹明B（RhodamineB），使水解圈呈現(xiàn)出粉紅色，根據(jù)菌落水解圈的直徑與菌落直徑比值，挑選符合要求的優(yōu)良菌株，減少了工作量，提高了篩選效率，增加選中高產(chǎn)菌株的幾率。同理，本發(fā)明利用弗氏鏈霉菌在不同氮源條件下的脂肪酶活為指標可選擇出適合于其生長的培養(yǎng)基配方，從而提高發(fā)酵效價。
【專利說明】一種以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素高效價菌株及培養(yǎng)基的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵【技術領域】，特別是涉及一種以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素高效價菌株及培養(yǎng)基的方法。
【背景技術】
[0002]泰樂菌素(Tylosin)是一種禽畜專用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是Mocuire于1955年在弗氏鏈霉菌kStreptomyces fradiae)的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的。泰樂菌素對革蘭氏陽性菌及某些陰性菌(如金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎雙球菌、化膿棒狀桿菌等)有效，對螺旋體與支原體有特效。它不僅對雞的敗血癥、豬的流行性肺炎和赤病及小牛支原體引起的肺炎有獨特的療效，而且對畜、禽的生長還有明顯的促進作用，所以被廣泛的應用于畜禽生產(chǎn)及獸醫(yī)治療，從而導致國際國內(nèi)市場需求量極大。
[0003]現(xiàn)有技術中，弗氏鏈霉菌的菌種選育過程為:將孢子懸浮液涂布在分離平板上進行培養(yǎng)，之后根據(jù)經(jīng)驗以菌落的大小，形態(tài)，顏色為單純的指標選育優(yōu)良菌株，然后再經(jīng)過斜面和搖瓶考察最終確定優(yōu)良菌株。這種篩選方式往往導致許多優(yōu)良的菌株在篩選過程中被忽略掉；另外，在篩選過程中由于發(fā)酵周期長給菌種的選育及培養(yǎng)基的優(yōu)化帶來困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就在于克服上述上述現(xiàn)有技術缺陷，提供一種有效增加高產(chǎn)菌株的篩選機率，提高菌種篩選效率，降低工作量的以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素高效價菌株的方法。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供一種以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素培養(yǎng)基的方法。
[0006]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的所采取的技術方案為:
一種以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素高效價菌株的方法，其特征是:在以植物油為主要碳源的分離平板培養(yǎng)基中加入羅丹明B，然后涂布弗氏鏈霉菌孢子懸浮液進行平板培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后挑選菌落水解圈直徑與菌落直徑比大的單菌落，將該單菌落一部分接斜面，另一部分接搖瓶培養(yǎng)基考察效價。
[0007]所述羅丹明B的用量為每1000ml分離平板培養(yǎng)基中加入5~10ml。
[0008]所述分離平板培養(yǎng)基的組成為:玉米淀粉18g，植物油5~10g，硝酸銨lg，磷酸氫二鉀0.5g，七水硫酸鎂0.5g，氯化鈉0.5g，七水硫酸鋅0.01g, Rhodamine B 5~10mL,瓊脂30g，無鹽水加至1000mL，滅菌前pH調(diào)到?.2。
[0009]所述植物油為豆油、菜籽油或玉米油。
[0010]一種以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素培養(yǎng)基的方法，其特征是:在不同氮源的條件下測定泰樂菌素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌代謝植物油時的脂肪酶活力的變化，并以第一天的脂肪酶活力為指標，篩選出高脂肪酶活力的培養(yǎng)基。[0011]所述不同氮源條件下的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:有機氮源10g，玉米淀粉20g，植物油30g,甜菜堿1.5g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎳0.0044g,硫酸鎂0.lg,氯化鈉1.lg,氯化鉀1.lg，輕質(zhì)碳酸鈣2.2g，無鹽水加至lOOOmL，pH7.2 ；
所述有機氮源為棉籽餅粉、魚粉、玉米蛋白粉、玉米漿、酵母粉、菜籽餅粉和蠶蛹粉中的一種或幾種。
[0012]在泰樂菌素的生物合成過程中，所用的碳源為植物油，其主要的作用是為泰樂內(nèi)酯的合成提供前體物質(zhì)，即弗氏鏈霉菌經(jīng)過誘導產(chǎn)生脂肪酶，水解植物油為脂肪酸和甘油，然后被菌體通過β_氧化途徑利用。在植物油被水解成脂肪酸和甘油后，使局部區(qū)域內(nèi)的pH呈微酸性。
[0013]基于此，本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加羅丹明B(Rhodamine B),使水解圈呈現(xiàn)出粉紅色，根據(jù)菌落水解圈的直徑與菌落直徑比值，挑選符合要求的優(yōu)良菌株，這樣大大減少了工作量，提高了篩選效率，增加選中高產(chǎn)菌株的幾率，避免了高產(chǎn)菌株被丟掉的可能。同時，本發(fā)明利用一個菌落同時接斜面和搖瓶種子，比傳統(tǒng)的由菌落到斜面再到搖瓶的篩選方法提前兩周出結果，提高了工作效率。
[0014]同樣的，本發(fā)明利用弗氏鏈霉菌在不同氮源條件下的脂肪酶活為指標可選擇出適合于其生長的培養(yǎng)基配方，從而提高發(fā)酵效價。
【具體實施方式】[0015]下面用實例予以說明本發(fā)明，應該理解的是，實例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權利要求書加以確定。
[0016]實施例1:菌種篩選
1、弗氏鏈霉菌孢子懸浮液的獲得為:將培養(yǎng)好的弗氏鏈霉菌菌株新鮮斜面上加入9mL無菌水，用接種環(huán)刮去培養(yǎng)物表明的孢子，首先輕輕地，然后逐漸用力刮，以使孢子懸浮。將此粗制的孢子懸液倒入離心管中，并在振蕩器上盡可能地激烈振蕩lmin左右，用裝有脫脂棉的試管過濾懸液，將濾液倒入離心管中，3000r/min離心lOmin以使孢子沉淀，停止離心后，馬上倒掉上清液，將離心管在振蕩器上振蕩幾秒鐘，使孢子沉淀物分散于殘存的一點無菌水中，再用無菌水洗滌兩次，放入裝有玻璃珠的三角瓶振蕩10-15min打碎孢子團塊，以脫脂棉過濾，采用血球計數(shù)板進行孢子計數(shù)，調(diào)整孢子濃度到約10_4個/ml，備用。
[0017]2、將制備好的孢子懸液稀釋至10_4，每個培養(yǎng)皿各吸取200ul稀釋好的孢子懸液涂布到分離平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7~10天，根據(jù)菌落水解圈的直徑與菌落直徑比值，選擇比值相對較大的單菌落。
[0018]所用的分離平板培養(yǎng)基組成為玉米淀粉18g，植物油5~10g，硝酸銨lg，磷酸氫二鉀0.5g，七水硫酸鎂0.5g，氯化鈉0.5g，七水硫酸鋅0.01g,羅丹明B 5-lOmL瓊脂30g,無鹽水加至lOOOmL，滅菌前pH調(diào)到7.2。上述植物油為豆油、菜籽油或玉米油。
[0019]表1分離平板培養(yǎng)篩選結果比較
菌株|菌落直徑與水解圈的比值|菌落形態(tài)|效價(U/mL)
對照(不加羅丹寧)it照培養(yǎng)后，不會出現(xiàn)水解圈。只有菌落直徑(大約2-4mm)—饅頭形,孢子生長豐滿1^250
1.1.6￥頭形,孢子生長豐滿，邊緣不整齊 13665
2' 1.4革帽形,孢子豐滿,邊緣鋸齒狀13000
3.1.7軍帽形,孢子豐滿，邊緣不整齊14200
4|l.9丨草帽形，孢子豐滿，邊緣整齊|l6400 -3、將選擇出來的單菌落一部分接斜面，另一部分接搖瓶考察效價。
[0020]實施例2:培養(yǎng)基篩選
取3-6 cm2新鮮斜面的弗氏鏈霉菌菌種接入種子培養(yǎng)基(種子瓶培養(yǎng)基:豆餅粉4 g/L；酵母膏4 g/L;玉米漿5 g/L;碳酸鈣3 g/L。120°C滅菌30 min)中，于溫度27~29 °C、濕度30~50%、搖床轉(zhuǎn)速230 r/min的條件下培養(yǎng)44~50 h。
[0021]將培養(yǎng)的種子液以5%的接種量接種到以不同氮源為基礎的搖瓶培養(yǎng)基中，搖床220r/min，29°C，發(fā)酵144_160h。發(fā)酵培養(yǎng)后每24h測定脂肪酶活力，測定方法參照我們工業(yè)部批準頒發(fā)的行業(yè)標準《工業(yè)酶制劑通用試驗方法》中關于脂肪酶的測定方法，并以第一天的酶活力為指標篩選新配方，結合放瓶后搖瓶效價對其驗證。
[0022]搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:有機氮源10g，玉米淀粉20g，植物油30g，甜菜堿1.5g，磷酸氫二鉀0.5g,硫酸鎳0.0044g,硫酸鎂0.lg,氯化鈉1.lg,氯化鉀1.lg,輕質(zhì)碳酸韓2.2g,無鹽水加至lOOOmL pH7.2。所述有機氮源為棉籽餅粉、魚粉、黃豆餅粉、玉米蛋白粉、玉米漿、酵母粉、菜籽餅粉和蠶蛹粉中的一種或幾種。
[0023]表2以脂肪酶為指標篩選泰樂菌素發(fā)酵培養(yǎng)基的結果
【權利要求】
1.一種以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素高效價菌株的方法，其特征是:在以植物油為主要碳源的分離平板培養(yǎng)基中加入羅丹明B，然后涂布弗氏鏈霉菌孢子懸浮液進行平板培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后挑選菌落水解圈直徑與菌落直徑比大的單菌落，將該單菌落一部分接斜面，另一部分接搖瓶培養(yǎng)基考察效價。
2.按照權利要求1所述的以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素高效價菌株的方法，其特征是:所述羅丹明B的用量為每1000ml分離平板培養(yǎng)基中加入5~10ml。
3.按照權利要求1所述的以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素高效價菌株的方法，其特征在于所述分離平板培養(yǎng)基的組成為:玉米淀粉18g，植物油5~10g，硝酸銨lg，磷酸氫二鉀0.5g，七水硫酸鎂0.5g，氯化鈉0.5g，七水硫酸鋅0.01g, Rhodamine B 5~10mL,瓊脂30g，無鹽水加至1000mL，滅菌前pH調(diào)到?.2。
4.按照權利要求1或3所述的以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素高效價菌株的方法，其特征是:所述植物油為豆油、菜籽油或玉米油。
5.一種以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素培養(yǎng)基的方法，其特征是:在不同氮源的條件下測定泰樂菌素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌代謝植物油時的脂肪酶活力的變化，并以第一天的脂肪酶活力為指標，篩選出高脂肪酶活力的培養(yǎng)基。
6.按照權利要求5所述的以脂肪酶活為指標快速篩選泰樂菌素培養(yǎng)基的方法，其特征在于所述不同氮源條件下的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:有機氮源10g，玉米淀粉20g，植物油30g,甜菜堿1.5g,磷酸氫二鉀0.5g,硫酸鎳0.0044g,硫酸鎂0.lg,氯化鈉1.lg，氯化鉀1.lg，輕質(zhì)碳酸鈣2.2g，無鹽水加至lOOOmL，ρΗ7.2 ；所述有機氮源為棉籽餅粉、魚粉、玉米蛋白粉、玉米漿、酵母粉、菜籽餅粉和蠶蛹粉中的一種或幾種。
【文檔編號】C12Q1/44GK103642897SQ201310575471
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權日:2013年11月18日
【發(fā)明者】王 義, 李康樂 申請人:寧夏泰瑞制藥股份有限公司