一種低溫纖維素酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種纖維素酶突變體，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：3。本發(fā)明的纖維素酶突變體最適作用溫度為50℃，且在40℃條件下，仍能保持70%以上的纖維素酶酶活，而野生型纖維素酶的最適作用溫度為55℃，在40℃條件下，僅能保持40%的纖維素酶酶活，與之相較，纖維素酶突變體更適合在較低溫度下發(fā)揮作用，比野生型具有更高的纖維素酶活力；本發(fā)明的纖維素酶突變體的最適作用pH為5.0，且在pH4.5-6.5范圍內均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纖維素酶僅在pH4.5-5.5范圍內維持80%以上的酶活，與之相較，突變體的pH適應范圍更加寬泛，具有更大的應用空間。
【專利說明】一種低溫纖維素酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種低溫纖維素酶及其應用。
【背景技術】
[0002]纖維素酶，是一種復合酶，是由多種水解酶組成的一個復雜酶系，習慣上將纖維素酶分成三類:內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β_葡萄糖苷酶。纖維素酶是在工業(yè)中應用最廣泛的酶之一，一般應用于紡織工業(yè)、去污劑工業(yè)、紙漿和造紙工業(yè)、飼料和食品工業(yè)(包括烘焙)，以及用于木質纖維素材料水解，用于例如生物乙醇生產等。
[0003]纖維素酶可以按照其一級序列分類成各種糖基水解酶家族，這得到了家族一些成員的三維結構分析的支持(Henrissat 1991,Henrissat和Bairochl993,1996)。例如，糖基水解酶家族5、7、12和45含有內切葡聚糖酶。大多數(shù)紡織用酸性纖維素酶屬于家族5，而大多數(shù)紡織用中性纖維素酶為家族12或45。
[0004]大部分工業(yè)用酶通常在高于50°C的條件下才具有較高的催化效率，但是在紡織領域，為了節(jié)省能源，更為了提高織物色彩的牢固性以及減輕衣物的收縮，急需在低溫度水平(低于50°C)下仍具有良 好性能的酶制劑。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術問題，提供了一種纖維素酶突變體及其重組表達菌株。本發(fā)明的纖維素酶突變體在低溫條件下具有更高的酶活力，可廣泛應用于紡織工業(yè)領域，效果顯著。
[0006]本發(fā)明一方面提供了一種纖維素酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的纖維素酶第48位氨基酸由Leu變?yōu)镻he，第49位氨基酸由Thr變?yōu)長ys，第55位氨基酸由Ala變?yōu)镾er，第66位氨基酸由Ala變?yōu)镻ro，第83位氨基酸由Asp變?yōu)锳sn，第130位氨基酸由Ile變?yōu)閂al，第144位氨基酸由Gln變?yōu)镠is，第147位氨基酸由Leu變?yōu)镠e，第156位氨基酸由Leu變?yōu)镠e。
[0007]上述纖維素酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，其一種編碼基因的核酸序列為 SEQ ID NO:4o
[0008]本發(fā)明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO:4的纖維素酶突變體基因的質粒。
[0009]將上述質粒轉入里氏木霉中進行重組表達，獲得的纖維素酶突變體在低溫條件下具有更高的酶活。
[0010]本發(fā)明還提供了上述纖維素酶突變體在紡織領域中的應用。
[0011]本發(fā)明的纖維素酶突變體最適作用溫度為50°C，且在40°C條件下，仍能保持70%以上的纖維素酶酶活，而野生型纖維素酶的最適作用溫度為55°C，在40°C條件下，僅能保持40%的纖維素酶酶活，與之相較，纖維素酶突變體更適合在較低溫度下發(fā)揮作用，比野生型具有更高的纖維素酶活力；本發(fā)明的纖維素酶突變體的最適作用PH為5.0，且在pH4.5-6.5范圍內均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纖維素酶僅在pH4.5-5.5范圍內維持80%以上的酶活，與之相較，突變體的pH適應范圍更加寬泛，具有更大的應用空間。本發(fā)明的纖維素酶突變體可廣泛應用于紡織加工領域，在PH4.0-8.5范圍內應用，無需調酸可直接使用，且效果良好；除毛干凈，對織物強力損失??；牛仔水洗，起花小，花點較小的批差穩(wěn)定；耐鹽性好，直接使用可用于中和除氧后的拋光、染色一浴工藝，能大大節(jié)省工時，減少生產成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:里氏木霉發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指38kD處為重組表達的纖維素酶；
[0013]圖2:纖維素酶突變體與野生型相對酶活-溫度曲線圖；
[0014]圖3:纖維素酶突變體與野生型相對酶活-pH曲線圖。
【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規(guī)技術和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。
[0016]下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細描述。
[0017]實施例1:纖維素酶基因的 克隆
[0018]1.1纖維素酶突變體的合成
[0019]為了提高纖維素酶(野生型氨基酸序列為SEQ ID NO:1)在低溫條件下的酶活力，對該酶的氨基酸位點進行了大量的點突變篩選，最終得到了能在低溫條件下仍然保有較高酶活力的低溫纖維素酶(氨基酸序列為SEQ ID N0:3)。這些氨基酸突變點分別是L48F，T49K，A55S，A66P，D83N，I130V，Q144H，L147I，L156I。突變后的序列依照里氏木霉的密碼偏愛性而優(yōu)化合成，并且在合成序列5’和3’兩端分別加上KpnI和XbaI兩個酶切位點。上述基因合成工作由上海生工生物工程股份有限公司完成，合成后的基因序列為SEQ ID N0:4。
[0020]同時通過基因合成的方法得到野生型纖維素酶的基因片段SEQ ID N0:2。
[0021]1.2基因克隆
[0022]合成后的質粒用限制性內切酶XbaI和KpnI (Fermentas)進行酶切；同時，用限制性內切酶XbaI和KpnI對質粒pTG進行酶切；使用凝膠純化試劑盒將酶切產物純化，并用T4DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個酶切產物連接；將連接產物轉化進Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節(jié)青霉素進行選擇。為確保準確,對若干克隆進行測序(Invitrogen)。測序結果顯示，突變體纖維素酶的基因序列為SEQ ID NO: 4，其編碼的氨基酸序列為SEQ IDNO: 3，多個克隆測序結果都一致。
[0023]使用質粒中量制備試劑盒(Axygen)從測序結果正確的大腸桿菌克隆中純化質粒。
[0024]實施例2 =PEG介導的原生質體融合轉化木霉及驗證[0025]分別吸取里氏木霉(Trichoderma reesei )菌株孢子懸浮液于PDA平板中心(9cm培養(yǎng)皿)，待菌落長滿整個培養(yǎng)皿，各切IcmX Icm大小的培養(yǎng)基于120mLYEG+U液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm的條件培養(yǎng)14~16h。
[0026]用無菌Miracloth濾布收集菌絲體,并用溶液A清洗一次,在無菌條件下將清洗過的菌絲體轉移到40mL原生質體化溶液，在30°C、90rpm的條件下培養(yǎng)I~2h，用顯微鏡觀察檢測原生質體轉化進展。
[0027]用無菌Miracloth濾布過濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質體溶液。將原生質體溶液分裝于兩個50mL無菌的一次性離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45mL,在3000rpm條件下離心IOmin以獲得沉淀并棄去上清液。用5mL溶液B再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸浮于IOmL溶液B中，并用血球計數(shù)板對原生質體計數(shù)。將原生質體再次離心并棄去上清液，根據血球計數(shù)板計數(shù)結果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質體數(shù)目在I X IO8個/mL左右。
[0028]在冰上，將200 μ L上述原生質體溶液加入預冷的無菌7mL離心管中，每個轉化反應用I管，加入10 μ g重組質粒,加入50 μ L溶液C,溫和混勻后再冰上放置20min。
[0029]將轉化上層培養(yǎng)基熔化并保持在55°C ;從冰中移出上述7mL離心管，并向管中加入2mL溶液C和4mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質體混合物；向3個頂層瓊脂試管中的每一個中加入ImL上述原生質體混合物，并立即傾倒與轉化下層平板上，并將平板在30°C下培養(yǎng)5~7d至有轉化子長出。
[0030]挑取轉化子過夜培養(yǎng),取適量菌體置于離心管中，13000rpm離心5min,棄上清；加Λ 400 μ I 抽提緩沖液(IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA, 250mM NaCl, 1%SDS);然后加 IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65°C水浴20min后，加入200 μ IlOM NH4AC,冰浴IOmin ;13000rpm離心IOmin,取上清；加入2倍體積的無水乙醇，-20°C放置30min ；13000rpm離心lOmin，棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存。
[0031]以上述提取轉化子基因組DNA為模板，利用上下游引物進行PCR擴增目的基因進行驗證。
[0032]上游引物序列為:GGGGTACCATGGCTCTCT CCAAGCT ；
[0033]下游引物序列為:GCTCTAGATTACAAGCAC TGCGAATAC ；
[0034]PCR 擴增條件為 950C 4min ；94°C 40S ；58°C 40S，72°C lmin30 個循環(huán)；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物并進行測序分析，驗證結果顯示擴增產物的序列為SEQ ID N0:4。說明本發(fā)明構建得到了含纖維素酶突變體基因的里氏木霉工程菌，將其命名為里氏木霉 FN3-2 (Trichoderma reesei FN3-2)。
[0035]采用上述同樣的方法將野生型纖維素酶基因片段SEQ ID N0:2轉化到里氏木霉中，構建得到重組表達野生型纖維素酶的里氏木霉工程菌，將其命名為里氏木霉Ul-23 (Trichoderma reesei U1-23)。
[0036]溶液A:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLIM KH2PO4,48.156g MgSO4，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0037]溶液B:5mLlM Tris (ρΗ7.5)，2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0038]溶液C:250g PEG4000,2.77g CaCl2, 5mLlM Tris (ρΗ7.5)，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0039]原生質體化溶液:將0.4mg 裂解酶(Lysing Enzyme from Trichodermaharzianum, Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0040]轉化下層平板:0.l%MgS04, 1%KH2P04, 0.6%(NH4) 2S04, 1% 葡萄糖，0.35% 瓊脂粉。[0041 ]轉化上層培養(yǎng)基:0.l%MgS04, 1%KH2P04, 0.6% (NH4) 2S04, 1% 葡萄糖，18.3% 山梨
醇，0.35%瓊脂糖。
[0042]微量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0043]PDA平板:20g葡萄糖,200g 土豆蒸煮液，15g瓊脂,加入dlH20至終體積1000mL,高
壓蒸氣滅菌。
[0044]YEG+U液體培養(yǎng)基:20g葡萄糖，5g酵母提取物，Ig尿苷，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0045]實施例3發(fā)酵驗證
[0046]將上述構建得到的里氏木霉工程菌FN3-2 (Trichoderma reesei FN3-2)與里氏木霉工程菌Ul-23 (Trichoderma reesei U1-23)分別接種于MM發(fā)酵培養(yǎng)基(1.5%葡萄糖，1.7% 乳糖，2.5% 玉米漿，0.44%(NH4) 2S04,0.09%MgS04, 2%KH2P04,0.04%CaCl2，0.018% 吐溫-80，0.018%微量元素·)培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)48小時，然后25°C培養(yǎng)48小時，分別取上清液進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖1所示，其中箭頭所指處即為重組表達的纖維素酶，說明本發(fā)明構建的里氏木霉工程菌FN3-2能重組表達纖維素酶突變體，里氏木霉工程菌U1-23能重組表達野生型纖維素酶。
[0047]實施例4:酶活測定
[0048]4.1酶活測定方法
[0049]在50°C、pH值為4.8 (中性為pH6.0)的條件下,每分鐘從濃度為5mg/ml的輕甲基纖維素鈉溶液中降解釋放Iymol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位U，還原糖以葡萄
糖等量。
[0050]取三支試管各加入0.5mL CMC底物，與待測酶液一起50°C水浴預熱5min。在第一、二試管中各加入0.5mL待測液，并計時，50°C水浴中反應15min。反應完后在三支試管中各加入1.5mLDNS試劑，并在第三支試管總補加0.5mL的待測酶液。取出并搖勻三支試管后，在沸水浴中反應5min。迅速冷卻至室溫,用水定到5.0mL。以第三支試管試液為對照在540nm波長條件下測第一、二試管試液的吸光度，吸光度在0.25-0.35之間為宜。待測酶液反應液的吸光度與水平控制酶液反應液吸光度之差的絕對值不超過0.015。
[0051 ] 酶活X =(葡萄糖等量值/180/15/0.5) Xn
[0052]其中:X——酶活力單位，IU/g(mL);
[0053]180—葡萄糖從微克換算成微摩爾；
[0054]15——待測液與底物的反應時間；
[0055]0.5-加入反應的待測酶液量；
[0056]η——稀釋倍數(shù)；
[0057]4.2、酶活測定[0058]按照上述方法測定里氏木霉FN3-2發(fā)酵上清液的酶活為130U/mL，而里氏木霉U1-23發(fā)酵上清液的酶活僅為80U/mL，說明纖維素酶突變體在里氏木霉中的表達效率比野生型聞。
[0059]實施例5纖維素酶酶學性質分析
[0060]5.1最適作用溫度
[0061]分別在20。。、30。。、35。。、40。。、45。。、50。。、55。。、60。。、65。。、70。。、80。。，pH6.0 條件下測定上述發(fā)酵上清液的酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做溫度-相對酶活曲線。結果如圖2所示，纖維素酶突變體的最適作用溫度為50°C;且在40°C條件下，仍能保持70%以上的纖維素酶酶活；而野生型纖維素酶的最適作用溫度為55°C，在40°C條件下，僅能保持40%的纖維素酶酶活，與之相較，纖維素酶突變體更適合在較低溫度下發(fā)揮作用，比野生型具有更高的纖維素酶活力。
[0062]5.2最適作用pH值
[0063]分別用pH 值為 3.0,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的緩沖液稀釋上述發(fā)酵上清液,在50°C條件下測定其酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做pH-相對酶活曲線。結果如圖3所示，纖維素酶突變體的最適作用pH為5.0，且在pH4.5-6.5范圍內均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纖維素酶僅在pH4.5-5.5范圍內維持80%以上的酶活，與之相較，突變體的PH適應范圍更加寬泛，具有更大的應用空間。
[0064]實施例6低溫纖維素酶在 紡織中的應用
[0065]1、針織面料、梭織面料的除毛染色一浴工藝
[0066]應用溫度為35_55°C ；
[0067]處理時間為30-150分鐘；
[0068]pH 范圍為 4.0-8.5 ;
[0069]上述工藝條件特別適用于染色同浴的情況；適用的浴比范圍為1:5-1:30，使用的設備類型為溢流染色機，卷染機，水洗機等，本發(fā)明纖維素酶突變體的用量為400-1000U/L，且纖維素酶突變體的耐鹽范圍為硫酸鈉40-100g/L.[0070]該酶除毛干凈，對織物強力損失小，其滅活條件為添加純堿至pH值到10，或升溫到70°C以上并保持10分鐘。
[0071]2、牛仔面料的起花及除毛應用
[0072]應用溫度為35_55°C ；
[0073]處理時間為10-60分鐘；
[0074]pH 范圍為 4.0-8.5 ;
[0075]上述工藝條件可應用于退漿及單獨石磨洗條件下的除毛、起花工藝；適用的浴比范圍為1:5-1:30，使用的設備類型為工業(yè)水洗機等，纖維素酶突變體的用量為400-1000U/L0
[0076]該酶除毛干凈，起花均勻，花點較小，對織物強力損失小，其滅活條件為添加純堿至pH值到10，或升溫到70°C以上并保持10分鐘。
[0077]上述實驗結果表明，本發(fā)明的低溫纖維素酶突變體可廣泛應用于紡織加工領域，在pH4.0-8.5范圍內應用，無需調酸可直接使用，且效果良好；除毛干凈，對織物強力損失小；牛仔水洗，起花小，花點較小，批差穩(wěn)定；耐鹽性好，直接使用可用于中和除氧后的拋光、染色一浴工藝，能大·大節(jié)省工時，減少生產成本。
【權利要求】
1.一種纖維素酶，其特征在于，所述的纖維素酶是氨基酸序列為SEQ ID N0:1的纖維素酶第48位氨基酸由Leu變?yōu)镻he，第49位氨基酸由Thr變?yōu)長ys，第55位氨基酸由Ala變?yōu)镾er，第66位氨基酸由Ala變?yōu)镻ro，第83位氨基酸由Asp變?yōu)锳sn，第130位氨基酸由Ile變?yōu)閂al，第144位氨基酸由Gln變?yōu)镠is，第147位氨基酸由Leu變?yōu)镠e，第156位氨基酸由Leu變?yōu)镠e。
2.如權利要求1所述的纖維素酶，其氨基酸序列為SEQ ID N0:3。
3.一種基因，所述的基因用于編碼權利要求1所述的纖維素酶。
4.如權利要求3所述的基因，其核酸序列為SEQID N0:4。
5.一種重組質粒，所述的重組質粒攜帶有權利要求3所述的基因。
6.一種重組里氏木霉，所述的重組里氏木霉攜帶有權利要求5所述的重組質粒。
7.權利要求1所述的纖維素酶在紡織加工領域中的應用。
【文檔編號】C12R1/885GK103589701SQ201310578003
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權日:2013年11月18日
【發(fā)明者】黃亦鈞, 許麗紅, 張青, 劉艷萍, 許韡, 王華明 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司, 上海康地恩生物科技有限公司