單精子捕獲線粒體dna分型區(qū)別混合精斑中個體的方法
【專利摘要】單精子捕獲線粒體DNA分型區(qū)別混合精斑中個體的方法，主要解決現(xiàn)有技術(shù)存在的DNA含量不能滿足常規(guī)檢驗混合精斑的要求，不能提供個體的完整遺傳信息的技術(shù)問題。該方法通過單精子捕獲、單精子DNA提取、mtDNA?HV?Ⅰ區(qū)的巢式擴增、二次擴增產(chǎn)物的DNA序列分析及精子富集與常染色體STR檢測等步驟實現(xiàn)。本發(fā)明以具有個人特征性的單精子線粒體DNA為檢測指標，將來源于不同個體的精液混合物按照個體區(qū)分精子，再行核DNA的檢測，可成功地解決目前無法對混合樣品中不同個體來源組分的個人性認定難題。利用單精子中線粒體DNA的含量較多的特點，可以滿足PCR技術(shù)檢測線粒體DNA的要求，收集線粒體DNA同型的多個精子可以實現(xiàn)對核DNA的檢測，以達到個人識別目的。
【專利說明】單精子捕獲線粒體DNA分型區(qū)別混合精斑中個體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種性犯罪中對混合斑進行識別檢驗的方法，確切地說是一種單精子捕獲線粒體DNA分型區(qū)別混合精斑中個體的方法，屬于法醫(yī)學個人識別檢驗應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]在性犯罪案件中，受害人可能同時受到兩個或兩個以上男性的性侵害，因此對混合斑的識別檢驗尤顯重要。混合斑指的是被測樣本來自兩個或兩個以上的個體。在此類案件中獲得的物證檢材均為混合精斑。目前常規(guī)采取的方法是應(yīng)用差異裂解法去除女性成分后進行常染色體STR分型，通過對混合譜型中等位基因峰的峰高與峰面積的計算并結(jié)合各基因座等位基因的頻率推測個體的基因組型，不能確定屬于每個個體的全部等位基因；Y染色體STR的分析結(jié)果可以提高對精液混合檢材的個體識別能力，但由于其具有父性伴性遺傳的特點，同一男系的所有男性具有相同的Y染色體STR型別，其分型結(jié)果可用于排除，也不能實現(xiàn)同一認定每個個體的目的；單細胞捕獲技術(shù)可以獲得單細胞樣本。但單一精子細胞的核DNA屬于單倍體，其DNA含量不能滿足常規(guī)檢驗的要求，也不能提供個體的完整遺傳信息。
[0003]綜上所述，目前所有應(yīng)用于兩人以上的精液混合樣品的檢測方法均不能作到確定每一個個體的 目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明以解決上述問題為目的，主要解決現(xiàn)有技術(shù)存在的DNA含量不能滿足常規(guī)檢驗混合精斑的要求，不能提供個體的完整遺傳信息的技術(shù)問題，而提供一種準確分離混合樣品中不同個體的精子再確定精子個人性的方法。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:單精子捕獲線粒體DNA分型區(qū)別混合精斑中個體的方法，該方法是通過下步驟實現(xiàn)的:
[0006]一、單精子捕獲
[0007]將混合精斑樣品涂片，應(yīng)用LMD7000型徠卡激光顯微切割系統(tǒng)(Leica，德國)分別取單個精子，每個精子分別收集試管中。
[0008]二、單精子DNA提取
[0009]1、每個含有單精子的試管中加入15 μ L 5% Chelex_100、0.2 μ L10mg/ml蛋白酶K(終濃度 100 μ g/ml)、0.7 μ L IM DTT (終濃度 40mM)。
[0010]2、振蕩 10s。
[0011]3、56°C消化 Ih ~2h。
[0012]4、振蕩 10s。
[0013]5、沸水浴中孵育8min。
[0014]6、振蕩 10s。[0015]7、13000rpm 離心 2min。
[0016]8、上清置4°C冰箱內(nèi)備用。
[0017]三、mtDNA HV I區(qū)的巢式擴增
[0018]1、第一次擴增
[0019]引物序列為:
[0020]F 5' -TAC ACA ATC AAA GAC GCC CTC-3'；
[0021]R 5' -GGA TGA GGC AGG AAT CAA AGA C-3/ 。
[0022]擴增體系為5 μ L，含有:10Xbuffer 0.5μ L,2.5mM dNTP Mix 0.5 μ L，IOuMolPrimer 各 0.15 μ L, Template 0.5 μ L,Iu KOD-Plus-Neo 0.3 μ L, ddH20 2.9 μ L。
[0023]循環(huán)條件為94°C 2min ；94°C 20s, 55.5°C 30s,68°C 40s,35cycles ；68°C 5min。
[0024]反應(yīng)在9700擴增儀上進行，擴增目的片段為1305bp。
[0025]2、第二次擴增。
[0026]引物序列為:
[0027]F 5' -ACC TGA ATC GGA GGA CAA C-3/ ；
[0028]R 5' -CAA AGA `CAG ATA CTG CGA CAT-3;)。
[0029]擴增體系為20 μ L，含有:10X buffer 2μ L,2.5mM dNTP Mix 2 μ L, IOuMolPrimer 各 0.6 μ L，第一次擴增產(chǎn)物 0.5 μ L, Iu KOD-Plus-Neol.2 μ L, ddH20 13.1 μ L。
[0030]循環(huán)條件為94°C 2min ；94°C 20s, 55.5°C 30s, 68°C 30s,30cycles ；68°C 5min。
[0031]反應(yīng)在9700擴增儀上進行，擴增目的片段為954bp。
[0032]四、二次擴增產(chǎn)物的DNA序列分析
[0033]測序分析常規(guī)方法進行。
[0034]五、精子富集與常染色體STR檢測
[0035]1、將mtDNA HV I區(qū)序列相同的多管精子DNA提取物收集在同一試管中。
[0036]2、加入于 QIAamp MinElute? Column 中
[0037]3、8000rpm 離心 lmin。
[0038]4、加入 AWl 500 μ L, 8000rpm 離心 lmin。
[0039]5、加入 AW2 500 μ L, 8000rpm 離心 lmin。
[0040]6、13000rpm 離心 3min。
[0041]7、加入7 μ LAE洗脫液，靜置5min。
[0042]8、13000rpm 離心 3min。
[0043]9、離心后獲得的洗脫液應(yīng)用Promega公司的PowerPlex ? 16HS試劑盒擴增15個常染色STR基因座。PCR反應(yīng)在9700擴增儀上進行。PCR擴增體系和循環(huán)條件按操作手冊完成。
[0044]擴增體系為:10μ L (Mix 2 μ L，Primer I μ L，DNA 洗脫液 7 μ L)。
[0045]循環(huán)條件為:96°C2min ；94°C 30s,60°C 30s,70°C 45s, IOcycles ；90°C 30s,60°C 30s,70°C 45s,19cycles ；60°C 30min。
[0046]擴增產(chǎn)物經(jīng)AB-3130型DNA遺傳分析儀電泳分離和激光掃描分析，用3130DataCollection v3.0軟件收集電泳信息，Genemapper ID v3.2軟件分析擴增片段大小,得到STR分型結(jié)果。[0047]本發(fā)明的有益效果及特點
[0048]本發(fā)明的有益效果是，以具有個人特征性的單精子線粒體DNA為檢測指標，將來源于不同個體的精液混合物按照個體區(qū)分精子，再行核DNA的檢測，可成功地解決目前無法對混合樣品中不同個體來源組分的個人性認定難題。特點是，利用單精子中線粒體DNA的含量較多的特點，可以滿足PCR技術(shù)檢測線粒體DNA的要求，收集線粒體DNA同型的多個精子可以實現(xiàn)對核DNA的檢測，以達到個人識別目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1是兩個男性精液混合物常染色體PCR檢測結(jié)果與單精子捕獲后線粒體DNA測序結(jié)果相同的精子常染色體STR分型結(jié)果分型圖譜。圖中橫坐標代表“片段長度”;縱坐標代表“突光信號強度”。
[0050]圖示為兩個男性與一個女性發(fā)生性關(guān)系實際案例的檢測鑒定結(jié)果。A為二人精液混合樣品經(jīng)差異裂解法處理后常染色體十五個STR分析結(jié)果，每個基因座位可檢測到I~4個等位基因峰，無法判斷每個等位基因峰的個體來源；B與C為經(jīng)過單精子捕獲、DNA提取、線粒體DNA序列分析后，線粒體DNA序列相同的精子細胞的常染色體十五個STR分型結(jié)果。證實了混合精液是源于分別具有B與C的STR基因型者的組合，案件偵破結(jié)果證實了兩個男性嫌疑人。
【具體實施方式】
[0051]實施例
[0052]單精子捕獲線粒體DNA分型區(qū)別混合精斑中個體的方法，該方法是通過下步驟實現(xiàn)的:
[0053]一、單精子捕獲
[0054]將混合精斑樣品涂片，應(yīng)用LMD7000型徠卡激光顯微切割系統(tǒng)(Leica，德國)分別取單個精子，每個精子分別收集試管中。
[0055]二、單精子DNA提取
[0056]1、每個含有單精子的試管中加入15 μ L 5%Chelex_100、0.2 μ L10mg/ml蛋白酶K(終濃度100 μ g/ml)、0.7 μ L IM DTT (終濃度 40mM)。
[0057]2、振蕩 10s。
[0058]3、56°C 消化 Ih ~2h。
[0059]4、振蕩 10s。
[0060]5、沸水浴中孵育8min。
[0061]6、振蕩 10s。
[0062]7、13000rpm 離心 2min。
[0063]8、上清置4°C冰箱內(nèi)備用。
[0064]三、mtDNA HV I區(qū)的巢式擴增
[0065]1、第一次擴增
[0066]引物序列為:
[0067]F 5' -TAC ACA ATC AAA GAC GCC CTC-3'；[0068]R 5' -GGA TGA GGC AGG AAT CAA AGA C-3/ 。
[0069]擴增體系為5 μ L，含有:10Xbuffer 0.5μ L,2.5mM dNTP Mix 0.5 μ L, IOuMolPrimer 各 0.15 μ L, Template 0.5 μ L,Iu KOD-Plus-Neo 0.3 μ L, ddH20 2.9 μ L。
[0070]循環(huán)條件為94°C 2min ；94°C 20s, 55.5°C 30s, 68°C 40s,35cycles ；68°C 5min。
[0071]反應(yīng)在9700擴增儀上進行，擴增目的片段為1305bp。
[0072]2、第二次擴增。
[0073]引物序列為:
[0074]F 5' -ACC TGA ATC GGA GGA CAA C-3/ ；
[0075]R 5' -CAA AGA CAG ATA CTG CGA CAT-3;)。
[0076]擴增體系為20 μ L，含有:10X buffer 2μ L,2.5mM dNTP Mix 2 μ L, IOuMolPrimer 各 0.6 μ L，第一次擴增產(chǎn)物 0.5 μ L, Iu KOD-Plus-Neo 1.2 μ L，ddH20 13.1 μ L。
[0077]循環(huán)條件為94°C 2min ；94°C 20s, 55.5°C 30s,68°C 30s,30cycles ；68°C 5min。
[0078]反應(yīng)在9700擴增儀上進行，擴增目的片段為954bp。
[0079]四、二次擴增產(chǎn)物的DNA序列分析
[0080]測序分析常規(guī)方法進行。
[0081]五、精子富集與常染色體STR檢測
[0082]1、將mtDNA HV I區(qū)序列相同的多管精子DNA提取物收集在同一試管中。
[0083]2、加入于 QIAamp MinElute? Column 中
[0084]3、8000rpm 離心 lmin。
[0085]4、加入 AWl 500 μ L, 8000rpm 離心 lmin。
[0086]5、加入 AW2 500 μ L, 8000rpm 離心 lmin。
[0087]6、13000rpm 離心 3min。
[0088]7、加入7 μ LAE洗脫液，靜置5min。
[0089]8、13000rpm 離心 3min。
[0090]9、離心后獲得的洗脫液應(yīng)用Promega公司的PowerPlex ? 16HS試劑盒擴增15個常染色STR基因座。PCR反應(yīng)在9700擴增儀上進行。PCR擴增體系和循環(huán)條件按操作手冊完成。
[0091]擴增體系為:10μ L (Mix 2 μ L，Primer I μ L，DNA 洗脫液 7 μ L)。
[0092]循環(huán)條件為:96°C2min ；94°C 30s,60°C 30s,70°C 45s, IOcycles ；90°C 30s,60°C 30s,70°C 45s,19cycles ；60°C 30min。
[0093]擴增產(chǎn)物經(jīng)AB-3130型DNA遺傳分析儀電泳分離和激光掃描分析，用3130 DataCollection v3.0軟件收集電泳信息，Genemapper ID v3.2軟件分析擴增片段大小,得到STR分型結(jié)果。
[0094]本發(fā)明還可以應(yīng)用于針對其他混合樣品中全部人體有核細胞，如組織細胞、白細胞等個人識別檢驗。
【權(quán)利要求】
1.單精子捕獲線粒體DNA分型區(qū)別混合精斑中個體的方法，該方法是通過下步驟實現(xiàn)的: 一、單精子捕獲 將混合精斑樣品涂片，應(yīng)用LMD7000型徠卡激光顯微切割系統(tǒng)(Leica，德國)分別取單個精子，每個精子分別收集試管中； 二、單精子DNA提取 .1、每個含有單精子的試管中加入15μ L 5% Chelex-100、0.2μ L10mg/ml蛋白酶K (終濃度 100 μ g/ml)、0.7 μ L IM DTT (終濃度 40mM)； .2、振蕩1Os； . 3、56°C消化1h ~2h ; .4、振蕩1Os； . 5、沸水浴中孵育8min； .6、振蕩1Os；
.7、13000rpm 離心 2min ； .8、上清置4°C冰箱內(nèi)備用； 三、mtDNAHV I區(qū)的巢式擴增 .1、第一次擴增 引物序列為:
F 5' -TAC ACA ATC AAA GAC GCC CTC-3' , R 5' -GGA TGA GGC AGG AAT CAA AGAC-3/ ；
擴增體系為 5 μ L，含有:10 X buffer 0.5μ L,2.5mM dNTP Mix 0.5 μ L，IOuMol Primer各 0.15 μ L, Template 0.5 μ L,Iu KOD-Plus-Neo 0.3 μ L, ddH20 2.9 μ L ；
循環(huán)條件為 94°C 2min ；94°C 20s, 55.5°C 30s, 68°C 40s,35cycles ；68°C 5min，反應(yīng)在9700擴增儀上進行，擴增目的片段為1305bp ； .2、第二次擴增 引物序列為:
F 5' -ACC TGA ATC GGA GGA CAA C-3/ ,R 5' -CM AGA CAG ATA CTG CGA CAT-3;)；擴增體系為 20 μ L，含有:10 X buffer 2μ L,2.5mM dNTP Mix 2 μ L, IOuMol Primer 各.0.6 μ L，第一次擴增產(chǎn)物 0.5 μ L，Iu KOD-Plus-Neol.2 μ L, ddH20 13.1 μ L ；
循環(huán)條件為 94°C 2min ；94°C 20s, 55.5°C 30s, 68°C 30s,30cycles ；68°C 5min，反應(yīng)在9700擴增儀上進行，擴增目的片段為954bp ； 四、二次擴增產(chǎn)物的DNA序列分析，測序分析常規(guī)方法進行； 五、精子富集與常染色體STR檢測 .1、將mtDNAHV I區(qū)序列相同的多管精子DNA提取物收集在同一試管中； .2、加入于QIAamp MinElute? Column 中；
.3、8000rpm離心 1min ；
.4、加入AWl 500 μ L, 8000rpm 離心 1min ;
.5、加入AW2 500 μ L, 8000rpm 離心 1min ;
.6、13000rpm 離心 3min ；·7、加入7 μ LAE洗脫液，靜置5min ；
8> 13000rpm 離心 3min ； ·9、離心后獲得的洗脫液應(yīng)用Promega公司的PowerPlex ? 16HS試劑盒擴增15個常染色STR基因座，PCR反應(yīng)在9700擴增儀上進行，PCR擴增體系和循環(huán)條件按操作手冊完成；擴增體系為:10 μ L (Mix 2 μ L，Primer I μ L，DNA 洗脫液 7 μ L);
循環(huán)條件為:96°C 2min ；94°C 30s, 60 °C 30s, 70 °C 45s, IOcycles ；90°C 30s, 60°C30s,70°C 45s,19cycles ；60°C 30min ； 擴增產(chǎn)物經(jīng)AB-3130型DNA遺傳分析儀電泳分離和激光掃描分析，用3130 DataCollection v3.0軟件收集電泳信息，Genemapper ID v3.2軟件分析擴增片段大小,得到STR分型結(jié)果。
【文檔編號】C12Q1/68GK103757095SQ201310578684
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月19日
【發(fā)明者】王保捷, 丁梅, 張璐, 王云柯, 龐灝, 邢佳鑫, 宣金鋒, 王春紅, 林子青, 韓松, 梁克偉, 李春梅, 姚軍 申請人:中國醫(yī)科大學