一個(gè)育性調(diào)控基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一個(gè)育性調(diào)控基因及其應(yīng)用，屬于植物育種領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及純合隱性核雄性不育水稻植株的育性恢復(fù)及其用途。進(jìn)一步本發(fā)明涉及構(gòu)建水稻雄性不育系、保持系的方法、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因材料性狀，更具體地，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建體，一種水稻細(xì)胞、組織或器官，一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法，一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法，一種制備水稻種子的方法，一種轉(zhuǎn)基因材料，一種用于制備雜交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途。
【專利說明】—個(gè)育性調(diào)控基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物育種領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及純合隱性核雄性不育水稻植株的育性恢復(fù)及其用途。進(jìn)一步本發(fā)明涉及構(gòu)建水稻雄性不育系、保持系的方法、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因材料性狀，更具體地，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建體，一種水稻細(xì)胞、組織或器官，一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法，一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法，一種制備水稻種子的方法，一種轉(zhuǎn)基因材料，一種用于制備雜交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻雜交育種中常用的是“三系”和“兩系”雜交?！叭怠彪s交需要有特定的恢復(fù)系和保持系，育種程序和生產(chǎn)環(huán)節(jié)復(fù)雜，選育新不育系及新組合的周期長、效率低，種質(zhì)資源的利用率低于5%。另外，三系雜交稻優(yōu)勢較弱，不育細(xì)胞質(zhì)較單一，存在某種毀滅性病蟲害暴發(fā)的潛在危險(xiǎn)。“兩系”雜交水稻由于不受恢復(fù)系、保持系之間關(guān)系的制約，親本的遺傳多樣性得到明顯改善，選育出高產(chǎn)雜交稻組合的速度明顯加快，促進(jìn)了超級雜交稻的研究和生產(chǎn)。但目前“兩系”雜交中采用的不育系多為“光溫敏”不育系，其育性受環(huán)境中的溫度和光照影響。這些環(huán)境因素的不穩(wěn)定會直接影響雜交種子的純度和產(chǎn)量，加大制種風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重時(shí)會給種業(yè)企業(yè)和農(nóng)民造成重大經(jīng)濟(jì)損失，限制“兩系”雜交稻的大面積推廣。而且利用目前技術(shù)所能培育的兩系雜交稻不育系十分有限，例如粳稻品種中幾乎沒有很好的兩系雜交組合，限制了品種資源的充分利用。因而，培育不受環(huán)境影響且可自主繁殖的穩(wěn)定不育系，已成為解決“兩系”雜交技術(shù)瓶頸的突破點(diǎn)。圍繞如何提高不育系的穩(wěn)定性及打破雜交品種資源利用的局限性，并進(jìn)一步解決現(xiàn)有制種技術(shù)復(fù)雜且成本高等技術(shù)瓶頸問題，一種新的雜交育種技術(shù)得到關(guān)注。該技術(shù)利用隱性核基因控制的雄性不育系和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將育性恢復(fù)基因、花粉失活基因、種子顏色標(biāo)記基因連鎖，同時(shí)轉(zhuǎn)入到純合隱性核雄性不育植株(不育系)中，育性恢復(fù)基因的功能使轉(zhuǎn)基因植株恢復(fù)育性；但到花粉發(fā)育后期，花粉失活基因使含有轉(zhuǎn)基因的花粉失活，從而只有不攜帶轉(zhuǎn)基因的花粉可以保留活性。該轉(zhuǎn)基因植株自交后產(chǎn)生兩類種子:不攜帶外源基因的不育系種子，可用于雜交種子生產(chǎn)；攜帶外源基因的可育種子，用于不育系的保持，即保持系；兩類種子的分離比為1:1，利用顏色標(biāo)記基因使可育的種子顯現(xiàn)出顏色，從而可以方便地使用種子色選儀將可育種子(保持系)與不育種子(不育系一)分開。
[0003] 這種新型的雜交育種技術(shù)具有以下顯著的優(yōu)越性:(1)該技術(shù)創(chuàng)制的不育系育性穩(wěn)定，不受環(huán)境影響，消除了環(huán)境因素對雜交育種的制約和生產(chǎn)上的潛在風(fēng)險(xiǎn)。(2)所利用的隱性核不育基因適用于絕大多數(shù)品種，而且理論上所有水稻品種都可作為雜交的父本，從而使雜種優(yōu)勢的資源利用率大幅提高。(3)終止攜帶外源基因的花粉的受精過程，防止外源基因漂移到其它植物中；(4)所產(chǎn)生的不育系不含外源基因，消除人們對轉(zhuǎn)基因作物的顧慮。(5)自交結(jié)實(shí)提高了不育系自身繁殖效率，利用顏色標(biāo)記基因方便地將不育種子和可育種子分開，保證了不育種子的純度。[0004]在該技術(shù)中，花粉失活基因是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，所選用的失活基因在花粉中表達(dá)的時(shí)間、水平及花粉失活效率都直接關(guān)系到該技術(shù)的成功與否。目前已有的該技術(shù)載體構(gòu)建中，多采用細(xì)菌來源barnase基因或玉米來源的amylase基因等作為花粉失活基因，這些基因?qū)τ谒緛碇v，都是外源的。因此，開發(fā)水稻內(nèi)源的可以被用作花粉失活的功能基因，對于消除公眾生物安全顧慮、打破國外技術(shù)堡壘、獲得更優(yōu)化的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型雜交水稻育種技術(shù)，具有重要意義。
[0005]水稻OsYUCCAI基因編碼一個(gè)類黃素單加氧酶(f lavinmonooxygenase-1 ikeenzyme, FMO)家族成員，是吲哚乙酸(IAA，植物體內(nèi)最主要的生長素類激素)生物合成過程中的關(guān)鍵酶，催化將色胺(tryptamine, TAM)轉(zhuǎn)化成羥基色胺(N-hydroxytryptamine,NHT)，是依賴于色氨酸的IAA合成途徑中的限速酶。該基因在擬南芥中的同源基因被稱為YUCCA1，已經(jīng)分離的擬南芥yuccal顯性突變體表現(xiàn)出頂端優(yōu)勢增強(qiáng)，下胚軸和葉柄伸長、子葉著生偏上及葉片細(xì)長等形態(tài)特征，研究發(fā)現(xiàn)yuccal顯性突變體中YUCCAl基因表達(dá)升高，使得游離狀態(tài)的IAA含量也相應(yīng)升高，直接導(dǎo)致了以上的突變體表型(A role for flavinmonooxygenase-1ike enzymes in auxinbiosynthesis, Zhao etal.，2001，Science291:306-309)。進(jìn)一步，在擬南芥中也證明了 YUCCAl基因依賴的生長素合成途徑，在花器官的發(fā)育過程中起到調(diào)控作用，組成型過表達(dá)YUCCAl基因?qū)е律L素的積累，而單獨(dú)突變yuccal基因并沒有造成可見表型，只有多個(gè)YUCCA同源基因被同時(shí)突變時(shí)，才使植株由于生長素的合成減少，而出現(xiàn)花器官、維管束及其它組織發(fā)育異常的表型(Auxin biosynthesis by the YUCCA flavinmonooxygenases controlsthe formationof floral organs and vascular tissuesin Arabidopsis, Cheng etal.，2006，Genes and Development20:1790-1799)。在水稻中，有報(bào)道表明 OsYUCCAl 基因在植株中并非組成型表達(dá)，而是離散表達(dá)在植株的葉尖、根尖、幼原基、維管束的實(shí)質(zhì)細(xì)胞及花器官等中(Auxin biosynthesis by the YUCCAlgenes in rice, Yamamoto etal.，2007, Plant Physiologyl43:1362-1371)。在本發(fā)明中，發(fā)明人利用花粉特異性啟動子驅(qū)動OsYUCCAl基因在 水稻花粉中特異表達(dá)，驚奇地實(shí)現(xiàn)了致使水稻花粉失活的效果，推測是由于OsYUCCAl基因在花粉中過表達(dá)導(dǎo)致花粉發(fā)育過程中生長素的異常積累造成的。進(jìn)一步利用OsYUCCAl、水稻育性基因(Ms26，)及種子熒光標(biāo)記基因(RFP)構(gòu)建新型育性調(diào)控載體，并轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的水稻雄性不育植株中，得到了相應(yīng)的保持系，對該保持系結(jié)實(shí)的種子進(jìn)行分析，結(jié)果實(shí)現(xiàn)了攜帶外源基因的紅色熒光種子與不攜帶外源基因的非紅色熒光種子的1:1分離，兩類種子可以分別被用作保持系與不育系，進(jìn)行不育系的繁殖和雜交種子的生產(chǎn)。
[0006]根據(jù)以上的結(jié)果，我們認(rèn)為OsYUCCAl作為水稻內(nèi)源基因，特異地在成熟花粉中過量表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)花粉失活的效果，將該基因構(gòu)建到新型育性調(diào)控載體中，可使攜帶外源基因的花粉失活，終止攜帶外源基因的花粉的授精過程，防止外源基因通過花粉漂移到其它植物中，外源基因只通過雌配子體進(jìn)行遺傳，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了水稻保持系和不育系的創(chuàng)制。由于該基因是水稻內(nèi)源控制IAA生物合成途徑的關(guān)鍵酶類，且為水稻內(nèi)源基因，從生物安全角度考慮，將更有利于消除公眾對轉(zhuǎn)基因概念的潛在疑慮。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述水稻雜交育種技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種具有能夠有效構(gòu)建新型穩(wěn)定的水稻雄性不育系和充分利用水稻種質(zhì)資源，用于雜交育種、提高雜交種純度的手段。
[0008]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:發(fā)明人以純合隱性核雄性不育水稻突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，通過將緊密連鎖的3個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至不育受體植株中。其中，育性恢復(fù)基因可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，篩選基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系來源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，可以以水稻核隱性不育ms26 / ms26突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，將緊密連鎖的3個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至不育系:育性恢復(fù)基因0sCYP704B2 (對應(yīng)野生型MS26基因)可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，花粉失活基因OsYUCCAl可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，熒光色選基因用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種 ，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系來源源不斷地穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。由于該技術(shù)利用生物技術(shù)生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，解決了水稻雜交制種過程中面臨的瓶頸問題，即三系法資源利用率低而兩系法中不育系育性不穩(wěn)定的問題。
[0009]由此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提出了一個(gè)基因，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該基因在水稻成熟花粉中特異過表達(dá)時(shí)，可以導(dǎo)致水稻花粉的失活。該設(shè)計(jì)使得所有含有此基因的轉(zhuǎn)基因花粉失活，不能授精還能嚴(yán)格防止基因漂移等生物安全問題，失活的花粉不能與周圍其它植株或雜草授粉，因而轉(zhuǎn)基因不能通過花粉漂移到環(huán)境中。
[0010]由此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu)建體包括:第一表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼水稻雄性不育恢復(fù)基因；以及第二表達(dá)盒，所述第二表達(dá)盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼花粉失活基因。利用該構(gòu)建體，能夠有效地將水稻雄性不育恢復(fù)基因和花粉失活基因引入到純合隱性核雄性不育水稻突變體植株中，從而得到攜帶外源基因的可育株作為保持系，從而可以方便地通過自交源源不斷地生產(chǎn)不育系和保持系，另外，不攜帶外源基因的植株可以用作雜交的母本。由此，可以有效地用于水稻雜交。
[0011]由此，可以通過常規(guī)技術(shù)，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將前述構(gòu)建體引入到水稻的細(xì)胞、組織或器官中，以便得到可以后續(xù)用于研究、雜交的樣本。因而，在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種水稻細(xì)胞、組織或器官。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該水稻細(xì)胞、組織或器官中含有前面所述的構(gòu)建體。
[0012]在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到第一水稻純合隱性雄性不育植株中，以便獲得攜帶外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能夠產(chǎn)生可育雄性配子；培育所述第二水稻植株，以便獲得不含外源基因的種子，從而構(gòu)建水稻雄性不育系。通過引入外源基因，可以使得第二水稻植株能夠進(jìn)行自體受精，從而得到攜帶外源基因的種子和不攜帶外源基因的種子。其中，不攜帶外源基因的種子可以作為水稻雄性不育系。從而，可以方便地通過自交源源不斷地生產(chǎn)不育系和保持系，另外，不攜帶外源基因的植株可以用作雜交的親本。由此，可以有效地用于水稻雜交。
[0013]在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中。
[0014]在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種制備水稻種子的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟:將前面所述的構(gòu)建體引入到雄性不育水稻植株中；以及將所述水稻植株自體受精，以獲得含有前面所述的構(gòu)建體的種子。
[0015]在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述轉(zhuǎn)基因植株是通過將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中獲得的。
[0016]在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種用于制備雜交水稻的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法采用新型水稻雄性不育系，該新型水稻雄性不育系是通過前面構(gòu)建水稻雄性不育系的方法構(gòu)建的。
[0017]在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述水稻雄性不育系是通過前面構(gòu)建水稻雄性不育系的方法構(gòu)建的。
[0018]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種創(chuàng)制不同類型水稻雄性不育系的方法，其是利用分子標(biāo)記和雜交創(chuàng)制新型水稻不育系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:采用水稻ms26雄性不育植株作為母本，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因；將所述母本與輪回親本進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，以便獲得具有所述輪回親本性狀的水稻雄性不育系，其中，所述輪回親本不具有Ms26基因的純合隱性等位基因。由此，利用本發(fā)明的方法，可以在ms26純合隱性雄性水稻不育系的基礎(chǔ)上，開發(fā)更多的不同遺傳背景的不育系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用常規(guī)回交育種方法，所有不同類型的水稻都可以創(chuàng)制成相應(yīng)的智能不育系 ，使雜種優(yōu)勢資源利用率達(dá)到95%以上。
[0019]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0021]圖1為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的植物表達(dá)載體YUCCAl的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0022]圖2為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的植物表達(dá)載體pZN2的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0023]圖3為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的植物表達(dá)載體pZN2的構(gòu)建示意圖；
[0024]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，水稻核隱性不育ms26 / ms26突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，通過轉(zhuǎn)基因所得到的轉(zhuǎn)化體通過自交得到不育系的示意圖，其中ms/ms指水稻核隱性不育純合突變體；
[0025]圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的熒光種子和非熒光種子的分離比例(pZN2轉(zhuǎn)基因植株);
[0026]圖6顯示根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，通過分子輔助篩選(MAS)的方法來進(jìn)行通過回交轉(zhuǎn)育構(gòu)建不育系的流程示意圖；
[0027]發(fā)明詳細(xì)描述
[0028]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0029]本文提到的所有參考文獻(xiàn)都通過引用并入本文。
[0030]除非有相反指明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。材料、方法和例子僅作闡述用，而非加以限制。
[0031]術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。
[0032]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:發(fā)明人以水稻核隱性不育突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，通過將緊密連鎖的3個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至不育系，其中，育性恢復(fù)基因可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，篩選基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系來源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，可以以水稻核隱性不育ms26 / ms26突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，將緊密連鎖的3個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至不育系:育性恢復(fù)基因0sCYP704B2 (Ms26)可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，花粉失活基因OsYUCCAl可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，熒光色選基因用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系來源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。由于該技術(shù)利用生物技術(shù)生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，解決了水稻雜交制種過程中面臨的瓶頸問題，即三系法資源利用率低而兩系法中不育系育性不穩(wěn)定的問題。
[0033]由此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提出了一個(gè)基因，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該基因特異性地在水稻花粉中過表達(dá)，可以導(dǎo)致水稻花粉的發(fā)育異常，并進(jìn)一步導(dǎo)致花粉失活，失去授精能力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻花粉失活基因的編碼區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述核苷酸編碼如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。即，可以采用的水稻花粉失活基因?yàn)镺sYUCCAl，由此，可以將其在花粉中過表達(dá)作為水稻花粉的失活基因。OsYUCCAl基因在花藥中特異性高表達(dá)時(shí)，會導(dǎo)致植株的花粉活力下降，失去授精能力，而雌性育性正常。
[0034]由此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu)建體包括:第一表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼水稻雄性不育恢復(fù)基因；以及第二表達(dá)盒，所述第二表達(dá)盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼花粉失活基因。利用該構(gòu)建體，能夠有效地將水稻雄性不育恢復(fù)基因和花粉失活基因引入到水稻植株例如水稻純合隱性雄性不育植株中，從而得到攜帶外源基因的可育株作為保持系，從而可以方便地通過自交源源不斷地生產(chǎn)不育系和保持系，另外，不攜帶外源基因的植株可以用作雜交之中的親本。由此，可以有效地用于水稻雜交。
[0035]在本文中，構(gòu)建體的形式不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，其可以為質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，構(gòu)建體(有時(shí)也稱為表達(dá)載體、遺傳載體或載體)呈質(zhì)粒的形式。質(zhì)粒作為遺傳載體，具有操作簡單，可以攜帶較大片段的性質(zhì)，便于操作和處理。質(zhì)粒的形式也不受特別限制，既可以是環(huán)形質(zhì)粒，也可以是線性質(zhì)粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用Ti載體，例如可以采用將第一和第二表達(dá)盒設(shè)置在表達(dá)載體PZN2的T-DNA之左右邊界之間。由此，可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將第一和第二表達(dá)盒轉(zhuǎn)化至受體植株，例如水稻ms26隱性核雄性不育突變體中。由此，可以獲得不含除草劑抗性標(biāo)記基因和抗生素抗性標(biāo)記基因的水稻轉(zhuǎn)化株系。如此獲得的轉(zhuǎn)化株系有如下特點(diǎn):(I)轉(zhuǎn)化位點(diǎn)在各世代始終處于雜合狀態(tài)，因此有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)，所以外源基因僅通過雌配子傳遞至下一代，不會通過花粉漂移到環(huán)境中；(2)轉(zhuǎn)化體自交可結(jié)實(shí)，所結(jié)可育種子與不育種子的比例為1:1，可育株(帶有外源基因)用作保持系，可以通過自交方便地、源源不斷地生產(chǎn)不育系和保持系，不育株(不含轉(zhuǎn)基因成分)在生產(chǎn)上用作雜交制種的親本；(3)因?yàn)椴挥瓴缓D(zhuǎn)基因，因此用其生產(chǎn)的雜交種子不含轉(zhuǎn)基因，用此雜交種生產(chǎn)的水稻商品糧食更不含轉(zhuǎn)基因，從而消除了轉(zhuǎn)基因生物安全的隱患。該新型雜交育種體系為充分利用水稻雜種優(yōu)勢提供了切實(shí)可行的技術(shù)新突破。
[0036]在本發(fā)明中所使 用的術(shù)語“核酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其長度不受任何特別限制。對于用于構(gòu)建重組細(xì)胞的載體，優(yōu)選核酸為DNA，因?yàn)镈NA相對于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，水稻雄性不育恢復(fù)基因的類型并不受特別限制，包括但不限于 MSP1、PAIR1、PAIR2、ZEP1、MELL、PSS1、TDR、UDT1、GAMYB4、PTC1、API5、WDA1、Ms26、DPW、MADS3、AID1、MS2等育性相關(guān)基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻雄性不育恢復(fù)基因編碼具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。即，可以采用的水稻雄性不育恢復(fù)基因?yàn)?sCYP704B2，由此，可以將其作為水稻受體ms26純合突變體(完全雄性不育)的野生型育性恢復(fù)基因。0sCYP704B2基因編碼的蛋白均在花藥發(fā)育的階段發(fā)揮重要的作用，基因突變后都會導(dǎo)致植株雄性不育，而雌性育性正常。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻雄性不育恢復(fù)基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。其中SEQ ID NO:4與野生型的0sCYP704B2基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)相比，SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列引入了三個(gè)單核苷酸突變，但不改變其編碼的氨基酸序列，這三個(gè)單核苷酸突變在0sCYP704B2基因編碼區(qū)上的位置及具體突變分別為:238位核苷酸A突變?yōu)镃 ;240位的核苷酸G突變?yōu)镃 ;243位的核苷酸G突變?yōu)镃。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列能夠便于在各種分子鑒定中區(qū)別外源基因與內(nèi)源基因，并且能夠更有效地使水稻mS26/mS26不育受體植株的育性得到恢復(fù)。
[0039]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一表達(dá)盒還可以進(jìn)一步包括:第一啟動子，所述第一啟動子與所述第一核酸分子可操作地相連，所述第一啟動子為雄配子特異性啟動子；以及第一終止子，所述第一終止子與所述第一核酸分子可操作地相連。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一啟動子和第一終止子的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，對于0sCYP704B2，可以采用0sCYP704B2的內(nèi)源啟動子、ORF區(qū)及終止區(qū)的序列，均為野生水稻基因組序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一啟動子具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一終止子具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該啟動子和終止子的組合，能夠進(jìn)一步顯著地提高表達(dá)相應(yīng)蛋白的效率，進(jìn)而能夠提高利用構(gòu)建體構(gòu)建不育系的效率，并且能夠更有效地使水稻ms26/ms26不育受體植株的育性得到恢復(fù)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，花粉失活基因的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述花粉失活基因編碼具有如SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。由此，可以編碼OsYUCCAl所編碼的類黃素單加氧酶。類黃素單加氧酶是吲哚乙酸(IAA,植物體內(nèi)最主要的生長素類激素)生物合成過程中的關(guān)鍵酶，催化將色胺(tryptamine, ΤΑΜ)轉(zhuǎn)化成羥基色胺(N-hydroxy tryptamine, NHT)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述花粉失活基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，與野生型的OsYUCCAl基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)相比，本發(fā)明中的OsYUCCAl基因的核苷酸序列SEQID NO:1引入了三個(gè)單核苷酸突變，但不改變其編碼的氨基酸序列，這三個(gè)單核苷酸突變在OsYUCCAl基因編碼區(qū)上的位置及具體突變分別為:33位核苷酸G突變?yōu)锳 ；36位的核苷酸G突變?yōu)镃 ;42位的核苷酸C突變?yōu)镚。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列能夠便于在各種分子鑒定中區(qū)別外源基因與內(nèi)源基因，并且能夠更有效地在水稻中發(fā)揮花粉失活功能。由此，可以進(jìn)一步提高表達(dá)相應(yīng)蛋白的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第二表達(dá)盒進(jìn)一步包括:第二啟動子，所述第二啟動子與所述第二核酸分子可操作地相連，所述第二啟動子為花粉特異性啟動子；以及第二終止子，所述第二終止子與所述第二核酸分子可操作地相連。由此，可以更有效的提高相應(yīng)基因的表達(dá)效率。該設(shè)計(jì)使得所有含有此基因的轉(zhuǎn)基因花粉失活，不能授精還能嚴(yán)格防止基因漂移等生物安全問題，失活的花粉不能與周圍其它植株或雜草授粉，因而轉(zhuǎn)基因不能通過花粉漂移到環(huán)境中。
[0040]另外，根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建體還可以進(jìn)一步包括:第三表達(dá)盒，所述第三表達(dá)盒包含第三核酸分子，所述第三核酸分子編碼篩選基因，所述篩選基因?yàn)榘l(fā)光基因。由此，便于通過篩選基因的表達(dá)來確定植物及其部分是否含有構(gòu)建體所引入的基因。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用選自紅色熒光基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、花青甙Pi基因和草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因的至少一種作為篩選基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可以采用紅色熒光蛋白作為篩選基因。紅色熒光蛋白基因(RFP)，來源于礁珊瑚(Discosoma sp.)，是表達(dá)框內(nèi)唯一非糧食作物來源的基因序列。紅色突光蛋白最大吸收波長為558nm,最大發(fā)射波長為583nm。將RFP編碼的氨基酸序列通過與過敏原及毒蛋白序列比對顯示，相似性極低，無毒性及致敏性。RFP常用作遺傳轉(zhuǎn)化的篩選基因，從未發(fā)生過轉(zhuǎn)基因生物安全事件。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述篩選基因具有如SEQ ID NO:12所述的核苷酸序列。由此，可以更加有效地表達(dá)紅色熒光蛋白，增強(qiáng)RFP基因在水稻中的表達(dá)。SEQ IDNO: 12所述的核苷酸序列與野生型RFP基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示)相比，具有兩個(gè)單核苷酸突變，命名為RFP (r)。這兩個(gè)單核苷酸突變分別為:由第21位堿基C轉(zhuǎn)換為G、由第315位堿基G轉(zhuǎn)換為C。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)單核苷酸的突變可以更加有效地表達(dá)紅色熒光蛋白，增強(qiáng)紅色熒光蛋白基因在水稻中的表達(dá)。
[0042]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第三表達(dá)盒進(jìn)一步包括:第三啟動子，所述第三啟動子與所述第三核酸分子可操作地相連，所述第三啟動子為愈傷組織和/或種子、種皮、胚和胚乳等特異性的啟動子；第三終止子，所述第三終止子與所述第三核酸分子可操作地相連。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第三啟動子包括一個(gè)35S增強(qiáng)子和LTP2啟動子，其中35s增強(qiáng)子具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列，LTP2具有如SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第三終止子具有如SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列。由此,根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，RFP(r)的開放讀碼框連接于來自大麥且為愈傷組織和種子(種皮)特異性啟動子LTP2和來自馬鈴薯的終止子PIN II之間，在LTP2啟動子前還有一個(gè)來自煙草花葉病毒的35S增強(qiáng)子序列，重組成RFP (r)基因表達(dá)盒(35S::LTP2::RFP(r):: PINII)。含有該表達(dá)框的水稻愈傷及種子在熒光激發(fā)下呈現(xiàn)非常容易辨認(rèn)的紅色，因此該表達(dá)框在本發(fā)明中用于遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記和用于辨認(rèn)和分選保持系和不育系種子。
[0043]由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的構(gòu)建體，以非轉(zhuǎn)基因隱性核雄性不育水稻(mS26/mS26)作為轉(zhuǎn)化的受體，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到整合含有以下緊密連鎖的三個(gè)外源基因RFP(r)，Ms26，OsYUCCAl的水稻保持系，Ms26即0sCYP704B2育性基因。外源基因的插入與內(nèi)源雄性不育位點(diǎn)(mS26/mS26)是非連鎖的，因此得到的轉(zhuǎn)基因水稻保持系含有獨(dú)立的純合的ms26隱性不育位點(diǎn)及雜合的外源基因(包括Ms26基因)整合位點(diǎn)。
[0044]由此，可以通過常規(guī)技術(shù)，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將前述構(gòu)建體引入到水稻的細(xì)胞、組織或器官中，以便得到可以后續(xù)用于研究、雜交的樣本。因而，在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種水稻細(xì)胞、組織或器官。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該水稻細(xì)胞、組織或器官中含有前面所述的構(gòu)建體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻細(xì)胞、組織或器官來自水稻純合隱性雄性不育植株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。由此，本發(fā)明的水稻細(xì)胞、組織或器官，可以有效地用于構(gòu)建雄性不育株。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該水稻細(xì)胞、組織或器官，不再贅述。 [0045]由此，在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，參考圖4，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到第一水稻純合隱性雄性不育植株中，以便獲得攜帶外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能夠產(chǎn)生可育雄性配子，并且第二水稻植株中的外源基因處于雜合狀態(tài)，因此第二水稻植株中有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)。第二水稻植株即轉(zhuǎn)化體自交受精，得到兩類種子:攜帶外源基因的紅色熒光種子與不攜帶外源基因的非紅色熒光種子，兩者各占50%。這兩類種子可以分別被用作保持系與不育系，進(jìn)行不育系的繁殖和雜交種子的生產(chǎn)。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過熒光檢測進(jìn)行分揀的步驟，即通過檢測水稻種子是否攜帶發(fā)光基因，例如是否發(fā)出熒光來進(jìn)行分揀，區(qū)分其是否攜帶外源基因，如圖5所示。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該方法，不再贅述。
[0047]在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該方法，不再贅述。
[0048]在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種制備水稻種子的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟:將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻植株中；以及將所述水稻植株自體受精，以獲得含有前面所述的構(gòu)建體的種子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻植株為水稻純合隱性雄性不育植株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。
[0049]在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種轉(zhuǎn)基因材料。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述轉(zhuǎn)基因材料是通過將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中獲得的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法引入所述構(gòu)建體。
[0050]在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種用于制備雜交水稻的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法采用水稻雄性不育系，該水稻雄性不育系是通過前面構(gòu)建水稻雄性不育系的方法構(gòu)建的。由此，可以進(jìn)一步利用本發(fā)明的水稻雄性不育系進(jìn)行水稻雜交，提高水稻雜交的效率。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該方法，不再贅述。
[0051]在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述水稻雄性不育系是通過前面構(gòu)建水稻雄性不育系的方法構(gòu)建的。由此，可以進(jìn)一步利用本發(fā)明的水稻雄性不育系進(jìn)行水稻雜交，可以大大提高培育優(yōu)良雜交水稻新組合的概率。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該用途，不再贅述。 [0052]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括采用水稻純合隱性雄性不育植株作為母本，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因；將母本與輪回親本進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，以便獲得具有所述輪回親本性狀的水稻雄性不育系，其中，所述輪回親本不具有Ms26基因的純合隱性等位基因。由此，利用本發(fā)明的方法，可以在MS26純合隱性雄性水稻不育系的基礎(chǔ)上，發(fā)展更多的不同遺傳背景的不育系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用常規(guī)回交育種方法，所有不同類型的水稻都可以創(chuàng)制成相應(yīng)的智能不育系(即可以源源不斷地生產(chǎn)相應(yīng)的不育系)，而且理論上所有水稻品種都可作為雜交的父本，使雜種優(yōu)勢資源利用率達(dá)到95%以上。
[0053]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以作為輪回親本的品系不受特別限制，根據(jù)具體的實(shí)施例，輪回親本可以具有選自配合力強(qiáng)、株型好、抗病、抗蟲和高產(chǎn)的至少一種性狀。由此，可以獲得具有這些性狀的雄性水稻不育系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，輪回親本可以為選自天豐、華 268、華恢 624、華 211、華恢 3411、華恢 451、華恢 2855、R608、華恢 374、華恢 3501、H451、R608、華占、黃華占、H268、H819、滬閩粳等的至少一種。
[0054]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，參考圖6，可以通過分子輔助篩選(MAS)的方法來進(jìn)行通過回交轉(zhuǎn)育構(gòu)建不育系。具體地，如圖6所示，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將所述母本與輪回親本進(jìn)行至少3次回交。另外，在進(jìn)行回交的過程中，可以通過分子標(biāo)記輔助進(jìn)行前景選擇和背景選擇。
[0055]進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述構(gòu)建水稻雄性不育系的方法可以包括下列步驟:
[0056]首先，將ms26突變體(MS26純合隱性雄性水稻不育系)與輪回親本進(jìn)行雜交，得到雜交Fl ；[0057]接下來，將Fl與輪回親本進(jìn)行回交，得到BClFl ；
[0058]接下來，將BClFl與輪回親本進(jìn)行回交，得到BC2F1 ；
[0059]接著，將BC2F1進(jìn)行自交，得到BC2F2 ；
[0060]接著，將BC2F2與輪回親本進(jìn)行回交，以便得到BC3F1 ；
[0061]最后，將BC3F1進(jìn)行自交，得到新構(gòu)建的不育系BC3F2。
[0062]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過分子標(biāo)記，對回交和自交產(chǎn)物進(jìn)行前景選擇和背景選擇。例如，可以對Fl代不需要進(jìn)行選擇，對BClFl進(jìn)行前景和背景選擇，選擇ms26的雜合體J#B2C2F1進(jìn)行前景和背景選擇，選擇ms26的雜合體；對B2C2F1進(jìn)行前景選擇和背景選擇，得到ms26的雜合體J#BC3F1進(jìn)行前景和背景選擇，得到ms26的雜合體；最后，對BC3F2進(jìn)行前景選擇和背景選擇，以便得到ms26純合體。如圖6右側(cè)兩欄所示，通過MAS選擇后輪回親本的血緣可以達(dá)到99.5%。
[0063]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，用于回交轉(zhuǎn)育的水稻純合隱性雄性不育植株可以是通過前面所述的構(gòu)建不育系的方法構(gòu)建獲得的。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該方法，不再贅述。
[0064]需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的構(gòu)建體及其用途是本申請的發(fā)明人經(jīng)過艱苦的創(chuàng)造性勞動和優(yōu)化工作才完成的?！揪唧w實(shí)施方式】述中，除非另有說明，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上。
[0065]下面根據(jù)具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明。需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是為了說明本發(fā)明，而不能以任何方式解釋為對本發(fā)明的限制。另外，除非特別說明，在下面的實(shí)施例中所涉及的方法為常規(guī)方法，所涉及的材料和制劑也為市售可得的。
[0066]下面參考具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0067]若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0068]實(shí)施例1:在水稻花粉中特異性高表達(dá)OsYUCCAl基因的表型分析
[0069]通過裝配下述DNA元件，構(gòu)建圖1所示的被稱為YUCCAl的表達(dá)載體，具體構(gòu)建步驟如下:從玉米基因組中擴(kuò)增PG47啟動子(SEQ ID NO:9，擴(kuò)增引物:F1，R1)，從水稻cDNA中擴(kuò)增OsYUCCAl基因(SEQ ID NO:1，擴(kuò)增引物:F2，R2)，擴(kuò)增人工合成的IN2-1終止子(SEQ ID NO:17，擴(kuò)增引物:F3，R3)，三者連接T載體測序驗(yàn)證后，分別用Hind III+Not I，AsiSI+Not I，AsiSI+Bgl II 酶切，同時(shí)連接進(jìn)入BamH I+Hind III 酶切完全的pCAMBIA1300載體中，得到pYUCCAl的表達(dá)載體。，得到Y(jié)UCCAl的表達(dá)載體。
[0070]其中，所用弓丨物序列為:
[0071]Fi: ττ '^agcttI gcatgcctgcaggtcgactctagaggatctgcaccggacactgtctggtgg (seq
ID N0:21)，方框內(nèi)為HindIII酶切位點(diǎn)。
[0072]Rl:AT ^CGGCCGC[ TATGACGTGATCGATGCTTTATTCGCSEQ ID NO: 22)，方框內(nèi)為 NotI 酶切位點(diǎn)，
[0073] F2:TT |gcggccgc[ ATGGACAACAAGCCGGCGCAAGAACGCCGCGAAACCTGGGTGCCG (SEQ IDN0:23)，方框內(nèi)為NotI酶切位點(diǎn)。
[0074]R2: TC:^CGATCGC[ TCATCTCGAGATATATATCACTAGTAG (SEQ ID NO: 24)，方框內(nèi)為 AsisI酶切位點(diǎn)
[0075]F3:GA |GCGATCGCl< GATCTGACAAAGCAGCATTAGTCCG (SEQ ID NO: 25)，方框內(nèi)為 AsiSI酶切位點(diǎn)
[0076]R3:GT ^GATCT|l CGTGGAGATATAGGGGAAAGAGAAC (SEQ ID NO: 26)，方框內(nèi)為 BglII 酶切位點(diǎn)。
[0077]利用熱激法將質(zhì)粒YUCCAl轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGLO菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對水稻武運(yùn)粳7號野生型受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到25株該載體相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株材料。移栽到田間后，觀察轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏谋硇停瑑深愔仓曛g沒有觀察到明顯的形態(tài)上的不同。
[0078]在花粉成熟期，取武運(yùn)粳7號野生型受體材料和轉(zhuǎn)基因材料的花藥進(jìn)行活性染色。采用的方法為:在水稻開花晚期，從轉(zhuǎn)基因水稻植株及武運(yùn)粳7號野生型受體對照植株各隨機(jī)抽取單株，各株取一朵花，每朵花取I個(gè)花藥，置于載玻片中央，滴加一滴1%的I2-1K溶液，用鑷子和解剖針釋放花粉后，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)可染色花粉數(shù)和花粉總數(shù)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因水稻植株及武運(yùn)粳7號野生型受體對照植株的可育率均在95%~100%之間，說明過表達(dá)OsYUCCAl的花粉在花粉成熟期利用I2-1K染色正常，沒有染色敗育現(xiàn)象出現(xiàn)。
[0079]進(jìn)一步，在 花藥散粉的當(dāng)天上午，采集武運(yùn)粳7號野生型受體材料和轉(zhuǎn)基因材料的花藥進(jìn)行了體外花粉萌發(fā)和花粉管伸長能力的測定。從武運(yùn)粳7號野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株各隨機(jī)抽取單株，各株取一朵花，每朵花取I個(gè)花藥，用解剖針剖開花藥后，將成熟的花粉均勻分散到花粉液體培養(yǎng)基中(成分為:20%蔗糖，10%PEG4000, 3mMCaC12,40mg/L硼酸，3mg/L維生素BI)，置于28°C度保溫箱中保溫30分鐘后，統(tǒng)計(jì)各個(gè)植株花藥中花粉萌發(fā)和花粉管伸長的花粉占總花粉數(shù)目的比例。初步結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因水稻植株的花粉體外萌發(fā)及花粉管伸長的比率比武運(yùn)粳7號野生型受體對照植株的花粉體外萌發(fā)及花粉管伸長的比率顯著下降(下降~50%)，，推測是由于轉(zhuǎn)基因的水稻植株中含有轉(zhuǎn)基因的花粉(50%)因過量表達(dá)OsYUCCAl基因，導(dǎo)致其活性降低。
[0080]以上結(jié)果表明，在水稻花粉中特異過表達(dá)OsYUCCAl基因，可以使水稻花粉萌發(fā)或花粉管伸長活性降低，也即失去了授精能力，因此，該基因可以作為花粉失活基因，用于后續(xù)的新型育性調(diào)控載體的構(gòu)建的關(guān)鍵基因元件之一。
[0081 ] 實(shí)施例2:pZN2載體構(gòu)建
[0082]通過裝配下述DNA元件,構(gòu)建圖2所示的被稱為pZN2的表達(dá)載體,具體構(gòu)建步驟如圖3所示:
[0083]第一步:先從玉米基因組中擴(kuò)增PG47啟動子(SEQ ID NO:9，擴(kuò)增引物:F1，R1)，從水稻cDNA中擴(kuò)增OsYUCCAl基因(SEQ ID NO:1，擴(kuò)增引物:F2, R2)，分別用Hind III+Not
I,BamHI+Not I酶切，同時(shí)連接進(jìn)入BamHI+Hind III酶切完全的pCAMBIA1300載體中，得到中間載體I。
[0084]第二步:PCR擴(kuò)增人工合成的PINI1-RFP-LTP2序列(SEQ ID NO:10，擴(kuò)增引物為:F3, R3)，連接T載體測序驗(yàn)證后，用Nael+AscI酶切并連接入Nael+AscI完全酶切的中間載體1，得到中間載體2。
[0085]第三步:從水稻基因組DNA中擴(kuò)增CYPl (SEQ ID NO:19，擴(kuò)增引物為:F4，R4);從人工合成的CYP2-1N2-1擴(kuò)增CYP2-1N2-1(SEQ ID N0:15，擴(kuò)增引物為:F5，R5)，所得到的兩個(gè)片段，連接T-載體測序驗(yàn)證正確后，再分別用Ascl+Sall和Sall+AsiS I雙酶切，同時(shí)連接進(jìn)入用AsiSI+AscI雙酶切的中間載體2，即得到中間載體3。
[0086]第四步:PCR擴(kuò)增人工合成的35S增強(qiáng)子(35S enhancer)序列(SEQ ID N0:16，擴(kuò)增引物為:F6，R6)，連接T-載體測序驗(yàn)證正確后，再用Asc I酶切開連接進(jìn)入Asc I酶切開的中間載體3，驗(yàn)證正確后得到載體pZN2。
[0087]其中，所用弓丨物序列為:
[0088]fi:gc [aagcttg丨(catgcctgcaggtcgactctagaggatctgcaccggacactgtctggtgg (seq
ID N0:27)，方框內(nèi)為Hind III酶 切位點(diǎn)。
[0089]Rl:AT |GCGGCCGC[r TATGACGTGATCGATGCTTTATTCG (SEQ ID NO: 28)，方框內(nèi)為 Not I
酶切位點(diǎn)。F2:τα.1gcggccg^atggacaacaagccggcgcaagaaccseq id no:29)，方框內(nèi)為 Not ι
酶切位點(diǎn)。R2:AA l|G6ATC4 A ^GCGCGCC^ GAATCCT ^CGATCGC[r TCATCTCGAGATATATATCACTAGTAGT(SEQ ID NO:30)，方框內(nèi)分別依次為BamHI，Asc I和AsiS I酶切位點(diǎn)。
[0090]F3:TA ^GCGCGCC^ AACCGTCTCTTCGTGAGAATAACCG (SEQ ID NO: 31 )，方框內(nèi)為 Asc I
酶切位點(diǎn).R3:CTT jGCCGG(ji CGCATTCGCAAAACACACCTAGAC (SEQ ID NO: 32)，方框內(nèi)為限制性內(nèi)切酶Nae I酶切位點(diǎn)；
[0091]F4: TCGAAGGACCGCACCGTGACC:丨GTCGACp ATG (SEQ ID NO: 33)，方框內(nèi)為 Sal I 酶切位點(diǎn)。
[0092]R4:CG lGGCGCGC(jr TCGCGATTGGTCGAACACGAGGTAGGCGTG (SEQ ID NO: 34)，方框內(nèi)為Asc I酶切位點(diǎn)。
[0093]F5:GA ^CGATCGC|( GATCTGACAAAGCAGCATTAGTCCG(SEQ ID NO: 35)，方框內(nèi)為 AsiS I酶切位點(diǎn)。R5:CAT IgtcgX^ Ggtcacggtgcggtccttcga (SEQ ID N0:36)，方框內(nèi)為 Sal I 酶切位點(diǎn)。
[0094]F6:ττ'Iggcgc^atcacatcaatccacttgctttga (seq id no:37)，方框內(nèi)為 Asc i酶切位點(diǎn)；
[0095]R6:GA @GCGCGCC|i CGTCAACATGGTGGAGCACGACAC (SEQ ID NO: 38 )，方框內(nèi)為 Asc I酶切位點(diǎn)
[0096]實(shí)施例3:保持系的獲得、擴(kuò)繁及不育系的生產(chǎn)及原理
[0097]通過設(shè)計(jì)并驗(yàn)證，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建水稻保持系，并進(jìn)一步生產(chǎn)雄性不育系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，參考圖4，該方法包括:[0098]第一步:將實(shí)施例2所述的構(gòu)建體(含有育性恢復(fù)基因、花粉失活基因和色選基因表達(dá)框)通過遺傳轉(zhuǎn)化引入到水稻純合隱性雄性不育植株ms/ms (ms26/ms26或其它核雄性不育突變體)中，獲得攜帶外源基因的TO代水稻植株，并且TO代轉(zhuǎn)基因植株的外源基因處于雜合狀態(tài)；該植株產(chǎn)生的花粉中有一半不含外源基因，另一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)，TO代植株的育性得到恢復(fù)；
[0099]第二步，培育第一步所得到的TO代轉(zhuǎn)基因植株，使其自交后結(jié)實(shí)，獲得的Tl代種子根據(jù)遺傳背景可分為兩類，其中50%的種子為ms/ms (ms26/ms26或其它核雄性不育突變體)純合隱性和外源基因雜合背景(可直接作為保持系)，還有50%的種子為ms/ms (ms26/ms26或其它核雄性不育突變體)純合隱性且不含有外源基因(即為不育系種子);通過種子熒光色選可以將兩類種子分離開來；
[0100]第三步，培育第二步的保持系種子為植株(背景為mS26/mS26或其它核雄性不育突變體純合隱性和外源基因雜合)，這些來源的保持系產(chǎn)生的花粉一半含有外源基因，另外一半不含外源基因，保持系產(chǎn)生的種子中一半即50%含有外源基因且為紅色熒光種子(背景為ms26/ms26或其它核雄性不育突變體純合隱性突變位點(diǎn)和外源基因雜合)，可以進(jìn)一步作為保持系；另一半50%不含有外源基因且為正常顏色的非熒光種子(背景為mS26/mS26或其它核雄性不育突變體純合隱性突變位點(diǎn)和不含有轉(zhuǎn)基因成分)，即為不育系。這兩類種子可以通過色選儀分選出來，含有熒光的種子作為保持系，可以繼續(xù)自交擴(kuò)繁得到等量保持系和不育系的種子，而不含外源轉(zhuǎn)基因的非熒光種子被作為不育系進(jìn)行雜交育種或制種(圖 4)。
[0101]實(shí)施例4:水稻轉(zhuǎn)化
[0102]利用熱激法將質(zhì)粒pZN2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGLO菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對水稻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，利用載體中的RFP(r)基因編碼的紅色熒光蛋白作為篩選標(biāo)記，通過3-4輪的愈傷熒光篩選切割后，分化得到兩個(gè)載體相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株材料。具體的轉(zhuǎn)化受體材料為水稻ms26完全雄性不育純合突變體，關(guān)于水稻ms26完全雄性不育純合突變體材料的具體描述見中國專利 CN200910309083.1(以及 The Plant Cell Vol.22:173-190，2010 年 I 月)，該材料目前公眾是可以獲取的，通過將這兩篇文獻(xiàn)參照并入本文。
[0103]需要說明的是，也可以通過常規(guī)的基因敲除的方法，將水稻ms26基因全部敲除后，得到水稻ms26完全雄性不育純合突變體。
[0104]實(shí)施例5:轉(zhuǎn)基因植株的花粉育性檢測
[0105]對實(shí)施例2中的構(gòu)建體遺傳轉(zhuǎn)化所得到的轉(zhuǎn)基因植株材料進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓曛g沒有觀察到明顯的形態(tài)上的不同。
[0106]對pZN2構(gòu)建體轉(zhuǎn)化ms26突變體得到的轉(zhuǎn)基因植株材料，同時(shí)進(jìn)行了花粉可染率及花粉萌發(fā)和花粉管伸長活力檢測，同時(shí)對兩個(gè)對照材料包括受體品系對應(yīng)的野生型非轉(zhuǎn)基因水稻品種武運(yùn)粳7號(可育，下面簡稱為CKl)和轉(zhuǎn)基因水稻對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因水稻品系武運(yùn)粳7號ms26突變體(不育，下面簡稱為CK2)，進(jìn)行花粉可染率及花粉萌發(fā)和花粉管伸長活力檢測。
[0107]測定花粉可染率采用的方法為:在水稻開花晚期，從轉(zhuǎn)基因水稻植株、及其對照CKl及CK2小區(qū)各隨機(jī)抽取單株，各株取一朵花，每朵花取I個(gè)花藥，置于載玻片中央，滴加一滴1%的I2-1K溶液，用鑷子和解剖針釋放花粉后，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)可染色花粉數(shù)和花粉總數(shù)。在CKl正?？捎虲K2正常不育的前提下，分析轉(zhuǎn)基因水稻植株(保持系)的花粉可染率。結(jié)果顯示可育對照(CKl)的可育率在96%~100%之間，不育對照(CK2)可育率為0，而多個(gè)隨機(jī)抽取的轉(zhuǎn)基因(保持系)植株中，花粉染色比例也在95-98%之間，說明轉(zhuǎn)化PZN2載體的轉(zhuǎn)基因水稻植株中過表達(dá)OsYUCCAl的花粉在花粉成熟期I2-1K染色正常，沒有染色敗育出現(xiàn)。
[0108]測定花粉萌發(fā)和花粉管伸長活力采用的方法為:在花粉成熟期，從轉(zhuǎn)基因水稻植株、及對照CKl及CK2小區(qū)各隨機(jī)抽取單株，各株取一朵花，每朵花取I個(gè)花藥，進(jìn)行花粉體外萌發(fā)和花粉管伸長能力的測定(采用的具體方法同實(shí)施例1 )。初步結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因水稻植株的花粉體外萌發(fā)及花粉管伸長的比率比武運(yùn)粳7號野生型受體對照(CKl)植株的花粉體外萌發(fā)及花粉管伸長的比率顯著下降(下降~50%)，推測是由于轉(zhuǎn)基因的水稻植株中含有轉(zhuǎn)基因的花粉(50%)因過量表達(dá)OsYUCCAl基因，導(dǎo)致其活性降低。這些結(jié)果表明本發(fā)明中所提供的OsYUCCAl基因過表達(dá)框在整個(gè)新型不育表達(dá)載體中工作正常，可以實(shí)現(xiàn)致使花粉失活的目的，作為整體表達(dá)良好。
[0109]實(shí)施例6:轉(zhuǎn)基因植株的熒光種子與非熒光種子分離比例
[0110]隨機(jī)選取實(shí)施例2中所得到的載體(pZN2)的24個(gè)TO代植株單株，對其上所結(jié)Tl代熒光與非熒光種子的分離比例進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株上所結(jié)種子均符合1:1分離比(圖5)，表明本發(fā)明中所提供的表達(dá)載體各元件作為整體表達(dá)良好。即所構(gòu)建的保持系(熒光種子)可以產(chǎn)生等量的攜帶外源基因的花粉和不攜帶外源基因的花粉，自交授粉結(jié)實(shí)后獲得兩類分別攜帶和不攜帶外源基因的種子，其中，攜帶外源基因的熒光種子作為保持系，可以通過自交源源不斷地繼續(xù)生產(chǎn)不育系和保持系，而不攜帶外源基因的非熒光正常種子培育的植株可以作為不育系用作雜交育種的親本。
[0111]由上述實(shí)施例 5和實(shí)施例6可以看出，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了其穩(wěn)定創(chuàng)制水稻雄性不育系和保持系的發(fā)明目的。
[0112]實(shí)施例7:回交轉(zhuǎn)育創(chuàng)制不育系
[0113]在已有水稻種質(zhì)資源中選擇性狀優(yōu)良的，如配合力強(qiáng)、抗病、抗蟲和高產(chǎn)等優(yōu)良農(nóng)藝性狀的水稻材料作為父本(輪回親本，在實(shí)施例中，采用天豐，華268，華恢624，華211，華恢 3411，華恢 451，華恢 2855，R608，華恢 374、華恢 3501、H451、R608、華占、黃華占、H268、H819、滬閩粳等作為輪回親本)，將不育基因和以通過上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因事件作為母本，兩者通過回交轉(zhuǎn)育將輪回親本制作成具有優(yōu)良性狀的新型不育系(圖6)，創(chuàng)制了一批新型不育系和大大擴(kuò)展了品種資源的雜交利用率，尤其是可以改變粳稻中幾乎沒有很好的兩系雜交組合的現(xiàn)狀，可擴(kuò)展雜交粳稻種植面積，擴(kuò)大了雜種優(yōu)勢利用范圍，提高品種資源的利用效率。
[0114]工業(yè)實(shí)用性
[0115]本發(fā)明的構(gòu)建體，能夠有效地應(yīng)用于水稻雄性不育系和保持系的構(gòu)建，進(jìn)而獲得的育性穩(wěn)定的水稻雄性不育系和保持系能夠高效地應(yīng)用于雜交種子的生產(chǎn)，從而能夠獲得安全、優(yōu)質(zhì)的雜交水稻種子。
[0116]盡管本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。[0117] 在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示意性實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或 多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
【權(quán)利要求】
1.一個(gè)花粉活性調(diào)控基因，其特征在于，所述花粉活性調(diào)控基因的編碼區(qū)核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 2 所示。
2.權(quán)利要求1所述的花粉活性調(diào)控基因，其中所述的編碼區(qū)核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
3.—種表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒中含有一個(gè)花粉活性調(diào)控基因，所述花粉活性調(diào)控基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
4.一種構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體含有一個(gè)花粉活性調(diào)控基因，所述花粉活性調(diào)控基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
5.權(quán)利要求4所述的構(gòu)建體，其中所述的花粉活性調(diào)控基因由一個(gè)花粉特異性表達(dá)的啟動子驅(qū)動表達(dá)，所述花粉特異性表達(dá)的啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
6.權(quán)利要求5所述的構(gòu)建體，其中所述的花粉活性調(diào)控基因還連有一個(gè)終止子，所述終止子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示。
7.權(quán)利要求4所述的構(gòu)建體，其中所述的構(gòu)建體還包含一個(gè)雄性不育恢復(fù)基因，所述雄性不育恢復(fù)基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
8.權(quán)利要求4或7所述的構(gòu)建體，其中所述的構(gòu)建體還含有一個(gè)篩選標(biāo)記基因，所述篩選標(biāo)記基因選自紅色熒光基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、花青甙/77基因和草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因的至少一種。
9.權(quán)利要求8所述的構(gòu)建體，其中所述的紅色熒光基因的核苷酸序列如SEQID NO:12所示。
10.權(quán)利要求9所述的構(gòu)建體，其中所述的紅色熒光基因連有一個(gè)啟動子，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
11.權(quán)利要求10所述的構(gòu)建體，其中所述的啟動子的5’端還連有一個(gè)增強(qiáng)子序列，所述增強(qiáng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
12.權(quán)利要求10所述的構(gòu)建體，其中所述的紅色熒光基因還連有一個(gè)終止子，所述終止子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
13.一種恢復(fù)雄性不育植株育性的方法，所述方法包括:將權(quán)利要求4-12之任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的水稻純合隱性雄性不育是由于育性恢復(fù)基因SEQ ID N0:4的生物學(xué)功能缺失所導(dǎo)致。
15.一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法，其特征在于，包括: a)將權(quán)利要求4-12之任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體引入到第一水稻純合隱性雄性不育植株中，以便獲得攜帶外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能夠產(chǎn)生可育雄性配子； b)培育所述第二水稻植株，以便獲得不表達(dá)外源基因的種子，從而獲得水稻雄性不育系O
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的水稻純合隱性雄性不育是由于育性恢復(fù)基因SEQ ID N0:4的生物學(xué)功能缺失所導(dǎo)致。
17.一種用于制備雜交水稻的方法，其采用水稻雄性不育系，其特征在于，所述水稻雄性不育系是通過權(quán)利要求15所述的方法構(gòu)建的。
18.水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途，其特征在于，所述水稻雄性不育系是通過權(quán)利要求15述的方法構(gòu)建的。
19.一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法,其特征在于,包括: a)采用水稻純合隱性雄性不育植株作為母本，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因； b)將所述母本與輪回親本進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，以便獲得具有所述輪回親本性狀的水稻雄性不育系，其中，所述輪回親本不具有Ms26基因的純合隱性等位基因。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述輪回親本具有選自配合力強(qiáng)、抗病、抗蟲和高產(chǎn)的至少一種性狀。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述輪回親本為選自天豐、華268、華恢624、華 211、華恢 3411、華恢 451、華恢 2855、R608、華恢 374、華恢 3501、H451、R608、華占、黃華占、H268、H819、滬閩粳的至少一種。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，將所述母本與輪回親本進(jìn)行至少3次回交。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述水稻純合隱性雄性不育植株是通過權(quán)利要求15所述的方 法構(gòu)建的。
【文檔編號】C12N15/53GK104004775SQ201310581181
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月26日
【發(fā)明者】王海洋, 唐曉艷, 周君莉, 陳竹鋒 申請人:未名興旺系統(tǒng)作物設(shè)計(jì)前沿實(shí)驗(yàn)室（北京）有限公司, 深圳興旺生物種業(yè)有限公司, 興旺投資有限公司