稻米直鏈淀粉含量微控基因AGPS2a分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種稻米直鏈淀粉含量微控基因AGPS2a的分子標(biāo)記AGPS2a-m，以水稻作為物種，所述分子標(biāo)記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5′→3′，AGPS2a-m正向：TCTTCTTTTAGATCTTAAATTTCAGA，反向：CACATCAAAGTTGTAGTTTTGTGA。上述分子標(biāo)記AGPS2a-m能用于水稻稻米直鏈淀粉含量鑒定和/或其后代輔助選擇育種。當(dāng)為日本晴和特青的后代時(shí)，選擇后代中帶型與日本晴帶型一致的單株用于育種改良。
【專利說明】稻米直鏈淀粉含量微控基因AGPS2a分子標(biāo)記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程，特別涉及與稻米直鏈淀粉含量調(diào)控基因AGPS2a有關(guān)的分子標(biāo)記及其獲得方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)一直是水稻育種長期追求的目標(biāo)。經(jīng)過長期的努力，尤其是雜交稻技術(shù)的利用，我國在水稻生產(chǎn)上取得了舉世公認(rèn)的成就。但是由于過去一直把如何解決人們的溫飽問題放在第一位，故而水稻育種工作的重點(diǎn)大部分集中于水稻高產(chǎn)新品種的培育，從而導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)稻米的育種嚴(yán)重滯后，特別是一些高產(chǎn)的雜交稻品質(zhì)普遍偏差。
[0003]導(dǎo)致稻米品質(zhì)改良進(jìn)展較慢的另一個(gè)主要原因是稻米品質(zhì)遺傳的復(fù)雜性和傳統(tǒng)育種手段的局限性。稻米的品質(zhì)性狀包括外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)、蒸煮品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)等諸多方面，而稻米蒸煮品質(zhì)是評價(jià)稻米品質(zhì)的最重要指標(biāo)。蒸煮品質(zhì)是指稻米在蒸煮過程中所表現(xiàn)出來的特性，主要由直鏈淀粉含量(Amylose Content, AC)、膠稠度(GelConsistency, GC)、糊化溫度(Gelatinization Temperature, GT)三個(gè)理化指標(biāo)來評價(jià)，其中AC是影響稻米品質(zhì)最主要的理化指標(biāo)。育種學(xué)家和遺傳學(xué)家做了大量的工作以探尋稻米AC的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，然而不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果有著較大的差別。早期的研究表明稻米AC是由一個(gè)主效基因控制，并受到其他微效QTL的調(diào)控[1，2]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)Waxy (Wx)對于稻米AC的多少具有決定性的作用，可能就是控制AC的主效基因[3-5]。除在第6染體上檢測到I個(gè)主效QTL外，不同研究檢測到的微效QTL數(shù)目及位置很不一致。例如，Tan等在第1、2染色體上檢測到了兩個(gè)微效QTLs [6] ,He等在第5染色體檢測到了一個(gè)微效QTL[6]，Aluko等在第3和8染色體上分別檢測到了微效QTLs[7]。黃祖六等研究發(fā)現(xiàn)除了第6染色體的Wx基因位點(diǎn)外，在第3染色體也檢測到一個(gè)控制稻米AC的主效QTL ;另外5個(gè)微效QTLs分別位于第4、4、6、9、11染色體的不同座位上[8]。其他實(shí)驗(yàn)室在第4、6、7染色體也檢測到了控制AC的QTLs [9]。吳長明等在第6染色體上并沒有發(fā)現(xiàn)與AC有關(guān)的QTL位點(diǎn)，只是在第I，7，8，9，12染色體上發(fā)現(xiàn)5個(gè)QTL位點(diǎn)[10]。
[0004]導(dǎo)致稻米品質(zhì)改良進(jìn)展較慢的另一個(gè)主要原因是在傳統(tǒng)育種手段的局限性。傳統(tǒng)育種方法主要是對有利目標(biāo)性狀進(jìn)行定向選擇和固定，培育出優(yōu)良新品種，這具有很大的盲目性和不可預(yù)測性[11]。并且，個(gè)體選擇的方法是對符合育種目標(biāo)的農(nóng)藝性狀進(jìn)行直接選擇，即選擇的是個(gè)體表現(xiàn)型而不是基因型。由于基因間存在一因多效、多因一效、調(diào)控基因以及修飾基因等的作用，個(gè)體的表現(xiàn)型與基因型往往存在較大差異，因而通過田間表型性狀進(jìn)行個(gè)體選擇的準(zhǔn)確性較差。分子標(biāo)記輔助選擇(Marker-assisted Selection, MAS)技術(shù)給水稻育種提供了新的途徑，與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合可大大提聞育種效率，縮短育種周期。MAS的核心是把常規(guī)育種中的表型選擇轉(zhuǎn)化為基因型選擇，它直接反映了 DNA的序列差異，不受基因表達(dá)的影響，結(jié)果可靠性強(qiáng)，并且不受植物的生長發(fā)育階段及環(huán)境條件的影響[12]ο
[0005]上文中涉及的參考文獻(xiàn)如下:[0006]1.Bollich C.ff., BD.1nheritance of amylose in two hybrid populations ofrice.Cereal Chem.1973，50，631_636(Bollich C.ff., BD.直鏈淀粉含量的在兩個(gè)雜交群體的遺傳，谷物化學(xué).1973.50:631-636)；
[0007]2.McKenzie K.R., JN.Genetic analysis of amylose content, alkalispreading score, and grain dimensions in rice.Crop Sc1.1983, 23, 306-311(McKenzie K.R.，JN.水稻直鏈淀粉含量、堿消值和籽粒形態(tài)的遺傳分析.作物科學(xué).1983，23:306-311)；
[0008]3.Sano Y.Differential regulation of waxy gene expression in riceendosperm.Theor.App1.Genet.1984, 68, 467-473 (Sano Y.水稻胚乳臘質(zhì)基因表達(dá)的差異調(diào)控.理論和應(yīng)用遺傳.1984，68:467-473)；
[0009]4.Kumar 1.K., G S.Juliano, B 0.Genetic analysis of waxy locusin rice(Oryza sativa L.).Theor.Appl.Genet.1987,73,481-488.(Kumar
1.K.，G S.Juliano, B 0.水稻胚乳蠟質(zhì)基因位點(diǎn)的遺傳分析.理論和應(yīng)用遺傳.1987，73:481-488)；
[0010]5.Kumar 1.K., GS.1nheritance of amylose content in rice(Oryza sativa L.).Euphytical988，38，261-269 (Kumar 1.K.，GS.水稻直鏈淀粉含量的遺傳.歐洲植物學(xué).1988，38:261-269)；
[0011]6.Tan Y.F., Li J.X., Yu S.B., et al.The three important traits for cookingand eating quality of rice grains are controlled by a single locus in an eliterice hybrid, Shanyou63.Theor.Appl.Genet.1999, 99, 642-648 (Tan Y.F., Li J.X., YuS.B.，等.優(yōu)異雜交稻汕優(yōu)63稻米蒸煮食味品質(zhì)的三個(gè)重要指標(biāo)受單位點(diǎn)控制.理論和應(yīng)用遺傳.1999，99:642-648)；
[0012]7.Aluko G., Martinez C., Tohme J., et al.QTL mapping of grain qualitytraits from the interspecific cross Oryza sativa x 0.glaberrima.Theor.Appl.Genet.2004, 109, 630-639 (Aluko G., Martinez C., Tohme J.，等.稻米桿粒性狀在亞洲栽培稻和非洲栽培稻種間雜交群體中的QTL定位.理論和應(yīng)用遺傳.2004, 109:630-639.)；
[0013]8.黃祖六，和譚學(xué)林，Tragoonrung S.，et al.稻米直鏈淀粉含量基因座位的分子標(biāo)記定位.作物學(xué)報(bào)2000，26，777-782 ；
[0014]9.Lanceras J.C., Huang Z.L., Naivikul 0., et al.Mapping of genesfor cooking and eating qualities in Thai jasmine rice (KDML105).DNARes.2000, 7, 93-101 (Lanceras J.C., Huang Z.L., Naivikul 0.，等.泰國香米蒸煮食味品質(zhì)的基因作圖.DNA研究.2000，7:93-101)；
[0015]10.吳長明，孫傳清，陳亮，等.水稻直鏈淀粉含量與秈粳分化度的QTL及其相互關(guān)系研究.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2000，5，6-11 ;
[0016]11.黎志康.我國水稻分子育種計(jì)劃的策略.分子植物育種2005，3，603-608 ;
[0017]12.馮建成.分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在水稻育種上的應(yīng)用.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)2006，22，43-47。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0018]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與稻米淀粉合成基因AGPS2a有關(guān)的分子標(biāo)記及其開發(fā)方法和用途，本發(fā)明所得的分子標(biāo)記AGPS2a-m為稻米直鏈淀粉含量微控基因AGPS2a的分子標(biāo)記，能用于稻米直鏈淀粉含量的輔助選擇育種。
[0019]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種稻米直鏈淀粉含量微控基因AGPS2a的分子標(biāo)記，以水稻作為物種，該分子標(biāo)記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5' — 3'，
[0020]AGPS2a-m 正向:TCTTCTTTTAGATCTTAAATTTCAGA
[0021]反向:CACATCAAAGTTGTAGTTTTGTGA。
[0022]本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記AGPS2a_m的開發(fā)方法，包括以下步驟:
[0023]I)、以粳稻品種日本晴作為低直鏈淀粉含量基因供體親本與作為高直鏈淀粉的特青進(jìn)行雜交、回交和自交，從而獲得作為后代的稻米低直鏈淀粉含量的單株；
[0024]2)、用 CTAB (十六烷基三乙基溴化銨，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取水稻親本幼苗及后代幼苗的基因組DNA ；
[0025]3)、采用Indel (插入/缺失片段,insertion/deletions)分子標(biāo)記方法進(jìn)行稻米低直鏈淀粉含量基因標(biāo)記的篩選；
[0026]4)、開發(fā)出一個(gè)Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m。
[0027]與稻米低直鏈淀粉含量有關(guān)的分子標(biāo)記AGPS2a_m，具體是用下述方法得到的:
[0028]I)、根據(jù)基因AGPS2a的核苷酸序列，設(shè)計(jì)、發(fā)展Indel分子標(biāo)記，用于檢測低直鏈淀粉含量日本晴和高直鏈淀粉含量特青的多態(tài)性；通過測序以進(jìn)一步確定引物AGPS2a-m區(qū)間的序列在低直鏈淀粉含量的日本晴和高直鏈淀粉含量的特青之間的差異；通過雜交、回交和自交結(jié)合標(biāo)記輔助選擇，獲得特青背景的低直鏈淀粉含量的水稻新種質(zhì)；
[0029]2)、用CTAB法提取水稻親本幼苗及后代幼苗的基因組DNA ；
[0030]3)、采用Indel分子標(biāo)記方法進(jìn)行稻米低直鏈淀粉含量的基因標(biāo)記篩選低直鏈淀粉含量的水稻新種質(zhì)；
[0031]4)、鑒定出一個(gè)Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m，經(jīng)多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)其與稻米直鏈淀粉
含量相關(guān)聯(lián)。
[0032]本發(fā)明還同時(shí)提供了上述分子標(biāo)記AGPS2a_m的用途，用于水稻稻米直鏈淀粉含量鑒定和/或其后代輔助選擇育種。
[0033]作為本發(fā)明的分子標(biāo)記AGPS2a_m的用途的改進(jìn):當(dāng)為日本晴和特青的后代時(shí)，選擇后代中帶型與日本晴帶型一致的單株用于育種改良。
[0034]采用Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m進(jìn)行稻米直鏈淀粉含量篩選的方法具體是:
[0035](I)、Indel標(biāo)記在高、低稻米直鏈淀粉含量品種日本晴和特青間的DNA多態(tài)性分析:
[0036]根據(jù)基因AGPS2a的核苷酸序列，設(shè)計(jì)、發(fā)展Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m,用于檢測低直鏈淀粉含量的日本晴和高直鏈淀粉含量的特青之間的多態(tài)性。引物委托上海申能博彩公司合成，在PTC-225PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為:20ng/ul水稻基因組DNAlul, 10XPCR Buffer2.0ul, 25mM MgCl2 2.0ul, 2mM dNTP2.0ul, IOuM 引物 2.0ul, 5U/ulTaq DNA聚合酶0.2ul，ddH2010.8ul，總體系20ul。反應(yīng)程序:95°C變性5分鐘；94°C變性I分鐘，55°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，40個(gè)循環(huán)；72°C補(bǔ)齊10分鐘；產(chǎn)物檢測:在含有0.5% ug/ul EB的4.0%的瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。
[0037](2) ,Indel標(biāo)記AGPS2a_m的序列區(qū)間在低、高稻米直鏈淀粉含量品種日本晴和特青間的基因組序列差異:
[0038]根據(jù)獲得的Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m，用于PCR擴(kuò)增低直鏈淀粉含量品種日本晴和高直鏈淀粉含量品種特青的基因組序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析。PCR擴(kuò)增參照上述(I)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物的回收選用北京百泰克生物技術(shù)有限公司開發(fā)的PCR產(chǎn)物回收試劑盒(離心柱型，目錄號:DP1403)。
[0039](3)、利用Indel標(biāo)記AGPS2a_m開展低直鏈淀粉含量的輔助選擇育種[0040]低直鏈淀粉含量的基因供體親本日本晴，與高直鏈淀粉含量的秈稻品種特青進(jìn)行雜交，通過回交、自交結(jié)合標(biāo)記輔助選擇，將日本晴的低直鏈淀粉含量基因AGPS2a導(dǎo)入到高直鏈淀粉含量的特青中，選擇分離群體中帶型與日本晴帶型一致的單株用于育種改良，獲得了若干份特青背景的帶日本晴AGPS2a基因的材料；收獲這些植株上所結(jié)的種子，檢測其直鏈淀粉含量，發(fā)現(xiàn)其直鏈淀粉含量顯著降低。
[0041]直鏈淀粉含量高是稻米品質(zhì)低劣的最主要因素。本發(fā)明采用分子生物學(xué)方法以低直鏈淀粉含量的日本晴為材料，發(fā)展和篩選新的、而且穩(wěn)定的能降低稻米直鏈淀粉含量的分子標(biāo)記及其方法，用于優(yōu)質(zhì)稻米的輔助選擇育種；由于研究所用的材料能有效降低一般稻米的直鏈淀粉含量，其對我國稻米品質(zhì)的改善具有普遍性。
[0042]本發(fā)明創(chuàng)造了稻米淀粉合成相關(guān)基因AGPS2a的Indel標(biāo)記AGPS2a_m。利用這種方法，不僅克服了常規(guī)育種方法所需時(shí)間周期長等缺點(diǎn)，可以有目標(biāo)地將日本晴的低直鏈淀粉含量基因AGPS2a在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)選擇獲得并有目的地進(jìn)行多個(gè)優(yōu)質(zhì)的聚合，從而培育出具有優(yōu)質(zhì)的水稻新品種。在本發(fā)明中，當(dāng)所得植株經(jīng)檢測出現(xiàn)日本晴的條帶時(shí)，我們判定其屬于低直鏈淀粉含量的水稻；當(dāng)所得植株經(jīng)檢測出現(xiàn)特青的條帶，我們判定其屬于高直鏈淀粉含量的水稻；當(dāng)所得植株經(jīng)檢測同時(shí)出現(xiàn)特青+日本晴的條帶時(shí)，我們判定其可能屬于高直鏈淀粉含量的水稻。
[0043]本發(fā)明可適用大部分的秈稻(如特青)和粳稻(如日本晴)之間的標(biāo)記選擇。
[0044]因此，本發(fā)明結(jié)果在水稻優(yōu)質(zhì)育種實(shí)踐中具有重要意義。其優(yōu)點(diǎn)具體歸納如下:
[0045](I)本發(fā)明的能調(diào)控稻米直鏈淀粉含量的分子標(biāo)記，是在通過低直鏈淀粉含量的粳稻日本晴與高直鏈淀粉含量的秈稻特青的雜交、回交、自交中篩選獲得的，能顯著降低稻米直鏈淀粉含量，而且穩(wěn)定存在，可用于優(yōu)質(zhì)稻米的輔助選擇育種。
[0046](2)本發(fā)明依據(jù)的是稻米淀粉合成基因AGPS2a的核苷酸序列發(fā)展而獲得的Indel分子標(biāo)記，極大提高了輔助選擇的效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0048]圖1是Indel標(biāo)記AGPS2a_m在低直鏈淀粉含量的粳稻日本晴、高直鏈淀粉含量的秈稻特青、Fl的電泳譜帶圖；
[0049]圖2是引物AGPS2a_m的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在日本晴和特青間的序列差異；
[0050]圖3是Indel標(biāo)記AGPS2a_m鑒定獲得的8份低直鏈淀粉含量日本晴和特青的后代的電泳譜帶圖；[0051 ] 圖4是標(biāo)記AGPS2a_m輔助選育的8份材料的直鏈淀粉含量；
[0052]對上述圖1~4中符號分別作如下說明:
[0053]1代表:低直鏈淀粉含量的粳稻日本晴；
[0054]2代表:高直鏈淀粉含量的秈稻特青；
[0055]3代表:日本晴/特青的Fl植株；
[0056]4，5，6，7，8，9，10，11均代表:日本晴和特青的后代，經(jīng)Indel標(biāo)記AGPS2a_m的篩
選后獲得。
【具體實(shí)施方式】
[0057]實(shí)施例1、用Indel標(biāo)記AGPS2a_m鑒定低直鏈淀粉含量的粳稻日本晴和高直鏈淀粉含量的秈稻特青的多態(tài)性
[0058]具體做法是:從中國水稻研究所種質(zhì)資源庫中選取水稻材料日本晴和特青，用日本晴和特青雜交獲得其Fl，利用引物AGPS2a-m鑒定其多態(tài)性(圖1)。
[0059]一、提取 DNA
[0060]1)、配制DNA提取緩沖液:
[0061]按順序依次加1 體積的 DNA 提取溶液(0.35M sorbitol; 0.1M Tris, pH8.2; 0.005MEDTA ;其余為水)，1體積的核裂解液(0.2M Tris, pH7.5;0.05M EDTA;2M NaCl;0.055MCTAB ;其余為水)和0.4體積的5% (質(zhì)量濃度)sarkosyl溶液(即十二酰-N-甲基甘氨酸鈉的水溶液);最后加入亞硫酸氫鈉，配制成DNA提取緩沖液；亞硫酸氫鈉在DNA提取緩沖液中的終濃度為0.02M。
[0062]上述DNA提取溶液的制備方法為:在0.35mol的sorbitol (山梨糖醇)、0.Imol的Tris (三羥甲基氨基甲烷，pH8.2),0.005mol的EDTA (乙二胺四乙酸)中加水定容至1L。
[0063]上述核裂解液的制備方法為:在0.2mol的Tris (三羥甲基氨基甲烷，pH7.5)、
0.05mol的EDTA (乙二胺四乙酸)、2mol的NaCl (氯化鈉)、0.055mol的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)中加水定容至1L。
[0064]2)、對上述日本晴、特青、Fl的水稻葉片分別進(jìn)行如下處理:
[0065]①、稱取0.1g的水稻葉片用液氮研磨成粉狀，然后加入700 μ 1的上述步驟I)配制的DNA提取緩沖液，65°C水浴40分鐘。再加700 μ 1的氯仿:異戊醇(24:1的體積比)，并混勻。10，OOOrpm離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
[0066]②、在上述步驟①離心后所得的上清液中加2/3~I倍體積預(yù)冷(至4°C)的異丙醇，輕輕混勻至DNA沉淀。13，OOOrpm離心8分鐘,倒出上清液。
[0067]③、再用70% (體積濃度)的已醇200 μ 1洗滌上述步驟②所得的DNA沉淀物。
[0068]④、將上述洗滌后的DNA晾干并溶于100 μ 1 TE緩沖液或純水中。
[0069]⑤、紫外分光光度法檢測上述步驟④所得的DNA樣品的濃度，0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。完整合適的DNA用于PCR擴(kuò)增，不完整的DNA則重新提取，直至獲得完整的DNA。
[0070]二、PCR 擴(kuò)增
[0071]1)、反應(yīng)體系:
[0072]水稻基因組DNA20ng/ulIul，10XPCR Buffer2.0ul,25mM MgCl2 2.0ul,2mMdNTP2.0ul，IOuM 引物各 1.0ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.2ul, ddH2010.8ul，總體系 20ul。
[0073]所述引物為:AGPS2a-m正向:TCTTCTTTTAGATCTTAAAITTCAGA
[0074]反向:CACATCAAAGTTGTAGTTTTGTGA。
[0075]2)、反應(yīng)程序:
[0076]95°C變性5分鐘；94°C變性I分鐘，55°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，40個(gè)循環(huán)；72°C補(bǔ)齊10分鐘。
[0077]三、電泳檢測
[0078]取擴(kuò)增產(chǎn)物20ul，用4.0 %的瓊脂糖凝膠(含有0.5% ug/ul EB)電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。如圖1所示。
[0079]在圖1中，日本晴為138bp的條帶，特青為143bp的條帶，“F1”為143bp+138bp的條帶。
[0080]根據(jù)圖1，我們能得出下述結(jié)論:Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m能夠檢測特青和日本晴之間的多態(tài)性，且日本晴的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段要小于特青，由此表明AGPS2a-m能用于特青和日本晴之間的分子檢測及其后代的標(biāo)記輔助選擇。
[0081]實(shí)施例2、用Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m鑒定低直鏈淀粉含量的粳稻日本晴和高直鏈淀粉含量的秈稻特青的序列差異
[0082]具體做法是:應(yīng)用Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m對日本晴和特青的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海英`駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，比較其序列的差異(圖2)。
[0083]一、提取 DNA
[0084]I )、配制DNA提取緩沖液:
[0085]同實(shí)施例1。
[0086]2)、對上述日本晴和特青的水稻葉片分別進(jìn)行如下處理:
[0087]同實(shí)施例1。
[0088]3) PCR 擴(kuò)增
[0089]同實(shí)施例1。
[0090]4 ) PCR產(chǎn)物的回收
[0091]PCR產(chǎn)物的回收選用北京百泰克生物技術(shù)有限公司開發(fā)的PCR產(chǎn)物回收試劑盒(離心柱型，目錄號:DP1403)，參照產(chǎn)品說明要求進(jìn)行，回收的PCR產(chǎn)物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。
[0092]根據(jù)圖2，我們能得出以下結(jié)論:日本晴和特青的AGPS2a_m擴(kuò)增產(chǎn)物存在5bp的堿基差異(如圖2中的下劃線所示)，這是我們能夠使用Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m檢測出其多態(tài)性的原因所在，也是我們能用于其后代標(biāo)記輔助選擇的遺傳基礎(chǔ)。
[0093]實(shí)施例3、利用Indel標(biāo)記AGPS2a_m開展低直鏈淀粉含量的輔助選擇育種
[0094]具體做法是:低直鏈淀粉含量的基因供體親本日本晴，與高直鏈淀粉含量的秈稻品種特青依次進(jìn)行雜交、回交和自交，對所得后代結(jié)合分子標(biāo)記AGPS2a-m的輔助選擇，選擇分離群體中帶型與日本晴帶型一致的單株用于育種改良。
[0095]一、提取 DNA
[0096]I)、配制DNA提取緩沖液:
[0097]同實(shí)施例1。[0098]2)、對上述日本晴、特青、所得后代的水稻葉片分別進(jìn)行如下處理:
[0099]同實(shí)施例1。
[0100]二、Indel 標(biāo)記檢測
[0101]I)、PCR 擴(kuò)增
[0102]同實(shí)施例1。
[0103]2)、電泳檢測
[0104]同實(shí)施例1。
[0105]三、Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m開展低直鏈淀粉含量的輔助選擇育種
[0106]低直鏈淀粉含量的基因供體粳稻品種日本晴與高直鏈淀粉含量的普通秈稻品種特青進(jìn)行雜交、回交和自交，結(jié)合分子標(biāo)記AGPS2a-m的輔助選擇,選擇分離群體中帶型與日本晴帶型一致的單株進(jìn)一步用于育種改良(圖3)，淘汰帶型與高直鏈淀粉含量特青的帶型一致和雜合帶型(同時(shí)具有日本晴和特青帶型)的個(gè)體，育種材料的稻米直鏈淀粉含量采用國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T15683-2008)進(jìn)行檢測。分析表明，所選擇的帶日本晴帶型的8個(gè)單株均比輪回親本特青明顯降低(圖4)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Indel標(biāo)記AGPS2a-m可以用于稻米直鏈淀粉含量的輔助選擇育種。
[0107]備注說明: [0108]圖3和圖4中的“4~11”均為日本晴和特青依次進(jìn)行雜交、回交和自交獲得的，且是選擇了 “帶型與日本晴帶型一致”的單株。
[0109]對比例1、利用Indel標(biāo)記AGPS2a_m判別稻米直鏈淀粉含量
[0110]具體做法是:將實(shí)施例3的步驟三中被淘汰的帶型與高直鏈淀粉含量特青的帶型一致和雜合帶型(同時(shí)具有日本晴和特青帶型)的個(gè)體繼續(xù)進(jìn)行種植，通過對其后代稻米籽粒直鏈淀粉含量的測定，進(jìn)一步分析分子標(biāo)記AGPS2a-m輔助選擇的可靠性。
[0111]一、提取 DNA
[0112]I)、配制DNA提取緩沖液:
[0113]同實(shí)施例1。
[0114]2)、對上述水稻葉片分別進(jìn)行如下處理:
[0115]同實(shí)施例1。
[0116]二、Indel 標(biāo)記檢測
[0117]I)、PCR 擴(kuò)增
[0118]同實(shí)施例1。
[0119]2)、電泳檢測
[0120]同實(shí)施例1。
[0121]三、Indel標(biāo)記AGPS2a_m判別稻米直鏈淀粉含量
[0122]隨機(jī)選擇了在實(shí)施例3的步驟三中被淘汰4個(gè)帶型與特青一致的單株繼續(xù)種植，經(jīng)Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m檢測,其后代均表現(xiàn)與特青一致的帶型,分別收獲這些單株籽粒并測定其直鏈淀粉含量。另外，隨機(jī)選擇其中I個(gè)雜合帶型(同時(shí)具有日本晴和特青帶型)的個(gè)體用于繼續(xù)種植，在其后代中隨機(jī)選取12個(gè)單株，Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m檢測表明，該12個(gè)單株中有3個(gè)單株表現(xiàn)特青帶型，6個(gè)單株表現(xiàn)雜合帶型，3個(gè)表現(xiàn)日本晴帶型，符合1:2:1的分離關(guān)系；待植株成熟后，分別收獲這些單株并測定其籽粒的直鏈淀粉含量。表I是這16個(gè)單株(株系)的稻米籽粒的直鏈淀粉含量，4個(gè)與特青帶型一致的單株均表現(xiàn)與特青類似的高直鏈淀粉含量；而在帶型雜合的12個(gè)后代單株中，有9個(gè)單株表現(xiàn)類似與特青的高直鏈淀粉含量(其中，3個(gè)單株的帶型表現(xiàn)特青帶型，6個(gè)單株的帶型表現(xiàn)雜合帶型)；3個(gè)呈日本晴帶型的單株，其直鏈淀粉含量顯著低于特青。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明=Indel分子標(biāo)記AGPS2a-m可以用于判別稻米直鏈淀粉含量。
[0123]表1.稻米直鏈淀粉含量及其對應(yīng)的基因型
【權(quán)利要求】
1.稻米直鏈淀粉含量微控基因AGPS2a的分子標(biāo)記AGPS2a_m，以水稻作為物種，其特征是:所述分子標(biāo)記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5' —3'， AGPS2a-m 正向:TCTTCTTTTAGATCTTAAATTTCAGA 反向:CACATCAAAGTTGTAGTTTTGTGA。
2.如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記AGPS2a-m的開發(fā)方法，其特征是包括以下步驟: 1)、以粳稻品種日本晴作為低直鏈淀粉含量基因供體親本與作為高直鏈淀粉含量的秈稻特青進(jìn)行雜交、回交和自交，從而獲得后代的稻米低直鏈淀粉含量的單株； 2)、用CTAB法提取水稻親本幼苗及后代幼苗的基因組DNA； 3)、采用Indel分子標(biāo)記方法進(jìn)行水稻稻米低直鏈淀粉含量分子標(biāo)記的篩選； 4)、鑒定出一個(gè)Indel分子標(biāo)記AGPS2a_m。
3.如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記AGPS2a-m的用途，其特征是:用于水稻稻米直鏈淀粉含量鑒定和/或其后代輔助選擇育種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記AGPS2a-m的用途，其特征是:當(dāng)為日本晴和特青的后代時(shí)，選擇后代中帶型與日本`晴帶型一致的單株用于育種。
【文檔編號】C12N15/10GK103602673SQ201310581339
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】曾大力, 錢前, 李家洋, 田志喜, 楊窯龍, 張光恒, 郭龍彪, 高振宇, 朱麗, 胡江, 董國軍, 胡興民, 顏美仙 申請人:中國水稻研究所