一種沙格列汀手性中間體的合成方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種來(lái)源于地芽孢桿菌的苯丙氨酸脫氫酶（PDH）突變體，其與野生型PDH相比具有提高的酶活力和熱穩(wěn)定性。還提供了一種利用本發(fā)明的PDH突變體催化合成沙格列汀手性中間體(S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基-1-金剛烷基-D-甘氨酸（Boc-HAG）的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，兩步反應(yīng)直接得到Boc-HAG，e.e.值超過(guò)99.9％，并且降低了副產(chǎn)物的產(chǎn)生，12小時(shí)即可達(dá)到95％的產(chǎn)率，大幅度縮短了催化時(shí)間，降低了能耗，簡(jiǎn)化了后處理過(guò)程。
【專利說(shuō)明】一種沙格列汀手性中間體的合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種沙格列汀關(guān)鍵手性中間體的合成方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]沙格列汀(saxagliptin)是由施貴寶和阿斯利康聯(lián)合開(kāi)發(fā)的一種高效、選擇性、競(jìng)爭(zhēng)性二肽基肽酶-1V (DPP-1V)抑制劑，于2009年被歐洲藥品管理局(EMA)和美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市,商品名為Onglyza,其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下:
[0003]
【權(quán)利要求】
1.一種來(lái)源于地芽孢桿菌(Geobacillus sp.)的苯丙氨酸脫氫酶(PDH)突變體,其特征在于，與野生型TOH相比，在氨基酸序列的第93和288位氨基酸殘基有取代突變，并具有提高的酶活力和/或熱穩(wěn)定性；其中，PDH氨基酸序列的編號(hào)以SEQ ID NO:1為基準(zhǔn)。
2.權(quán)利要求1所述的PDH突變體，其與野生型PDH相比，僅在氨基酸序列的第93和288位氨基酸殘基有取代突變。
3.權(quán)利要求1或2所述的PDH突變體，其氨基酸序列的第93和288位氨基酸殘基分別突變?yōu)榱涟彼?L)和纈氨酸(V)。
4.權(quán)利要求3所述的PDH突變體，其氨基酸序列的第93和288位氨基酸殘基的取代突變分別為I93L和L288V。
5.權(quán)利要求1所述的PDH突變體，其還在氨基酸序列的第75、184和301位氨基酸殘基有取代突變。
6.權(quán)利要求5所述的PDH突變體，其與野生型PDH相比，僅在氨基酸序列的第75、93、184,288和301位氨基酸殘基有取代突變。
7.權(quán)利要求5或6所述的PDH突變體，其氨基酸序列的第75、93、184、288和301位氨基酸殘基分別突變?yōu)楸彼?A)、亮氨酸(L)、谷氨酸(E)、纈氨酸(V)和絲氨酸(S)。
8.權(quán)利要求7所述的PDH突變體，其氨基酸序列的第75、93、184、288和301位氨基酸殘基的取代突變分別為M75A、I93L、K184E、L288V和V301S。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的PDH突變體，其中，所述地芽孢桿菌為Geobacillussp.Y412MC61。
10.權(quán)利要求9所述的`PDH突變體，其中，所述野生型PDH的氨基酸序列如SEQID NO:I所示。
11.權(quán)利要求10所述的PDH突變體，其氨基酸序列如SEQID NO:5或6所示。
12.編碼權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的I3DH突變體的核酸分子。
13.包含權(quán)利要求12所述的核酸分子的載體。
14.權(quán)利要求13所述的載體，其為pET21a載體。
15.包含權(quán)利要求13或14所述的載體的宿主細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其為大腸桿菌。
17.權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞，其為大腸桿菌BL21(DE3)。
18.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的PDH突變體或權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞在合成(S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基-1-金剛烷基-D-甘氨酸(Boc-HAG)中的用途。
19.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的PDH突變體或權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞在合成沙格列汀中的用途。
20.一種合成(S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基-1-金剛烷基-D-甘氨酸(Boc-HAG)的方法，包括以下步驟: (1)在還原型輔酶I(NADH)的存在下，用權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的PDH突變體催化酮酸底物2- (3-羥基-1-金剛烷基)-2-乙醛酸還原氨化得到S-型的氨基酸(S) - (3-羥基-1-金剛烷基)-D-甘氨酸(HAG)； (2)在甲酸銨存在下，甲酸脫氫酶(FDH)使NADH再生； (3)HAG上引入叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)基得到Boc-HAG。
21.權(quán)利要求20所述的方法,其中，所述FDH來(lái)源于畢赤氏酵母(Pichiapastoris)。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述FDH的氨基酸序列如SEQID NO:7所示。
23.權(quán)利要求20-22任一項(xiàng)所述的方法，其中，催化反應(yīng)在30°C，40rpm下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為20小時(shí)。
24.一種合成沙格列汀的方法，包括使用權(quán)利要求20-23任一項(xiàng)所述的方法合成手性中間體(S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基-1-金剛烷基-D-甘氨酸(Boc-HAG)。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103555683SQ201310586363
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】羅煜, 丁時(shí)誠(chéng), 瞿旭東 申請(qǐng)人:南京博優(yōu)康遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司