病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測新城疫病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法，根據(jù)新城疫病毒基因序列，在6997到7092之間的位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針；根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)片段的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)內(nèi)標(biāo)探針序列。上述特異性引物的上游引物序列為：tgcagagatc?actcacactc?at；上述特異性引物的下游引物序列為：gatggaacgc?agagtagaaa?ag；上述TaqMan；探針的目標(biāo)探針序列為：FAM-cctgttgcag?atgtccggagcac-BHQ1;上述TaqMan探針的內(nèi)標(biāo)探針序列為：VIC-gctcattcgg?ctcgacgggc?aat-BHQ2。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，應(yīng)用于臨床，能在3小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)確的對(duì)新城疫進(jìn)行診斷，為動(dòng)物疫病治療方案的制定提供依據(jù)，提高科學(xué)養(yǎng)殖水平。
【專利說明】病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸診斷技術(shù)是對(duì)新城疫病毒進(jìn)行確診最有效的手段，目前主要采用普通RT-PCR和熒光RT-PCR技術(shù)，普通RT-PCR方法雖能夠?qū)π鲁且卟《具M(jìn)行檢測，但存在檢測過程繁瑣、易造成假陽性、假陰性、污染嚴(yán)重等問題；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)以重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單、所需時(shí)間短、無污染等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各種病原的快速檢測。因熒光RT-PCR檢測技術(shù)要求高，試劑容易失效，加上檢測新城疫所用雙拭子或組織樣本成分復(fù)雜，一些樣本中可能含有抑制RT-PCR擴(kuò)增的物質(zhì)，造成檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性，采用病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)監(jiān)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，能有效控制假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法。
[0004]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
[0005]一種病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法，根據(jù)新城疫病毒基因序列，在6997到7092之間的位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針；根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)片段的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)內(nèi)標(biāo)探針序列。
[0006]上述特異性引物的上游引物序列為:tgcagagatc actcacactc at
[0007]上述特異性引物的下游引物序列為:gatggaacgc agagtagaaa ag
[0008] 上述TaqMan 探針的目標(biāo)探針序列為:FAM-cctgttgcag atgtccggagcac-BHQl;
[0009] 上述TaqMan 探針的內(nèi)標(biāo)探針序列為:VIC-gctcattcgg ctcgacgggcaat_BHQ2。
[0010]通過人工合成、克隆、表達(dá)過程制備了監(jiān)控提取和反應(yīng)的病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)，所制備的內(nèi)標(biāo)序列包含新城疫引物識(shí)別序列和特有的內(nèi)標(biāo)探針識(shí)別序列，內(nèi)標(biāo)突光報(bào)告基團(tuán)用VIC標(biāo)記，可對(duì)檢測進(jìn)行全過程監(jiān)控，有效防止假陰性出現(xiàn)。
[0011]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供了一種快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、能監(jiān)控整個(gè)檢測過程的新城疫檢測方法，應(yīng)用于臨床，能在3小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)確的對(duì)新城疫進(jìn)行診斷，為動(dòng)物疫病治療方案的制定提供依據(jù)，提高科學(xué)養(yǎng)殖水平。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面根據(jù)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0013]實(shí)施案例:
[0014]具體設(shè)計(jì)與操作步驟:
[0015]1、檢測用引物與探針的設(shè)計(jì)[0016]根據(jù)新城疫基因全序列，設(shè)計(jì)上、下游引物和目標(biāo)探針序列；根據(jù)目標(biāo)探針序列，設(shè)計(jì)內(nèi)標(biāo)探針序列如下:特異性引物的上游引物序列為:tgcagagatc actcacactc at
[0017]特異性引物的下游引物序列為:gatggaacgc agagtagaaa ag
[0018]TaqMan 探針的目標(biāo)探針序列為:FAM_cctgttgcag atgtccggagcac-BHQl;
[0019]TaqMan 探針的內(nèi)標(biāo)探針序列為:VIC-gctcattcgg ctcgacgggcaat_BHQ2。
[0020]2、病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)的制備
[0021](1)MS2噬菌體包裹蛋白基因片段的擴(kuò)增。MS2上游引物序列為:atggatcctgggaccccttt cggggtcctg ct, MS2 下游引物序列為:gcaagctttc aatacataaa gagttgaacttct,擴(kuò)增片段長度為1798bp，引物首尾分別含有BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)。以MS2噬菌體RNA為模板，一步法RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠電泳和雙酶切鑒定。
[0022](2)PET-32a_MS2重組質(zhì)粒的構(gòu)建。將以上擴(kuò)增產(chǎn)物純化，純化產(chǎn)物和PET_32a載體雙酶切后，再用DNase Ligase連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，采用雙酶切和PCR篩選陽性質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒PET-32a-MS2。
[0023](3)內(nèi)標(biāo)片段的合成與PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的內(nèi)標(biāo)片段包括Hind III和Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)、上游引物序列、下游引物互補(bǔ)序列、內(nèi)標(biāo)探針序列。先分段化學(xué)合成內(nèi)標(biāo)片段，每段78bp，每片段首尾之間存在互補(bǔ)區(qū)域，采用Klenow酶對(duì)所合成的片段進(jìn)行連接，再采用以下兩條引物下兩條引物擴(kuò)增:引物1:gcaagctttg cagagatcac tcaca引物2:cagcggccgcgatggaacgc agagt ;對(duì)？0?擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化,獲得99bp的內(nèi)標(biāo)片段序列如下:gcaagctttgcagagatcac tcacactcat cgttagctca ttcggctcga cgggcaatcg attgccctct tttctctctgcgttccatcg cggccgctgo
[0024](4)內(nèi)標(biāo)片段的克隆。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化，純化產(chǎn)物和PET-32a_MS2重組質(zhì)粒分別采用Hind III和Not I雙酶切，再用DNase Ligase連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，采用雙酶切和PCR篩選陽性質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒PET-32a-MS2-1C。
[0025] (5)重組質(zhì)粒PET-32a-MS2_IC的原核表達(dá)。挑取重組菌(含重組質(zhì)粒PET32a-MS2-1C)的一個(gè)單菌落，接入2mL含Amp (100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)過夜；取500 u L過夜培養(yǎng)物接入50mL含Amp (100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2.0h至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長期；在培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0mmol/L, 37°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)；誘導(dǎo)16h后取出。
[0026](6)原核表達(dá)產(chǎn)物的前處理。將誘導(dǎo)后的菌液移至IOml離心管，5000rpm收集菌體，每 IOml 菌液用 3mlPBS 和 3ml DNase Buffer (IOmMTris-HCl; 2.5mM MgCl2; 0.5mMCaCl2)各懸浮清洗一次，最后用ImlDNase Buffer懸浮菌體；將懸浮菌于_80°C反復(fù)凍融三次,按10ug/ulRNase量對(duì)凍融物進(jìn)行37°C消化2h，12000rpm離心5min，取上清；將上清分裝，按IOOul/管進(jìn)行分裝，每管加入5U的DNase于37°C條件下消化3h。
[0027](7)病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)耐核酸酶的鑒定。取IOul以上用DNase消化后的上清，補(bǔ)水至IOOul，采用Trizol經(jīng)典法提取核酸，熒光RT-PCR檢測提取產(chǎn)物(反應(yīng)體系為25yL，上游引物濃度為0.25 u M,下游引物濃度為0.30 u M，內(nèi)標(biāo)探針濃度0.20 u M,內(nèi)標(biāo)探針濃度為0.20 ii M，dNTP濃度為0.30mM, Mg+濃度5mM，RNA溶解液10 y L ;反應(yīng)條件為:反應(yīng)程序?yàn)?52°C 25min,95°C 3min ；95°C 5sec，62°C 45sec，在 62°C 時(shí)設(shè)定 VIC 熒光信號(hào)，40 個(gè)循環(huán))。分別設(shè)加AMV和不加AMV的對(duì)照，用以檢測DNA和RNA的含量，檢測結(jié)果表明耐核酸酶病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)的制備成功。
[0028] 3、病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測新城疫病毒具體操作
[0029](I)核酸提取。將咽喉拭子或泄殖腔拭子置于500 ULPBS液內(nèi)(含青霉素1000IU/mL，鏈霉素1000IU/mL)30min，2000rpm離心lOmin，取190 u L以上經(jīng)過處理的上清液和前處理過的內(nèi)標(biāo)液10 u L，加入600 u LTrizol裂解液，用移液器反復(fù)吹打混勻5_10次，靜置裂解5min ;加入200 u L氯仿,震蕩混勻15秒,靜置2min, 12000rpm, 4°C條件下離心IOmin ;吸取上清于一新的離心管中，加入等體積于_20°C已經(jīng)預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻10次，置-20°C條件下冷卻lOmin, 12000rpm, 4°C條件下離心IOmin ;吸棄上清,加入500 u L75%的乙醇,顛倒洗漆；5000rpm,4°C條件下離心5min,棄上清,室溫干燥3min。加入30 u LTE溶解RNA。
[0030](2)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25iiL，上游引物濃度為0.30UM，下游引物濃度為
0.35 u M，目標(biāo)探針濃度0.22 u M,內(nèi)標(biāo)探針濃度為0.18 u M，dNTP濃度為0.35mM, Mg+濃度6mM，RNA 溶解液 10 y L ;反應(yīng)條件為:52°C 25min,95°C 3min ；95°C 5sec，62°C 45sec，在 62°C時(shí)設(shè)定檢測FAM和VIC熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。
[0031](3)檢測結(jié)果判斷。根據(jù)儀器軟件判定結(jié)果。
[0032]上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本
【發(fā)明內(nèi)容】
并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測新城疫病毒的方法，其特征在于，根據(jù)新城疫病毒基因序列，在6997到7092之間的位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針；根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)片段的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)內(nèi)標(biāo)探針序列。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103602760SQ201310594028
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】趙宏波, 陳幫照 申請人:安徽華衛(wèi)集團(tuán)禽業(yè)有限公司